روش‌های ژنتیک ترکیبی برای کشف ترکیب‌های تنظیمی مرتبه بالا و محرک‌های ژنتیکی مهندسی برای تمایز عصبی

غواصی در جستجوی عوامل موثر در تمایز سلولی

محققان هنوز در تلاشند تا درمان های بهتری برای بازگرداندن یا کند کردن پیشرفت اختلالات عصبی مانند بیماری پارکینسون، بیماری آلزایمر و بیماری هانتینگتون پیدا کنند. این اختلالات نتیجه مرگ سلول های عصبی در قسمت های مختلف مغز است. داروها یا درمان های مورد استفاده برای تسکین علائم در بیماران به خوبی ثابت نشده است.

برای محافظت عصبی روی پودر cistanche tubulosa کلیک کنید

آنها بافت های عصبی آسیب دیده را بازیابی نمی کنند و می توانند منجر به عوارض جانبی ناخواسته شوند. بنابراین، تعداد فزاینده‌ای از مطالعات به سلول‌های بنیادی به‌عنوان یک درمان امیدوارکننده نگاه می‌کنند، زیرا قابلیت‌های خود تجدیدی و انعطاف‌پذیری در تمایز به دودمان سلولی مورد نظر برای پیوند به بیمار برای بازیابی بافت‌های عصبی از دست رفته دارند.

با این حال، قبل از اینکه بتوان از سلول های بنیادی به صورت بالینی در درمان اختلالات عصبی استفاده کرد، هنوز زمینه هایی وجود دارد که برای باز کردن پتانسیل کامل آنها نیاز به درک بهتری دارد. سلول های بنیادی احیا شونده و چکش خوار هستند و با توجه به ترکیب مناسبی از عوامل برای ایجاد تمایز، تمایل به تبدیل شدن به هر نوع سلولی دارند. با این حال، عمق پیچیدگی در شبکه بزرگ عوامل وجود دارد.

تعیین ترکیب فاکتورهای رونویسی (TF)، مولکول‌های کوچک و/یا فاکتورهای رشد برای دستیابی به هم افزایی بهینه برای تمایز سلول‌های بنیادی از جمله سلول‌های بنیادی جنینی (ESCs) و سلول‌های بنیادی پرتوان القایی با سریع‌ترین سرعت، مهم است. در خالص ترین جمعیت یک دودمان عصبی. با این حال، می تواند یک راه استراتژیک برای غربالگری این عوامل به شیوه ای مقرون به صرفه تر و با زمان موثرتر وجود داشته باشد.

این به بهینه سازی پروتکل های از قبل ایجاد شده که هنوز پر زحمت هستند یا برای توصیف بیشتر زیرگروه های عصبی مانند نورون های خاردار متوسط، نورون های حسی و نورون های سروتونرژیک کمک می کند. این یک چالش باقی می‌ماند که محرک‌های سرنوشت عصبی را به طور جامع مشخص کنیم و نحوه تعامل این عناصر با یکدیگر در شبکه نظارتی را تعریف کنیم.

چند گروه از روش‌های غربالگری با کارایی بالا برای روشن کردن شبکه تنظیمی سرنوشت سلول استفاده کرده‌اند و بینش‌های آموزنده‌ای در مورد عواملی که تبدیل و بقای نورون‌ها را هدایت می‌کنند، ارائه کرده‌اند. لیو و همکاران (2018) از فعال‌سازی CRISPR (CRISPRa) برای جستجوی TFs یا عوامل اتصال به DNA که سرنوشت عصبی ESCها را ارتقا می‌دهند، استفاده کرد. با این حال، کار به مطالعه عوامل منفرد یا ترکیبات زوجی محدود شد.

غربالگری سیستماتیک دیگری توسط Tsunemoto و همکاران انجام شد. (2018)، که رابطه بین TFها را بررسی کرد. اکثر TFهای منفرد انتخابی آنها هیچ تاثیری در مطالعه نشان ندادند، با این حال، آنها 76 ترکیب TF جفتی را برای ترویج تمایز فیبروبلاست‌های موش به نورون‌های القایی شناسایی کردند.

قابل ذکر است، نتایج آنها با مطالعات قبلی سازگاری نداشت، مانند عدم شناسایی ناقل فعال دوپامین Slc6a3 در نورون های القایی، احتمالاً به دلیل از دست دادن عوامل اضافی. مطالعه دیگری با انجام غربالگری مبتنی بر تداخل CRISPR (CRISPRi) ژن های ضروری را برای حفظ یا بهبود بقای نورون ها تعیین کرد (Tian et al., 2019). و دوباره، آنها به غربالگری sgRNA های منفرد محدود شدند.

