پاسخ های بیوشیمیایی و هیستوپاتولوژیک بیومفالاریا الکساندرینا به RIPEX (تنظیم کننده رشد گیاه)Ⅰ

خلاصه

زمینه

تنظیم کننده های رشد گیاهی به طور گسترده در کشاورزی برای افزایش رشد و رسیدن گیاهان استفاده می شود، اما اکوسیستم آبی را به خطر می اندازد. مطالعه حاضر اثر قرار گرفتن در معرض کشنده RIPEX 48 درصد غلظت EC (8 و 16 میکرولیتر در لیتر) را بر پارامترهای استرس اکسیداتیو، هورمون‌های جنسی، آنزیم‌های پتانسیل ایمنی، تعداد مختلف هموسیت‌ها، و هیستوپاتولوژی غدد گوارشی و بیضه تخمدان را ارزیابی کرد. حلزون های بیومفالاریا الکساندرینا.

برای تستوسترون گیاه دارویی سیستانچ را کلیک کنید

نتایج

قرار گرفتن در معرض RIPEX باعث افزایش کلی در فعالیت های سوپراکسید دیسموتاز و گلوتاتیون-S-ترانسفراز در B. Alexandrina شد. با این حال، قرار گرفتن در معرض شدید RIPEX فعالیت SOD را در حلزون ها مهار می کند. فعالیت مالون دی آلدئید افزایش در B. Alexandrina در معرض هر دو غلظت پس از تمام دوره های قرار گرفتن نشان داد. RIPEX همچنین باعث افزایش قابل توجه تستوسترون در حلزون هایی شد که در معرض 16 میکرولیتر در لیتر بودند، با این حال، سطح هورمون را در حلزون هایی که در 7 روز در معرض 8 میکرولیتر در لیتر بودند کاهش داد. در مورد استرادیول، پس از 3 روز قرار گرفتن در معرض 16 میکرولیتر در لیتر و 7 روز قرار گرفتن در معرض 8 میکرولیتر در لیتر افزایش معنی داری مشاهده شد. قرار گرفتن در معرض RIPEX همچنین باعث افزایش فعالیت آنزیم های میلوپراکسیداز و آدنوزین دآمیناز در غدد گوارشی حلزون ها شد. این تعداد کل هموسیت حلزون های در معرض و همچنین تعداد گرانولوسیت ها را افزایش داد. غدد گوارشی حلزون و تخمدان پس از 7 روز قرار گرفتن در معرض RIPEX تغییرات پاتولوژیک را نشان دادند.

نتیجه گیری

این یافته ها نشان می دهد که RIPEX برای B. Alexandrina سمی است و این حلزون می تواند به عنوان یک شاخص زیستی برای آلودگی محیطی با تنظیم کننده های رشد گیاه استفاده شود.

کلید واژه ها

بیومفالاریا الکساندرینا، RIPEX، تستوسترون، استرادیول، میلوپراکسیداز، آدنوزین دآمیناز، هیستوپاتولوژی

1. پس زمینه

آلودگی شیمیایی آگروشیمیایی آب های سطحی یک نگرانی رو به رشد زیست محیطی جهانی است، به ویژه در مناطقی که کشاورزی به سرعت در حال گسترش و تشدید است. مواد شیمیایی مصنوعی مختلف، مانند آفت کش ها یا کودها، برای اصلاح کمیت و کیفیت محصول برای برآوردن نیازهای مشتریان استفاده می شود [7، 40]. محرک های رشد گیاهی مواد شیمیایی رایج در بسیاری از کشورها هستند [18].

هنگامی که این مواد شیمیایی مستقیماً استنشاق می‌شوند یا با سبزیجات آلوده مصرف می‌شوند، به سلامت انسان آسیب می‌رسانند [39]. آفت کش ارگانوفسفره، اتفون (2-کلرواتیل فسفونیک اسید) یک ماده شیمیایی مصنوعی آزاد کننده اتیلن است که معمولاً به عنوان تنظیم کننده رشد گیاه (PGR) برای ترویج القای مرغ، رسیدن میوه و سایر واکنش های فیزیولوژیکی استفاده می شود. این ماده برای استفاده در انواع مواد غذایی، خوراک، غیرخوراکی، مهدکودک گلخانه ای و گیاهان زینتی که در فضای باز رشد می کنند تایید شده است [3، 50]. ارزیابی آزمایشگاهی سمیت اتفون نشان داد که اتفون ناهنجاری‌های مورفومتریک آنتن دوم، موهای حسی، ستون فقرات دم و منبر دافنیا مگنا را القا می‌کند که منجر به از دست دادن عملکرد و مرگ می‌شود [54].

