مقایسه بین QPCR و RNA-seq چالش های کمی سازی بیان HLA قسمت 1 را نشان می دهد

خلاصه

جایگاه های کلاس I و II آنتی ژن لکوسیت انسانی (HLA) عناصر ضروری ایمنی ذاتی و اکتسابی هستند. عملکرد آنها شامل ارائه آنتی ژن به سلول های T است که منجر به پاسخ های ایمنی سلولی و هومورال و تعدیل سلول های NK می شود. تأثیر استثنایی آنها بر پیامدهای بیماری اکنون با مطالعات ارتباطی گسترده ژنوم مشخص شده است. اگزون های کد کننده شیار اتصال به پپتید تمرکز اصلی برای تعیین اثرات HLA بر حساسیت / پاتوژنز بیماری بوده است. با این حال، سطح بیان HLA نیز در پیامدهای بیماری دخیل است، و بعد دیگری به تنوع شدید HLA اضافه می‌کند که بر تنوع پاسخ‌های ایمنی در بین افراد تأثیر می‌گذارد.

رابطه نزدیکی بین آنتی ژن های لکوسیت و ایمنی وجود دارد. آنتی ژن لکوسیتی به مولکولی روی سطح گلبول های سفید خون انسان اشاره دارد که می تواند انواع مختلف سلول ها و پاتوژن ها را شناسایی و تشخیص دهد. این بخش مهمی از سیستم ایمنی انسان و تنظیم کننده مهم پاسخ ایمنی است.

تفاوت در آنتی ژن های لکوسیت ممکن است منجر به پاسخ های ایمنی متفاوت و حساسیت به بیماری شود. به عنوان مثال، برخی از آنتی ژن های لکوسیتی با بیماری های خود ایمنی، بیماری های عفونی و تومورها مرتبط هستند. بیان برخی از آنتی ژن های لکوسیتی نیز با عملکرد و کمیت سلول های ایمنی مرتبط است.

بنابراین، درک ویژگی های مولکولی سطح لکوسیت یک فرد برای ارزیابی وضعیت ایمنی فرد و خطر و پیش آگهی بیماری از اهمیت بالایی برخوردار است. در عین حال، برای تدوین درمان شخصی و اقدامات پیشگیرانه نیز مفید است. از این منظر، ما نیاز به بهبود ایمنی داریم. سیستانچ تاثیر بسزایی در بهبود ایمنی دارد. گیاه سیستانچ سرشار از مواد آنتی اکسیدانی مختلف مانند ویتامین C و کاروتنوئیدها است.

پودر عصاره cistanche tubulosa را کلیک کنید

برای تخمین بیان HLA، مطالعات ایمونوژنتیک به طور سنتی بر PCR کمی (qPCR) تکیه می کنند. پذیرش فناوری‌های جایگزین با توان بالا مانند RNA-seq به دلیل چندشکلی شدید در ژن‌های HLA، به دلیل مسائل فنی با مشکل مواجه شده است. با این حال، اخیراً چندین روش بیوانفورماتیک برای تخمین دقیق بیان HLA از داده‌های RNA-seq توسعه یافته‌اند. این یک فرصت هیجان انگیز برای تعیین کمیت بیان HLA در مجموعه داده های بزرگ است، اما همچنین سوالاتی در مورد اینکه آیا نتایج RNA-seq با نتایج qPCR قابل مقایسه هستند یا خیر، ایجاد می کند. در این مطالعه، ما سه دسته از داده‌های بیان ژن‌های HLA کلاس I را برای مجموعه‌ای همسان از افراد تجزیه و تحلیل می‌کنیم: (الف) RNA-seq، (ب) qPCR، و (ج) بیان HLA-C سطح سلول. ما همبستگی متوسطی را بین تخمین‌های بیان از qPCR و RNA-seq برای HLA-A، -B، و -C مشاهده کردیم ({{1{12}}}}.2 کمتر یا مساوی rho کمتر یا مساوی 0.53 ). ما در مورد عوامل فنی و بیولوژیکی بحث می کنیم که باید در هنگام مقایسه کمیت ها برای فنوتیپ های مولکولی مختلف یا استفاده از تکنیک های مختلف در نظر گرفته شوند.

کلید واژه ها

HLA · بیان · PCR · RNA-seq.