مطالعات بیشتری برای غربالگری بی‌طرفانه سایر عوامل ژنتیکی و افزایش تعداد ترکیب‌های فاکتور مورد نیاز است، زیرا نشان داده شده است که ترکیبی از بیش از دو عامل ممکن است در زمینه‌های مختلف مورد نیاز باشد تا به طور موثر تمایز و برنامه‌ریزی مجدد را هدایت کند.

یک مثال خوب ترکیبی از Oct4، Sox2، Klf4 و c-Myc است که برای تنظیم شبکه سیگنالینگ توسعه برای پرتوانی ESCها ضروری است (Takahashi and Yamanaka، 2006). در چنین سیستم‌های پیچیده‌ای، نیاز به توصیف جامع عملکرد ترکیب‌های ژنتیکی مرتبه بالا به روشی با توان بالا وجود دارد، و روش ترکیبی ژنتیک انبوه (CombiGEM) ممکن است بتواند این کار را انجام دهد.

روش CombiGEM برای نمایشگر ترکیبی فاکتورهای با توان بالا، مرتبه بالا و سیستماتیک

CombiGEM نه تنها یک روش سیستماتیک برای هدایت صفحه نمایش های ادغام شده در مقیاس بزرگ ارائه می دهد، بلکه قابلیت مونتاژ مقیاس پذیر کتابخانه های ژنتیکی ترکیبی درجه بالا را نیز دارد (ونگ و همکاران، 2015، 2016؛ ژو و همکاران، 2020). فرآیند یک گلدانی به کاربر اجازه می دهد تا تعداد زیادی از ترکیبات ژنتیکی را غربال کند. 1-راه، 2-راه، 3-راه، و در تئوری، کتابخانه‌های n-way.

این یک جایگزین سریع برای فرآیند مرسوم ساخت و آزمایش ترکیبات مورد علاقه نامزدهای فردی است. در حالی که چندین استراتژی غربالگری ترکیبی CRISPR نیز برای مطالعه ترکیبات ژنتیکی دوتایی توسعه داده شد (هان و همکاران، 2017؛ شن و همکاران، 2017؛ نجم و همکاران، 2018؛ تروونگ و همکاران، 2019؛ دی ویردت و همکاران، 2018، CombiGEM یک فرصت منحصر به فرد برای ارزیابی تعاملات بین سه یا چند ترکیب ژنتیکی ارائه می دهد.

برای مثال، اگر هدف کاربر استفاده از CRISPRa یا CRISPRi برای بیان یا سرکوب، به ترتیب، فهرستی از ترکیب‌های TF نامزد باشد، می‌توان با استفاده از CombiGEM-CRISPR v2، یک کتابخانه بارکد از ترکیب‌های sgRNA هدف‌دار TF را غربال کرد.0 ( وونگ و همکاران، 2016؛ ژو و همکاران، 2020) همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است.

با استفاده از مراحل بستن یک گلدانی، کتابخانه sgRNA ها و بارکدهای مربوط به آنها در یک ناقل مقصد لنتی ویروسی گنجانده می شود که بیان یک پروتئین فلورسنت را پس از فعال شدن یک پروموتر خاص سلول عصبی، مانند توبولین 1، گزارش می کند. از sgRNA ها و یک ناقل لنتی ویروسی جداگانه که حاوی Cas9 دارای کمبود آنزیمی است که با یک فعال کننده رونویسی یا سرکوبگر ترکیب شده است، می تواند به سلول های آغازین مورد نظر تحویل داده شود.

با گذشت زمان، زمانی که سلول‌ها شروع به تمایز می‌کنند، تنها سلول‌های شبه عصبی القایی، فلورسانس را بیان می‌کنند و این سلول‌ها را می‌توان با استفاده از مرتب‌سازی سلولی فعال شده با فلورسانس برای بازیابی ترکیبات TF ذخیره‌شده خود از طریق توالی‌یابی بارکد جدا کرد.