عبدالعظیم [1] پس از قرار گرفتن در معرض اتفون، کاهش سرعت رشد، آسیب DNA و اثرات آپوپتوز را در سلول های غدد گوارشی حلزون Deroceras reticulatum ثبت کرد. بسیاری از نویسندگان سمیت اتفون را روی موش ها و پرندگان تایید کردند [2، 17، 55]. علاوه بر این، قرار گرفتن در معرض اتفون باعث ایجاد سمیت ژنتیکی، استرس اکسیداتیو و سمیت تولید مثلی در موش ها شد [16]. تراتوژنیسیته و اختلال عملکرد سیستم غدد جنسی در موش نیز با قرار گرفتن در معرض اتفون مرتبط است [2، 16]. همچنین نشان داده شده است که اتفون ایمونوتوکسیک است، اثرات جهش زایی دارد [26]، استرس اکسیداتیو را افزایش می دهد و غلظت اسیدهای دئوکسی ریبونوکلئیک و ریبونوکلئیک را کاهش می دهد [4].

اتفون موجود در آب ممکن است جانوران آبزی را به خطر بیندازد. با این حال، اطلاعات در مورد تاثیر آن بر موجودات آبزی کمیاب است. چندین گونه آبزی برای شناسایی هورمون های رشد گیاهی در سیستم های آبی استفاده شده است. با این حال، دستکاری و نگهداری برخی از این ارگانیسم ها در آزمایشگاه چالش برانگیز است و استفاده از آنها در ارزیابی های اکوتوکسیکولوژیکی را دشوارتر می کند [54]. نرم تنان آبزی، از جمله حلزون ها، اخیراً به دلیل نیاز به توسعه مدل های بی مهرگان برای پایش محیطی آلاینده های آبزی، به عنوان موجودات آزمایشی مورد توجه قرار گرفته اند [21، 45]. حلزون ها فراوان ترین گروه نرم تنان در سیستم های آبی هستند. حلزون ها جایگزین کمتری برای مهره داران عالی به عنوان شاخص های زیستی ارائه می دهند، زیرا می توانند در انواع آزمایش ها بدون کسب تاییدیه اخلاقی مورد استفاده قرار گیرند، و خرید و نگهداری آنها ارزان است [13].

از این نظر، حلزون Biomphalaria alexandrina به طور گسترده ای به عنوان ارگانیسم شاخص آلودگی آب شیرین با آفت کش ها استفاده شده است [29، 30]. این حلزون فراتر از پتانسیل خود به عنوان یک شاخص زیستی، به عنوان میزبان میانی برای انتقال شیستوزوما مانسونی عمل می کند [35]. بنابراین، غلظت‌های آگروشیمیایی در محیط می‌تواند بر انتقال شیستوزومیازیس از طریق تأثیرات مستقیم و غیرمستقیم بر تراکم میزبان میانی و انگل تأثیر بگذارد [27]. تحقیق حاضر با هدف بررسی تأثیر قرار گرفتن در معرض کشنده با تنظیم‌کننده رشد گیاه، RIPEX 48 درصد EC (نام تجاری اتفون، 2-کلرواتیل فسفونیک اسید) بر جنبه‌های مختلف بیوشیمیایی، ایمونولوژیکی و بافت‌شناسی B. alexandrina انجام شد. حلزون ها به عنوان یک ارگانیسم شاخص زیستی

2 روش

2.1 ارگانیسم آزمایش

حلزون های Biomphalaria alexandrina از دریاچه Manzalah واقع در El-Matareya، استان Dakahlia، مصر (31 درجه 11 'N 32 درجه 2' E) جمع آوری شدند و در آب لوله کشی خوب با دمای ثابت 20 درجه نگهداری شدند. روزانه با برگ های تازه کاهو تغذیه می شدند. پس از نگهداری به مدت 4 هفته در شرایط آزمایشگاهی، از حلزون های بالغ سالم (قطر پوسته 10-12 میلی متر) در آزمایش های بعدی استفاده شد.