معرفی

بیان ژن یک فنوتیپ مولکولی را فراهم می کند که در یک موقعیت میانی بین تنوع ژنتیکی و فنوتیپ های پیچیده، مانند وضعیت بیماری قرار دارد. درک اساس ژنتیکی بیان ژن می تواند برای ایجاد پیوند بین تنوع ژنتیکی و فنوتیپ های پیچیده (GTEx Consortium 2013؛ Lappalainen et al. 2013)، از جمله حساسیت به بیماری های خودایمنی و عفونی، استراتژیک باشد. اگرچه مطالعه تنوع ژنتیکی در جایگاه های آنتی ژن لکوسیتی انسانی (HLA) و به طور کلی در ناحیه مجتمع اصلی سازگاری بافتی (MHC)، برای تشریح اساس ژنتیکی چندین بیماری پیچیده مورد استفاده قرار گرفته است (Trowsdale and Knight 2013؛ Dendrou et al. 2018)، گنجاندن فنوتیپ‌های مولکولی، به‌ویژه آنهایی که با بیان ژن مرتبط هستند، نسبتاً جدید است (Apps et al. 2015؛ Vince et al. 2016; Ramsuran et al. 2018; Johansson et al. 2022).

ناحیه MHC انسانی در کروموزوم 6p21 چگالی ژنی بالایی را با الگوهای منحصر به فرد عدم تعادل پیوندی (LD) و چندشکلی شدید نشان می دهد (de Bakker et al. 2006; Radwan et al. 2020). ناحیه MHC حاوی جایگاه‌های HLA کلاس I و II است که مولکول‌های دخیل در تحریک و تعدیل پاسخ ایمنی را رمزگذاری می‌کنند. مولکول های HLA کلاس I توسط اکثر سلول های هسته دار بیان می شوند و به طور کلی پپتیدهای داخل سلولی را به سلول های CD8 به علاوه T ارائه می کنند. در مقابل، مولکول‌های کلاس II HLA عمدتاً توسط سلول‌های ارائه‌دهنده آنتی‌ژن حرفه‌ای بیان می‌شوند و در سلول‌های CD4 به‌علاوه T آنتی‌ژن‌های بیرونی وجود دارند که توسط اندوسیتوز درونی شده‌اند. مولکول‌های کلاس I نیز توسط گیرنده‌های سلول‌های کشنده طبیعی (NK)، گیرنده‌های شبه ایمونوگلوبولین سلول قاتل (KIRs) شناسایی می‌شوند که هم بر آموزش و هم فعال‌سازی سلول‌های NK تأثیر می‌گذارد (Colonna and Samaridis 1995؛ Goodson-Gregg et al. 2020). جفت شدن آلوتیپ های مختلف HLA کلاس I و مولکول های خاص KIR بر فعالیت سلول NK (و زیرمجموعه ای از سلول های CD8 به علاوه T) تأثیر می گذارد و منجر به خطرات متفاوتی برای سرطان، بیماری های عفونی و خودایمنی می شود (مرور در Kulkarni و همکاران 2008).

ارتباط بیماری HLA در درجه اول به تفاوت های خاص آلل در ارائه آنتی ژن نسبت داده شده است، به دلیل پلی مورفیسم های گسترده در شیار اتصال به پپتید. با این حال، سطوح بیان HLA به برخی از ارتباط های مشاهده شده بین پلی مورفیسم های HLA و پیامدهای بیماری کمک می کند. سطح بیان HLA یک تعدیل کننده مهم خودایمنی و قدرت پاسخ ایمنی با واسطه HLA به سرطان و عفونت است (بازبینی در رنه و همکاران 2016).

مثال های متعددی از ارتباط بین سطح بیان HLA و پیامدهای عفونت ویروسی وجود دارد. برای مثال، به خوبی مستند شده است که سطوح بیان HLA-C بالاتر، هم در سطح mRNA و هم در پروتئین روی سطح سلول، با کنترل بهتر HIV مرتبط است (توماس و همکاران 2009؛ کولکارنی و همکاران همکاران 2011؛ ​​Apps و همکاران 2013؛ Parolini و همکاران 2018؛ Bachtel و همکاران 2018)، در حالی که بیان HLA-A بالا با اختلال در کنترل HIV مرتبط است (رامسوران و همکاران 2018). عفونت SARS-CoV بیان ژن HLA-C (Loi و همکاران 2022) و بیان HLA کلاس I را در سطح سلول کاهش می دهد (ژانگ و همکاران 2021؛ ارشد و همکاران 2023)، و همچنین کلاس HLA بیان ژن II، از جمله HLA-DPA1، -DPB1، -DRA، و -DRB1 (Wilk et al. 2020).

علاوه بر این، ارتباط بین سطوح بیان HLA-DPA1 (Ou et al. 2019) و HLA-DPB1 (Thomas et al. 2012; Ou et al. 2021) با پاکسازی HBV وجود دارد. بیان HLA-DRA با حساسیت به عفونت توسط ویروس های آنفلوانزای A خفاش در رده های سلولی انسان (Karakus et al. 2019). و ارتباط گسترده بین انواع تنظیمی و سطوح بیان در ژن‌های HLA کلاس II، از جمله HLA-DQA1، -DQB1، -DQB2، -DRB1، و -DRB5 با پاسخ آنتی‌بادی در برابر چندین ویروس شایع (کاچوری و همکاران 2020).

