شبیه سازی، شناسایی عملکردی و تجزیه و تحلیل بیان کالکون سنتاز از سیستانش توبولوزا Ⅱ

3 نتایج و تجزیه و تحلیل

3.1 شبیه سازی ژن CtCHS

چهار توالی مشروح به عنوان "کالکون سنتاز" با استفاده از داده های رونویسی گل های Cistanches tubulosa غربال شدند. از طریق مقایسه NCBI's Blast، مشخص شد که تنها یک توالی دارای طول کامل ژن CHS و دارای FPKM بیشتر از 10 است. پرایمرهای اختصاصی بر اساس این توالی طراحی شدند و قطعه ای در حدود 1200 جفت باز با استفاده از تکثیر PCR به دست آمد. cDNA گل Cistanches tubulosa به عنوان یک الگو (شکل 1). محصول PCR ژل بازیابی شد و به وکتور pCE2TA/Blunt-Zero متصل شد. نتایج توالی یابی با تجزیه و تحلیل رونوشت مطابقت داشت. این ژن CtCHS نام داشت. طول توالی 1173 جفت باز است و 390 اسید آمینه را کد می کند.

خدمات حمایتی Wecistanche - بزرگترین صادرکننده سیستانچ در چین:

ایمیل:wallence.suen@wecistanche.com

واتساپ/تلفن:+86 15292862950

خرید برای جزئیات بیشتر مشخصات:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

3.2 تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک CtCHS

3.2.1 خواص فیزیکی و شیمیایی CtCHS و تجزیه و تحلیل دامنه گذرنده

نرم افزار آنلاین ProtParam برای تجزیه و تحلیل خواص فیزیکی و شیمیایی پروتئین کدگذاری شده توسط ژن CtCHS استفاده شد. CtCHS 390 اسید آمینه را کد می کند، فرمول مولکولی C1908H3041N511O562S22، جرم مولکولی نسبی 42 836.54، نقطه ایزوالکتریک نظری 5.85 است و ناپایدار است. ضریب II 43.24 است که یک پروتئین ناپایدار است و میانگین کلی آب دوستی (GRAVY) 0.052- است که یک پروتئین آبدوست است. ابزار آنلاین Prot Scale بیشتر برای تجزیه و تحلیل آب دوستی / آبگریزی پروتئین استفاده شد. نتایج تجزیه و تحلیل نشان داد که حداکثر مقدار آب دوستی / آبگریزی پروتئین CtCHS 2.422 (342) و حداقل مقدار 2.489- بود (119). زنجیره پپتیدی اسید آمینه کدگذاری شده توسط ژن CtCHS دارای بقایای اسید آمینه آبدوست بیشتری نسبت به بقایای اسید آمینه آبگریز است، بنابراین یک پروتئین آبدوست است. از نرم افزار آنلاین TMHMM برای پیش بینی ساختار غشایی پروتئین استفاده شد. پروتئین CtCHS دامنه گذرنده ندارد.

شکل 1 تکثیر PCR ژن CtCHS

3.2.2 پیش بینی ساختار ثانویه و ساختار سوم پروتئین CtCHS

ابزار آنلاین SOPMA برای پیش بینی ساختار ثانویه پروتئین استفاده شد. نتایج در شکل 2-الف نشان داده شده است. 44.87٪ مارپیچ، 31.03٪ سیم پیچ های تصادفی، 15.64٪ زنجیره های گسترده و 8.46٪ - ورق ها ساختار ثانویه پروتئین CtCHS را تشکیل می دهند. ساختار سطح برای پیش‌بینی ساختار سوم پروتئین از نرم‌افزار آنالیز آنلاین SWISS-MODEL و از ساختار کریستالی برنج CHS1 به‌عنوان الگویی برای پیش‌بینی ساختار سه‌بعدی پروتئین CtCHS استفاده شد. نتایج در شکل 2-ب نشان داده شده است. قوام بین Cistanche tubulosa CtCHS و برنج CHS1 83.55٪ است.