2.2 مواد آزمایشی و شرایط قرار گرفتن در معرض

تنظیم کننده رشد گیاه، RIPEX (یک فرم محلول حاوی 48 درصد اتفون [2- کلرواتیل فسفونیک اسید (C2H6ClO3P)] و 52 درصد مواد بی اثر) از صنایع Chema (شهر نوباریا، بحیرا، مصر؛ مجوز ثبت شماره) خریداری شد. 1840). یک سری غلظت تهیه شد. ماکت های درخت با ده حلزون هر کدام در معرض دید قرار گرفتند. پس از 1-روز قرار گرفتن در معرض، حلزون‌های مرده شمارش و حذف شدند و LC50 و LC90 توسط نرم‌افزار آماری علوم اجتماعی (SPSS؛ IBM Corp. Armonk، نیویورک، ایالات متحده آمریکا) محاسبه شدند.

2.3 طراحی آزمایشی

دو غلظت زیر کشنده نشان دهنده LC10 و LC20 استفاده شد (8 و 16 μL/L). 90 حلزون به سه گروه تقسیم شدند، هر گروه با سه تکرار (ده حلزون/تکرار): گروه شاهد، گروه در معرض 8 میکرولیتر در لیتر، و گروه در معرض 16 میکرولیتر در لیتر. در فواصل زمانی 1-، 3- و 7-روزه، بیومارکرهای استرس اکسیداتیو و آنزیم‌های پتانسیل ایمنی در غده گوارشی ارزیابی شدند. هورمون های استروئیدی در Ovotestis بررسی شد. شمارش افتراقی هموسیت، و بافت شناسی غدد گوارشی و تخمک بررسی شد. برای بررسی های بیوشیمیایی، 0.5 گرم از بافت (غدد گوارشی یا تخمدان) از هر گروه در 0.5 میلی لیتر بافر فسفات (pH 6.5) با استفاده از هموژنایزر شیشه ای همگن شده و در دمای 10،{19}}×g، 4 درجه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. . سوپرناتانت های حاصل برای سنجش های بعدی مورد استفاده قرار گرفتند.

2.4 تعیین نشانگرهای استرس اکسیداتیو

2.4.1 سوپراکسید دیسموتاز (SOD، EC 1.15.1.1)

فعالیت SOD با استفاده از کیت سنجش سوپراکسید دیسموتاز EnzyChrom™ (شماره گربه: ESOD{{0}}؛ BioAssay Systems، Hayward، CA، USA) مطابق دستورالعمل سازنده تعیین شد. هموژنه بافت با استفاده از بافر لیز سرد (5{4}} میلی‌مولار پتاسیم فسفات، 0.1 میلی‌مولار EDTA، و 0.5 درصد تریتون ایکس-100) در 12،{8}} گرم به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتریفیوژ شد. و مایع رویی برای تعیین SOD جمع آوری شد [43]. فعالیت SOD در چگالی نوری (OD) در 440 نانومتر اندازه‌گیری شد.

2.4.2 گلوتاتیون-S-ترانسفراز (GST, EC 2.5.1.18)

آنزیم این ترکیب GSH را با {{0}}کلرو-2،4-دی‌نیتروبنزن (CDNB) کاتالیز می‌کند. در طول موج 340 نانومتر به روش اسپکتروفتومتری اندازه گیری می شود. مخلوط واکنش شامل بافر فسفات پتاسیم 0.1 مولار، pH 6.5، GSH محلول در بافر فسفات پتاسیم (140 میلی گرم در 100 میلی لیتر)، و CDNB 4 میلی گرم در میلی لیتر در الکل اتیلیک است. یک واحد فعالیت آنزیم به عنوان مقدار آنزیمی است که تشکیل 1 میکرومول S-conjugate را در دقیقه کاتالیز می کند [11].

2.4.3 مالون دی آلدئید (MDA)

مالون دی‌آلدئید در هموژنه‌های کامل به عنوان مواد واکنش‌دهنده اسید تیوباربیتوریک (TBARS) طبق روش استاندارد Ohkawa و همکاران تعیین شد. [37]. مخلوط واکنش شامل 0.1 میلی‌لیتر هموژنه بافت، حجم مساوی محلول دودسیل سولفات سدیم، 0}.75 میلی‌لیتر اسید استیک، 0}.75 میلی‌لیتر تیوباربیتوریک اسید، و 0.3 میلی لیتر آب مقطر. این اجزا در یک گرداب مخلوط شده و در یک حمام آب جوش به مدت 1 ساعت انکوبه شدند و سپس تا دمای اتاق خنک شدند. ده 0.5 میلی‌لیتر آب مقطر و 2.5 میلی‌لیتر n-بوتانول به هر لوله اضافه شد و به شدت با یک گرداب مخلوط شد و سپس در یک سانتریفیوژ با 2500×g به مدت 10 دقیقه چرخانده شد. جذب در 532 نانومتر خوانده شد.