سطح بیان جایگاه های HLA نیز با خودایمنی مرتبط است (برای بررسی به Johansson et al. 2022 مراجعه کنید). سطح بیان HLA-C در سطح سلول (Apps et al. 2013؛ Kulkarni et al. 2013)، و همچنین سطوح HLA-G در سطح سلول و در پلاسما (da Costa Ferreira et al. 2021) مرتبط است. با خطر بیماری التهابی روده افزایش بیان HLA-B27 در سطح سلول در میان بیماران اسپوندیلیت آنکیلوزان مشاهده شد (Cauli et al. 2002)، همانطور که بیان کلی HLA کلاس I در بیماران بیماری گریوز مشاهده شد (Weider et al. 2021). سطح بیان HLA کلاس II نیز بر خطر شرایط خودایمنی تأثیر می گذارد.

بیان ژن HLA-DQA1 و -DRB1 و بیان مولکول های DQ و DR روی سطح سلول در مونوسیت های خون محیطی بیماران ویتیلیگو افزایش یافته است (Cavalli et al. 2016). انواع تنظیمی مرتبط با بیان ژن HLA-DQA1، -DQB1 و -DRB1 بالاتر و بیان DQ و DR در سطح سلول با خطر لوپوس اریتماتوز سیستمیک مرتبط است (راج و همکاران 2016). بیان ژن HLA-DRB5 در بیماران اسکلرودرمی مبتلا به بیماری بینابینی ریه بیشتر است (Odani et al. 2012). آلل های خاص HLA-DRB1 در بیماران آرتریت روماتوئید به شدت بیان می شوند (Houtman et al. 2021). و بیان بالاتر DRB1*15:01 با خطر مولتیپل اسکلروزیس مرتبط است (آلسینا و همکاران 2012). بنابراین، درک تنوع بیان HLA در بین افراد و مکانیسم‌های تنظیم کننده سطوح بیان HLA کلیدی برای کشف اساس ژنتیکی فنوتیپ‌های بیماری خواهد بود.

به طور سنتی، بیان HLA توسط تکنیک های مبتنی بر آنتی بادی برای سطوح بیان در سطح سلول (توماس و همکاران 2012؛ Apps و همکاران 2013) یا با PCR کمی (qPCR یا RT-PCR) برای سطوح رونویسی mRNA (Bettens et al. همکاران 2014؛ رامسوران و همکاران 2015، 2017). مقایسه نتایج در بین مطالعات یا حتی مقایسه جایگاه‌های HLA متمایز در یک مطالعه چالش برانگیز است زیرا روش‌های تجربی متفاوتی برای هر آنالیز و برای هر مکان HLA استفاده می‌شود که می‌تواند منجر به بازده‌های تقویت متفاوت در qPCR یا شباهت آنتی‌بادی در فلوسیتومتری شود.

فن‌آوری‌های با توان بالا مانند RNA-seq تخمین‌های بیانی را برای همه ژن‌های موجود در ژنوم، از جمله ژن‌های HLA ارائه می‌کنند، بنابراین امکان ارزیابی بیان HLA را در یک زمینه ژنومی گسترده فراهم می‌کنند. با این حال، این فناوری‌ها هنگام استفاده برای تخمین سطوح بیان ژن‌های HLA با چالش‌های زیادی مواجه می‌شوند. علاوه بر سوگیری های مستند مرتبط با سنجش RNA-seq (به عنوان مثال، اثرات دسته ای، آماده سازی کتابخانه، محتوای GC ('t Hoen et al. 2013)، مشکل در تخمین سطوح بیان ژن های HLA از این واقعیت ناشی می شود که کمی سازی شامل تراز خواندن کوتاه با یک ژنوم مرجع است که نمایش کاملی از تنوع آللی HLA ارائه نمی دهد.

بنابراین، برخی از خوانده‌ها ممکن است به دلیل تفاوت‌های زیاد در مورد ژنوم مرجع، در یک راستا قرار نگیرند (Brandt et al. 2015). علاوه بر این، ژن‌های HLA بخشی از یک خانواده ژنی هستند که پس از دورهای متوالی تکراری تشکیل می‌شوند و اغلب شامل بخش‌هایی هستند که بین پارالوگ‌ها بسیار مشابه هستند، بنابراین منجر به هم‌ترازی متقابل بین ژن‌ها و کمی‌سازی مغرضانه سطوح بیان می‌شود. این مشکلات انگیزه توسعه خطوط لوله محاسباتی را ایجاد کرد (برای بررسی به Johansson et al. 2022 مراجعه کنید) که تنوع شناخته شده HLA را در مرحله هم ترازی نشان می دهد و نشان داده شده است که سطوح بیان دقیقی را برای ژن های HLA فراهم می کند (Boegel et al. 2012; Lee et al. همکاران 2018؛ آگویار و همکاران 2019؛ گوتیرز-آرسلوس و همکاران 2020؛ داربی و همکاران 2020).