برای به دست آوردن درک بهتر از ترکیباتی که دودمان های سلولی خاص را هدایت می کنند، این سلول ها همچنین می توانند برای گزارشگرها یا نشانگرهای شناخته شده نسل سلولی بر اساس ترجیح مراحل تمایزی که کاربر برای مطالعه انتخاب می کند، بررسی شود. مرتب‌سازی سلولی فعال‌شده با مغناطیسی را می‌توان برای جدا کردن سلول‌های مورد نظر بسته به بیان نشانگر سطح سلول استفاده کرد.

توالی یابی RNA تک سلولی را می توان با غربالگری ترکیبی CRISPR به عنوان یک بازخوانی برای نمایه کردن نوع و سطوح ژن بالا یا پایین تنظیم کرد و ترکیب TFهای هدف را می توان از طریق خواندن بارکد تعیین کرد (Replogle et al., 2020). تصویربرداری با محتوای بالا می تواند برای نظارت بر تغییرات مورفولوژی سلولی از مراحل اولیه تا مراحل بعدی رشد نورون استفاده شود.

ارتباط فیزیولوژیکی یا عملکرد سلول های نورون مانند القا شده را می توان با برچسب گذاری ایمونوسیتوشیمیایی خاص برای بلوغ نورون، مانند NeuN، TUJ1 و MAP2، و اقدامات الکتروفیزیولوژیکی تعیین کرد. همانطور که قبلا ذکر شد، مطالعات TF و مولکول های کوچک را برای دستکاری سرنوشت سلول ترکیب کرده اند.

CombiGEM همچنین می‌تواند برای شناسایی ترکیبات مولکولی کوچکی که می‌توانند خود نوسازی سلول‌های بنیادی را حفظ کنند، تمایز نسل سلولی را القا کنند یا با افزایش کارایی و جایگزینی بالقوه عوامل ژنتیکی، برنامه‌ریزی مجدد را تسهیل کنند، استفاده شود. CombiGEM همچنین می تواند ابتدا با تعیین اهداف مولکولی کوچک مسیرهای سیگنالینگ، عوامل فرآیند اپی ژنتیکی یا سلولی اعمال شود.

سپس از طریق طراحی یک کتابخانه از sgRNA برای فعال یا غیرفعال کردن اهداف قابل مصرف دارو، می‌توان ترکیب مؤثر مولکول‌های کوچک را برای افزایش تمایز یا برنامه‌ریزی مجدد شناسایی کرد. این مفهوم توسط مطالعاتی که قبلاً برای کشف ترکیبات هدف دارویی علیه سرطان و بیماری پارکینسون انجام داده‌ایم به خوبی منعکس شده است (ژو و همکاران، 2020).

استفاده از CombiGEM نه تنها به اغتشاشات مبتنی بر CRISPR محدود نمی شود، بلکه می تواند برای سایر عوامل تنظیم کننده DNA یا RNA نیز برای مطالعه صفحه نمایش های از دست دادن عملکرد با تداخل RNA، و همچنین موارد افزایش عملکرد با بیان اعمال شود. از microRNAها (وونگ و همکاران، 2015) و فریم‌های خواندن باز انسانی تأیید شده با توالی مانند مواردی که در کتابخانه TFome انسانی گزارش شده‌اند (Ng et al., 2020).

روش CombiSEAL برای مهندسی با توان بالا عوامل رونویسی

یافتن ترکیب ایده‌آل از عوامل ژنتیکی طبیعی همچنان می‌تواند چالش‌هایی را ایجاد کند، مانند محدود شدن به TFهای مشخص شده ژنوم با دانش قبلی در مورد بیان و نقش آنها در تمایز. مطالعات نشان داده‌اند که مهندسی TF یا تولید فاکتورهای رونویسی مصنوعی، راه جدیدی از گزینه‌ها را برای سرعت بخشیدن به نرخ تمایز از طریق مسیرهای جایگزین باز می‌کند، که از وابستگی بیان پیش‌نیاز سایر عوامل درون‌زا در شبکه تنظیم‌کننده ژن پیشی می‌گیرد یا به طور کامل جایگزین می‌شود. TFهای طبیعی با موارد کارآمدتر (Jauch، 2018).

این امر محققین را قادر می سازد تا عوامل مورد نیاز را با توجه به نیازهای تجربی خود تنظیم کنند. ما پیشنهاد می‌کنیم که اگر هدف انجام جهش‌زایی با توان عملیاتی بالا در چندین سایت به یک TF که شامل حوزه‌های مختلف است، باشد، CombiSEAL می‌تواند یک پلت فرم مفید باشد (چوی و همکاران، 2019). روش CombiSEAL قطعات DNA کد کننده اسید آمینه را که به صورت ترکیبی با بارکد برچسب گذاری شده اند، جمع آوری می کند (شکل 1).