2.5 تعیین هورمون

2.5.1 تستوسترون

تستوسترون با استفاده از کیت سنجش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم تستوسترون (ELISA) تعیین شد (شماره گربه: ADI-900-065؛ Enzo Life Sciences، NY، USA)، تستوسترون آندروژن اصلی است که رشد جنسی اولیه و ثانویه را تحت تأثیر قرار می دهد. میل جنسی 100 میکرولیتر رقیق کننده استاندارد (بافر سنجش 3 یا محیط کشت بافت) به چاهک اتصال غیر اختصاصی و حداکثر اتصال (0 pg/mL استاندارد) پیپت شد. پس از آن 100 میکرولیتر از استاندارد شماره 1 تا 5 را در چاهک مناسب قرار دهید. نمونه (100 میکرولیتر) به چاهک مناسب و 50 میکرولیتر از بافر سنجش 3 به داخل چاهک های اتصال غیر اختصاصی پیپت شد. همچنین، 50 میکرولیتر آنتی بادی زرد به هر چاهک به جز چاهک‌های خالی، فعالیت کل و چاهک‌های اتصال غیراختصاصی اضافه شد. انکوباسیون پلیت در دمای اتاق روی شیکر بشقاب به مدت 1 ساعت با دور 500. پس از آن، 50 میکرولیتر از مزدوج آبی به هر چاهک به جز فعالیت کل و چاه های خالی اضافه شد. پس از تخلیه چاه ها از محتویات، شستشو با افزودن 400 میکرولیتر محلول شستشو به هر چاهک 3 بار انجام شد. کونژوگه آبی (5 میکرولیتر) به کل چاهکهای فعالیت اضافه شد و 200 میکرولیتر از محلول p-نیتروفنیل فسفات به هر چاهک اضافه شد و در دمای 37 درجه به مدت 1 ساعت بدون تکان دادن انکوبه شد. خواندن صفحه در 405 نانومتر پس از افزودن 50 میکرولیتر محلول توقف به هر چاهک انجام شد [12، 48].

2.5.2 استرادیول

استرادیول با استفاده از کیت ELIZA استرادیول (Cat. No: 501890; Cayman Chemical, Michigan, USA) طبق پروتکل های سازنده تعیین شد. اصل این واکنش بر این اساس است که غلظت ردیاب استیل کولین استراز (AChE) استرادیول ثابت است، اما غلظت استرادیول بومی متفاوت است بنابراین مقدار ردیاب استرادیول استیل کولین استراز (AChE) که به آنتی سرم استرادیول متصل می شود با غلظت استرادیول بومی نسبت معکوس دارد. در چاه. 100 میکرولیتر بافر ELISA به چاهک های اتصال غیر اختصاصی و حداکثر اتصال اضافه شد. افزودن 50 میکرولیتر از لوله شماره 8 به هر دو چاهک استاندارد (استاندارد 8) و 50 میکرولیتر از لوله شماره 7 به هر یک از چاه های استاندارد بعدی (استاندارد 7). یک نمونه (50 میکرولیتر) به هر چاهک اضافه شد. استرادیول AChE Tracer (50 میکرولیتر) به هر فعالیت کل و چاه های خالی اضافه شد. پس از آن آنتی سرم ELISA استرادیول (50 میکرولیتر) به هر چاهک به جز فعالیت کل، اتصال غیر اختصاصی و چاهک های خالی اضافه شد. پس از انکوباسیون شیکر مداری (2 ساعت در دمای اتاق)، جذب در 414 نانومتر اندازه‌گیری شد [52].

2.6 تعیین آنزیم های بالقوه ایمنی

2.6.1 میلوپراکسیداز (MPO، EC 1.11.2.2)

یک واحد فعالیت MPO به‌عنوان مقدار آنزیمی که بستر را هیدرولیز می‌کند و تورین کلرامین تولید می‌کند تا 1.{1}} میکرومول TNB در دقیقه در دمای 25 درجه مصرف کند، تعریف می‌شود. MPO با استفاده از کیت سنجش فعالیت رنگ سنجی میلوپراکسیداز (شماره گربه: MAK068؛ Sigma-Aldrich، MO، USA) تعیین شد. جذب در طول موج 412 نانومتر اندازه گیری شد.