3.2.3 مقایسه توالی و تجزیه و تحلیل درخت فیلوژنتیک و کاربرد

نرم افزار DNAMAN مقایسه همسانی بین CtCHS و توالی اسید آمینه CHS گونه های دیگر را انجام می دهد. نتایج در شکل 3-ج نشان داده شده است. توالی اسید آمینه CtCHS با Sesamum indicum L. (XP{1}}.1) و Antirrhinum majus L. (P06515. 1)، Mazus pumilus (NL Burman) Steenis (AAN05791.1)، Erythranthe lewisiiG سازگار است. L. Nesom & NS Fraga (AHJ80976.1)، Perilla frutescens (L.) Britton (O04111.1) و Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (NP{11}}.1). توالی اسیدهای آمینه CHS بسیار مشابه هستند، با شباهت 90.93٪، 90.68٪، 90.18٪، 89.42٪، 89.42٪ و 81.61٪.

عصاره طبیعی آلی سیستانچ با 30% اکیناکوزید و 12% آکتئوزید

علاوه بر این، تراز چند توالی نیز نشان داد که CtCHS باقیمانده های کاتالیزوری Cys164، His303، و Asn336 را حفظ کرده است. به منظور درک بیشتر موقعیت تکاملی Cistanche tubulosa CtCHS در خانواده CHS گیاهی، از نرم افزار MEGA-X برای ساخت درخت فیلوژنتیکی بین پروتئین های CtCHS و CHS سایر گیاهان استفاده شد. نتایج در شکل نشان داده شده است 3-DE lewisii AHJ80976.1) ElCHS ارتباط نزدیکی با هم دارد.

3.3 بیان و خالص سازی پروکاریوتی CtCHS

پلاسمید pET{0}a-CtCHS به سویه بیانی E. coli BL21 (DE3) تبدیل شد و بیان پروتئین توسط IPTG در دمای پایین القا شد. پروتئین با استفاده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی یون نیکل خالص شد و پروتئین خالص شده توسط SDSPAGE 10 درصد تشخیص داده شد. نتایج در شکل 3 نشان داده شده است. نوار پروتئین CtCHS نزدیک به 40 ظاهر شد،{7}} که با جرم مولکولی نسبی پروتئین CtCHS برابر با 42800 است.

3.4 تجزیه و تحلیل فعالیت آنزیم CtCHS

برای شناسایی عملکرد CtCHS، پروتئین CtCHS خالص شده با malonyl-CoA، 4-coumaroyl-CoA انکوبه شد و محصولات با استفاده از HPLC و MS شناسایی شدند. در شرایط طبیعی، نارینگنین-کالکون در محلول ناپایدار است و به راحتی به نارینگنین تبدیل می شود. بنابراین، نارینگنین-کالکون و نارینژنین به عنوان کنترل استاندارد انتخاب شدند.

نتایج آزمایش HPLC در شکل 4-الف و ب نشان داده شده است. زمان ماند محصول واکنش آنزیمی مشابه با استاندارد نارینگنین است. هر دو دارای حداکثر جذب در 289 نانومتر در طیف جذب UV هستند که با زمان ماند نارینگنین-کالکون متفاوت است. زمان و طیف جذب UV متفاوت بود، اما به عنوان یک کنترل منفی، محصول پس از انکوباسیون پروتئین CtCHS غیرفعال شده در دمای بالا با سوبسترا حاوی نارینژنین، چالکون و نارینژنین نبود. تشخیص بیشتر از طریق طیف سنجی جرمی، طیف جرمی سطح اول (شکل 4-C، D) نشان داد که محصول واکنش آنزیمی دارای [MH]-peak m/z271060 97 است، در حالی که نارینگنین دارای [MH] است. ]-peak m/z 271.{13}}.