شکل 1 ｜ روش های CombiGEM و CombiSEAL برای غربالگری محرک های ژنتیکی موثر تمایز. نمونه ای از روش CombiGEM، مونتاژ چندین sgRNA است که از یک ساختار بیان شده اند، و ترکیبات sgRNA توسط بارکدهای به هم پیوسته آنها نشان داده می شود. روش CombiSEAL شامل جهش‌هایی است که به بخش‌های مختلف یک پروتئین، مانند فاکتورهای رونویسی که به صورت P1، P2، P(n) و P(n به اضافه 1) معرفی می‌شوند، وارد می‌شود. و ترکیب جهش ها توسط بارکدهای به هم پیوسته مربوطه آنها منعکس می شود. کاربر می‌تواند تنظیمات را روی سایر سیستم‌های تحویل DNA اعمال کند و در این نمایش، از ناقل‌های لنتی ویروسی استفاده می‌شود. استراتژی‌های غربالگری را می‌توان با فرمت تلفیقی انجام داد، و در این مثال، شناسایی جمعیت‌های سلولی که به دودمان نورونی خاص تمایز می‌یابند، با فعال‌سازی پروموتر برای بیان پروتئین فلورسنت، که به عنوان X-fluorescence در نمودار نشان‌گذاری شده است، شناسایی می‌شود. توالی یابی نسل بعدی (NGS) بارکدها از مخزن سلولی، اهداف DNA یا گونه(های) رونویسی را رمزگشایی می کند. تجزیه و تحلیل دقیق عواملی که باعث تمایز انواع مختلف نورون می‌شوند می‌تواند از روش‌های مبتنی بر آرایه مانند کاوش در سلول‌ها با نشانگرهای نسل سلولی و سپس مرتب‌سازی سلول‌های فعال شده با مغناطیسی (MACS) به صفحات چند چاهی استفاده کند که می‌تواند با پیگیری تصویربرداری با محتوای بالا روش دیگر، توالی‌یابی RNA تک سلولی (RNA-Seq) به کاربر اجازه می‌دهد تا بیان ژن سلول‌ها را با فنوتیپ‌های مورد نظر نمایه کند و می‌تواند بارکدها را برای شناسایی ترکیب‌های sgRNA یا ترکیب‌های جهش گونه(های) کلیدی بازیابی کند. FACS: مرتب سازی سلولی فعال شده با فلورسانس.

CombiSEAL با اولین بخش های پروتئین که در آن جهش زایی مورد نظر است شروع می شود. کاربر می تواند برای هر بخش هر تعداد گونه ای را تولید کند، سپس آنها را با بارکد برچسب گذاری کند تا موقعیت و ترکیب جهش ها را شناسایی کند. سپس هر مجموعه از بخش‌ها با قرار دادن آنها در یک ناقل مقصد که حاوی توالی پروتئین نوع وحشی است که با آنزیم‌های IIS از نوع طرفین در ناحیه جهش‌زایی مورد نظر اصلاح شده است، به صورت متوالی مونتاژ می‌شود.

این طرح همجوشی بدون اسکار برای اتصال چندین بخش از پروتئین برای جلوگیری از افزودن اسیدهای آمینه ناخواسته به پروتئین مهم است. روش CombiSEAL امکان تعیین توالی اسیدهای آمینه مجموعه انتخاب شده از انواع مورد علاقه را به طور موثرتر و مقرون به صرفه تر می دهد، و از نیاز به توالی خوانی طولانی مدت روی کل پروتئین برای شناسایی انواع جهش ها و محل قرارگیری آنها در سراسر پروتئین جلوگیری می کند. پروتئین

این تنظیم روشی امکان تجزیه و تحلیل آسان تر را با انجام یک توالی با توان بالا از مجموعه بارکدهای به هم پیوسته کوتاه می دهد که ترکیبی از انواع و موقعیت های جهش اسید آمینه یا سایر تغییرات دلخواه مانند تعویض دامنه، درج و حذف را که قبلا انجام شده است، استنباط می کند. در ابتدا بر روی TF طراحی و نصب شد

نتیجه

در مقایسه با روش‌های آزمون و خطا، پیشرفت‌هایی در به کارگیری رویکردهای سیستماتیک‌تر برای تعیین عوامل یا ترکیب‌های ضروری مورد نیاز برای هدایت تبدیل یک نوع سلول به دودمان عصبی حاصل شده است. با این حال، توانایی شناسایی ترکیب‌های مرتبه بالاتر وجود نداشت، و در اینجا پیشنهاد می‌کنیم که روش CombiGEM ممکن است بتواند چنین محدودیت‌هایی را برطرف کند.