2.6.2 آدنوزین دآمیناز (ADA, EC 3.5.4.4)

ADA آنزیمی است که تبدیل آدنوزین و 2'-دئوکسی آدنوزین به اینوزین و 2'-دئوکسی آدنوزین را کاتالیز می کند. ADA با توجه به اصول کیت سنجش فعالیت آدنوزین دآمیناز بولتن فنی (شماره گربه: MAK400؛ Merck KGaA، دارمشتات، آلمان) تعیین شد. یک واحد آدنوزین دآمیناز مقدار آنزیمی است که آدنوزین را هیدرولیز می کند تا 1.0 میکرومول اینوزین در دقیقه در دمای 37 درجه تولید کند. معرف ها عبارتند از بافر سنجش 1×ADA (41 میکرولیتر)، مبدل ADA (2 میکرولیتر)، توسعه دهنده ADA (2 میکرولیتر)، و بستر ADA (5 میکرولیتر).

2.7 شمارش افتراقی هموسیت ها

طبق گفته Sminia [47] همولنف از حلزون (شاهد، در معرض) جمع آوری شد. حلزون پس از لمس شدن روی سر و پا توسط پیپت پاستور، مجبور شد تا عمیقاً در پوسته خود جمع شود و همولنف را بیرون بکشد، که برای شمارش افتراقی هموسیت جمع آوری شد. همولنف برای پخش روی لام میکروسکوپ آغشته شد. پس از تثبیت در متانول 99.8 درصد به مدت 5 دقیقه، لام با زاویه 45 درجه برای خشک شدن در دمای اتاق چرخانده شد و به مدت 20 دقیقه با رنگ آمیزی گیمسا رنگ آمیزی شد. تمایز هموسیت ها متناسب با شمارش 100 تعیین شد.

2.8 بررسی های بافت شناسی

معاینات بافت شناسی پس از 7 روز قرار گرفتن در معرض 8 و 16 میکرولیتر بر لیتر RIPEX انجام شد. غدد گوارشی و تخمدان جدا شده و بلافاصله در مایع Bouin᾿s ثابت شدند. پس از 1 روز تثبیت، نمونه ها از طریق یک سری الکل ها آبگیری شدند و در زایلن پاکسازی شدند. بلوک های موم پارافین ساخته شد [42]. ده فرقه (ضخامت 5-7 میکرومتر) برش داده شد و با هماتوکسیلین و ائوزین (Mayer's H و E) رنگ آمیزی شد. رنگ آمیزی با شستشوی خوب با آب لوله دنبال شد. بخش‌های بافت‌شناسی با استفاده از دوربین عکاسی خودکار (اپتیکا، ایتالیا) عکس‌برداری شد.

2.9 تجزیه و تحلیل آماری

داده ها به صورت میانگین ± انحراف استاندارد بیان شد و توسط نرم افزار آماری علوم اجتماعی (SPSS؛ IBM Corp. Armonk, NY, USA) تجزیه و تحلیل شد. از آنالیز واریانس دو طرفه ANOVA برای شناسایی تفاوت‌های بین گروه کنترل و در معرض، بین غلظت‌های مختلف و نقاط زمانی قرار گرفتن در معرض استفاده شد. سطح معنی داری p کمتر یا مساوی 05.05 0 تعیین شد.

مکانیسم سیستانچ اثر تستوسترون را افزایش می دهد

مشخص شده است که سیستانچ به روش های مختلفی باعث افزایش سطح تستوسترون می شود. اولاً، حاوی ترکیباتی به نام اکیناکوزید و اکتئوزید است که نشان داده شده است که تولید هورمون لوتئینیزه کننده (LH) در غده هیپوفیز را افزایش می دهد. LH سلول های لیدیگ در بیضه ها را برای تولید تستوسترون تحریک می کند. سیستانچ همچنین حاوی پلی ساکاریدها و گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی است که خواص آنتی اکسیدانی و ضد التهابی دارند. این می تواند به کاهش استرس اکسیداتیو و التهاب در بیضه ها کمک کند، که می تواند تولید تستوسترون را مختل کند. علاوه بر این، سیستانچ بیان ژن های دخیل در سنتز تستوسترون را افزایش می دهد و فعالیت آنزیم هایی که تستوسترون را تجزیه می کنند، کاهش می دهد، مانند {{1} آلفا ردوکتاز. به طور کلی، تصور می‌شود که ترکیبی از این مکانیسم‌ها به اثرات افزایش تستوسترون Cistanche کمک می‌کند.

هدی ح. عبدالعظیم1*، عزه ح. محمد1 و محمد ر. حبیب2