با مقایسه طیف MS2 (شکل 5-E, F)، محصول واکنش آنزیمی CtCHS و نارینژنین هر دو دارای پیک قطعه مشخصه در m/z 107، 151 و 177 هستند که با گزارش ادبیات مطابقت دارد [19]. نشان می دهد که CtCHS دارای کمپلکس کالکون است. فعالیت آنزیمی، می تواند واکنش مالونیل-CoA و 4-کوماروئیل-CoA را به نارینژنین-کالکون کاتالیز کند.

3.5 تجزیه و تحلیل محلی سازی درون سلولی

به منظور مطالعه نقش پروتئین CtCHS در سلول‌ها، پلاسمید pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS ساخته شد و به پروتوپلاست‌های Arabidopsis thaliana تبدیل شد تا محلی‌سازی درون سلولی آن مشاهده شود. نتایج در شکل 5 نشان داده شده است. به عنوان یک کنترل، پروتئین pCAMBIA{4}S-GFP در هسته و سیتوپلاسم توزیع شد، در حالی که پروتئین همجوشی pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS عمدتاً در سیتوپلاسم، نشان می دهد که پروتئین CtCHS ممکن است در سیتوپلاسم سلول های گیاهی عمل کند. تابع.

3.6 تجزیه و تحلیل الگوی بیان CtCHS

از qRT-PCR برای تشخیص بیان نسبی CtCHS در گل‌های Cistanche deserticola با سه رنگ سفید، بنفش و قرمز استفاده شد. نتایج در شکل 6 نشان داده شده است. بیان CtCHS در گل های بنفش و قرمز به طور قابل توجهی بیشتر از گل های سفید بود. تعداد. در مقایسه با گل های سفید، میزان بیان CtCHS در گل های بنفش 8.44 برابر و سطح بیان CtCHS در گل های قرمز 3.21 برابر بیشتر است. این نتایج نشان می دهد که تغییرات در سطوح بیان CtCHS ممکن است به تفاوت در رنگ گل Cistanche deserticola مرتبط باشد. هر چه سطح بیان بالاتر باشد، رنگ گل تیره تر است. ، هر چه سطح بیان کمتر باشد، رنگ گل روشن تر است.

****P＜0.000 1شکل. 6 سطح بیان نسبی CtCHS در گلهایی با رنگهای مختلف

4. بحث

CHS یک استآنزیم کلیدی در مسیر بیوسنتزی فلاونوئیدو مربوط به thتنظیم رنگ گلدر بسیاری از گیاهان به عنوان مثال، رنگ گل ازDianthus chinensisL.[20] و گل اطلسی × هیبریدا هورت. exVilm.[22] همه تحت تأثیر CHS هستند. کنترل.Cistanches tubulosaعمدتاً دارای سه رنگ گل سفید، قرمز و بنفش است، اما مکانیسم تنظیم رنگ گل آن هنوز گزارش نشده است. در این مطالعه، یک ژن CtCHS با استفاده از روش RT-PCR کلون شدتجزیه و تحلیل داده‌های رونویسی گل‌های Cistanches tubulosa، و آن

تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیکانجام شد و نتایج نشان داد که CtCHS شباهت بالا و رابطه ژنتیکی نزدیک با توالی اسید آمینه ElCHS فیسالیس سیاه (AHJ80976.1) دارد. CHS یک پلی کتید سنتاز نوع III (PKSIII) است و مطالعات نشان داده است که CHS دارای یک سه گانه کاتالیزوری Cys-His-Asn است [23]. در این مطالعه، تجزیه و تحلیل تراز توالی اسید آمینه نشان داد که CtCHS باقیمانده های کاتالیزوری Cys164، His303، و Asn336 را حفظ کرده است، که نشان می دهد CtCHS ممکن است یک تابع سنتاز کالکون معمولی داشته باشد.