CombiGEM از یک سیستم بستن بارکددار و یک گلدانی برای کنار هم قرار دادن ترکیبات درجه بالاتری از فاکتورهای اتصال DNA برای هدف قرار دادن DNA در یک حرکت استفاده می کند، و روند چندین دور غربالگری را دور می زند تا تعداد بازدیدها را به اندازه ای قابل کنترل برای اعتبارسنجی های پایین دست کاهش دهد. . علاوه بر این، TFهای طبیعی کمتر کارآمد را می توان با TFهای مصنوعی یا مهندسی شده جایگزین کرد تا بیان ژن را بهتر تنظیم کند. ما یک روش جهش‌زایی پروتئین، CombiSEAL را توصیف می‌کنیم، که کاربران را قادر می‌سازد تا مجموعه‌های بزرگی از انواع فاکتورهای رونویسی را با مونتاژ مستقیم جهش‌های سایت متعدد برچسب‌گذاری شده با بارکد در پروتئین و حوزه‌های مختلف آن ایجاد کنند.

این امر باعث تسریع و کاهش هزینه روش های غربالگری برای بازیابی اطلاعات مربوط به انواع جهش های انواع مورد نظر می شود. ما امیدواریم که روش‌های پیشنهادی بتواند به درک بیشتر و گسترش امکانات ارتقای بازسازی عصبی کمک کند و بتواند به طور گسترده در سایر زمینه‌های تحقیقاتی کاربرد داشته باشد.

مکانیسم اثر محافظتی عصبی سیستانچ

نشان داده شده است که سیستانچ از طریق مکانیسم های مختلفی دارای اثرات محافظت کننده عصبی است:

1. اثرات ضد التهابی: سیستانچ حاوی ترکیباتی است که نشان داده شده است التهاب را در قسمت های مختلف مغز مهار می کند و می تواند به محافظت از نورون ها در برابر آسیب کمک کند.

2. اثرات آنتی اکسیدانی: سیستانچ حاوی ترکیباتی است که خواص آنتی اکسیدانی قوی دارند. آنتی اکسیدان ها به محافظت از نورون ها در برابر آسیب های ناشی از رادیکال های آزاد و استرس اکسیداتیو کمک می کنند.

3. تنظیم انتقال دهنده های عصبی: نشان داده شده است که سیستانچ برخی از انتقال دهنده های عصبی مانند سروتونین و دوپامین را تنظیم می کند که می تواند به محافظت از نورون ها و بهبود عملکرد شناختی کمک کند.

4. تحریک فاکتور نوروتروفیک: نشان داده شده است که سیستانچ تولید فاکتورهای نوروتروفیک را تحریک می کند، مانند فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز (BDNF)، که می تواند رشد و بقای نورون ها را تقویت کند.

به طور کلی، این مکانیسم ها برای محافظت از نورون ها در برابر آسیب، رشد و بقای آنها و بهبود عملکرد شناختی با هم کار می کنند.

منابع

Choi GCG، Zhou P، Yuen CTL، Chan BKC، Xu F، Bao S، Chu HY، Thean D، Tan K، Wong KH، Zheng Z، Wong ASL (2019) جهش زایی ترکیبی به طور انبوه فعالیت های ویرایش ژنوم SpCas9 را بهینه می کند. Nat Methods 16:722-730.

DeWeirdt PC، Sanson KR، Sangree AK، Hegde M، Hanna RE، Feeley MN، Griffith AL، Teng T، Borys SM، Strand C، Joung JK، Kleinstiver BP، Pan X، Huang A، Doench JG (2020) بهینه سازی AsCas12a برای غربالگری های ژنتیکی ترکیبی در سلول های انسانی. Nat Biotechnol 39:94-104.

Han K، Jeng EE، Hess GT، Morgens DW، Li A، Bassik MC (2017) ترکیبات دارویی هم افزایی برای سرطان در غربالگری CRISPR برای تعاملات ژنتیکی زوجی شناسایی شده است. Nat Biotechnol 35:463- 474.

Jauch R (2018) برنامه ریزی مجدد سرنوشت سلول از طریق مهندسی فاکتورهای رونویسی بومی. Curr Opin Genet Dev 52:109-116.

Najm FJ، Strand C، Donovan KF، Hegde M، Sanson KR، Vaimberg EW، Sullender ME، Hartenian E، Kalani Z، Fusi N، Listgarten J، Younger ST، Bernstein BE، Root DE، Doench JG (2018) Orthologous CRISPR- آنزیم Cas9 برای غربالگری ژنتیکی ترکیبی. Nat Biotechnol 36:179-189.

Ng AHM، Khoshakhlagh P، Rojo Arias JE، Pasquini G، Wang K، Swiersy A، Shipman SL، Appleton E، Kiaee K، Kohman RE، Vernet A، Dysart M، Leeper K، Saylor W، Huang JY، Graveline A، Taipale J، Hill DE، Vidal M، Melero-Martin JM، و همکاران. (2020) یک کتابخانه جامع از عوامل رونویسی انسانی برای مهندسی سرنوشت سلول. Nat Biotechnol doi: 10.1038/s41587-020-0742-6.

Replogle JM، Norman TM، Xu A، Hussmann JA، Chen J، Cogan JZ، Meer EJ، Terry JM، Riordan DP، Srinivas N، Fiddes IT، Arthur JG، Alvarado LJ، Pfeiffer KA، Mikkelsen TS، Weissman JS، Adamson B (2020) نمایشگرهای CRISPR تک سلولی ترکیبی با جذب مستقیم RNA راهنمای و توالی یابی هدفمند. Nat Biotechnol 38:954- 961.

شن جی پی، ژائو دی، ساسیک آر، لوبک جی، بیرمنگام A، بوجورکز گومز، لیکن کی، کلپر کی، پکین دی، بکت آن، سانچز کی‌اس، توماس آ، کو سی سی، دو دی، روگوئف، لوئیس NE، چانگ آن ، کریسبرگ JF، کروگان N، Qi L، و همکاران. (2017) صفحه نمایش ترکیبی CRISPRCas9 برای نقشه برداری جدید از تعاملات ژنتیکی. Nat Methods 14:573-576.

Takahashi K، Yamanaka S (2006) القای سلول های بنیادی پرتوان از کشت های فیبروبلاست جنینی و بالغ موش توسط عوامل تعریف شده. سلول 126:{2}}.

Tian R، Gachechiladze MA، Ludwig CH، Laurie MT، Hong JY، Nathaniel D، Prabhu AV، Fernandopulle MS، Patel R، Abshari M، Ward ME، Kampmann M (2019) پلت فرم مبتنی بر تداخل CRISPR برای نمایشگرهای ژنتیکی چندوجهی در iPSC انسانی -نرون های مشتق شده نورون 104:{4}}.

Truong VA، Hsu MN، Kieu Nguyen NT، Lin MW، Shen CC، Lin CY، Hu YC (2019) CRISPRai برای فعال‌سازی و مهار همزمان ژن برای ترویج غضروف‌زایی سلول‌های بنیادی و بازسازی استخوان جمجمه. Nucleic Acids Res 47:e74. Wong AS، Choi GC، Cheng AA، Purcell O، Lu TK (2015) ژنتیک ترکیبی مرتبه بالا موازی در سلول های انسانی. Nat Biotechnol 33:952-961.

Wong AS، Choi GC، Cui CH، Pregernig G، Milani P، Adam M، Perli SD، Kazer SW، Gaillard A، Hermann M، Shalek AK، Fraenkel E، Lu TK (2016) غربالگری بارکد چندگانه CRISPR-Cas9 توسط CombiGEM فعال شده است. . Proc Natl Acad Sci USA 113:2544-2549.

Zhou P، Chan BKC، Wan YK، Yuen CTL، Choi GCG، Li X، Tong CSW، Zhong SSW، Sun J، Bao Y، Mak SYL، Chow MZY، Khaw JV، Leung SY، Zheng Z، Cheung LWT، Tan K , Wong KH, Chan HYE, Wong ASL (2020) یک صفحه نمایش ترکیبی CRISPR سه طرفه برای تجزیه و تحلیل تعاملات بین اهداف قابل دارو. Cell Rep 32:108020.

داون جی ال تیان، آلن اس ال ونگ*