قادر است. تجزیه و تحلیل فعالیت آنزیم با استفاده از بیان پروکاریوتی پروتئین CtCHS در اشریشیا کلی انجام شد و با HPLC و MS شناسایی شد. مشخص شد که پروتئین CtCHS می‌تواند 4-کوماروئیل-CoA و مالونیل-CoA را برای تولید نارینژنین-کالکون کاتالیز کند.

CHS در سنتز فلاونوئیدها در بسیاری از گیاهان نقش دارد، اما مکان درون سلولی آن در گونه های مختلف متفاوت است. به عنوان مثال، Carthamus tinctorius L. CtCHS1[24]، Morus atropurpurea Roxb. MaCHS [25]، Eupatorium adenophorum Spreng. EaCHS [26] همه در سیتوپلاسم قرار دارند، در حالی که Paeonia delavayi var. lutea (Delavay ex Franch.) Finet et Gagnep. PdCHS

[27]، بادمجان Solanum melongena L. SmCHS [28] در سیتوپلاسم و هسته و در انگور Vitis vinifera L. VvCHS در سیتوپلاسم، هسته و دیواره سلولی قرار دارد [29]. در این مطالعه، پلاسمید pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS برای تبدیل پروتوپلاست های Arabidopsis thaliana مورد استفاده قرار گرفت و مشاهده شد که پروتئین CtCHS عمدتاً در سیتوپلاسم قرار دارد و ممکن است تولید نارینگنین-کالکون را در سیتوپلاسم کاتالیز کند. افزایش تجمع فلاونوئیدها

مسیر فنیل پروپانوئید از 4-کوماروئیل-CoA به مسیر سنتز فلاونوئید و مسیر بیوسنتز لیگنان منشعب می شود. CHS 4-کومارویل-CoA و مالونیل-CoA را کاتالیز می کند تا نارینژنین و چالکون برای شروع فلاونوئیدها تولید کند. مسیر بیوسنتزی ترکیبات شبه ترکیب، اولین آنزیم کلیدی در این مسیر است [30]. بنابراین، CHS با بیان بالا برای گیاهان برای تجمع سطوح بالاتر فلاونوئیدها و تولید گل‌های تیره‌تر مفید است. به عنوان مثال، سطح بیان CHS در گونه های گل ارغوانی Hosta plantaginea (Lam.) Aschers بیشتر از واریته های گل سفید است. Hosta HpCHS به تنباکو تبدیل می شود تا به دست آید.

در این مطالعه میزان بیان ژن CtCHS با رنگ گلهای Cistanches tubulosa مرتبط است. در گل‌های بنفش تیره‌تر و گل‌های قرمز به‌شدت بیان می‌شود و در گل‌های سفید روشن کم رنگ است. تفاوت بیان CtCHS ممکن است به دلیل تفاوت در گلهای Cistanches tubulosa باشد. یکی از دلایل داشتن کت و شلوار و رنگ های متفاوت. به طور خلاصه، این مطالعه یک ژن CtCHS را از گل‌های Cistanche deserticola شبیه‌سازی کرد و آنالیز بیوانفورماتیکی روی آن انجام داد. پروتئین نوترکیب CtCHS با بیان اگزوژن در اشریشیا کلی به دست آمد. تجزیه و تحلیل فعالیت آنزیمی ثابت کرد که پروتئین CtCHS می تواند کوآنزیم کوماروئیل را کاتالیز کند. A و مالونیل کوآنزیم A نارینژنین-کالکون تولید می کنند. مشخص شد که ژن CtCHS در گل‌های بنفش و قرمز بسیار و در گل‌های سفید کم بیان می‌شود. این نتایج نشان می‌دهد که ژن CtCHS ممکن است تولید رنگ‌های مختلف گل در Cistanche deserticola را تنظیم کند، که برای تحقیقات بیشتر در مورد مکانیسم تنظیمی رنگ گل Cistanche tubulosa مفید است و مرجعی برای تحقیقات بعدی در مورد نقش CtCHS در تنظیم رنگ گل در Cistanche deserticola.