در حالی که هر دو رویکرد RNA-seq و qPCR بیان HLA را با کمی کردن فراوانی رونوشت‌ها تخمین می‌زنند، روش‌ها شامل روش‌های مختلف پردازش تجربی و بیوانفورماتیک هستند. با توجه به دانش ما، مقایسه کمی نتایج حاصل از RNA-seq با نتایج حاصل از qPCR برای ژن‌های HLA انجام نشده است. در این مطالعه، ما به دنبال مقایسه تکنیک‌ها و فنوتیپ‌های مولکولی مختلف برای تعیین کمیت بیان HLA کلاس I بودیم، با در نظر گرفتن اینکه هیچ تکنیکی را نمی‌توان استاندارد طلایی در نظر گرفت. برای کاهش اثر تغییرات فنی و بیولوژیکی در مقایسه مطالعات مختلف، ما یک سنجش RNA-seq را بر روی مجموعه‌ای از 96 نفر انجام دادیم که تخمین‌های بیان qPCR برای آنها در دسترس بود (برای HLA-A، -B، -C)، و برای زیر مجموعه ای که بیان سطح سلولی مبتنی بر آنتی بادی HLA-C نیز در دسترس بود. کمی سازی RNA-seq با یک خط لوله متناسب با HLA انجام شد که امکان تخمین بیان دقیق را فراهم می کند و سوگیری رویکردهای استاندارد مبتنی بر یک ژنوم مرجع را به حداقل می رساند.

مواد و روش ها

نمونه ها

نمونه خون از 96 اهداکننده خون سالم که در برنامه اهدای داوطلبانه در آزمایشگاه ملی تحقیقات سرطان فردریک (FNLCR) ثبت نام کرده بودند، گرفته شد. رضایت کتبی آگاهانه از همه افراد اخذ شد و نمونه ها با روش های تایید شده توسط IRB از موسسه ملی سرطان ناشناس شدند. RNA از سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی تازه جدا شده (PBMC) با استفاده از کیت RNeasy Universal (Qiagen) استخراج شد. RNA برای حذف DNA ژنومی با DNAاز بدون RNAse تیمار شد. RNA کل استخراج شده از PBMC ها با استفاده از تراشه آزمایشگاهی HT RNA (Caliper، Life Sciences) اندازه گیری شد. تمام نمونه هایی که نمره کیفیت RNA بالاتر از 8 را نشان دادند در تجزیه و تحلیل بیان ژن استفاده شدند.

تایپ HLA

آلل های HLA با توالی یابی سانگر تعیین شدند. علاوه بر این، HLApers (Aguiar et al. 2019) و Kourami (Lee and Kingsford 2018) را اجرا کردیم تا الل‌های HLA را مستقیماً از RNAseq استنباط کنیم و مطابقت را با فراخوان‌های مبتنی بر توالی سنجی Sanger بررسی کردیم. اگر تماس‌های ثابت بین HLApers و کورامی را در نظر بگیریم، تنها 10 ناهماهنگی را با تماس‌های سنگر از 288 مقایسه مشاهده کردیم (3 مکان × 96 نفر). اکثر آنها (n=5) پشتیبانی از RNA-seq را برای یک آلل بسیار نزدیک به اللی که توسط توالی یابی Sanger تعیین شده بود نشان دادند، بنابراین ما تصمیم گرفتیم که تماس های مبتنی بر RNA-seq را حفظ کنیم. برای 3 ژنوتیپ، ما تماس‌های هموزیگوت را از RNA-seq مشاهده می‌کنیم که احتمالاً به این دلیل است که یک آلل بیان نشده است، و ما تماس‌ها را از توالی‌یابی سانگر حفظ کردیم. این بر تخمین بیان تأثیری نمی‌گذارد، زیرا هیچ قرائتی با آللی که از طریق RNA-seq شناسایی نشده است، تراز نمی‌شود. برای یک ژنوتیپ، ما پشتیبانی خوبی برای تماس هتروزیگوت مشاهده کردیم در حالی که توالی سانگر یک هموزیگوت نامیده شد. در آن صورت، ما فراخوانی مبتنی بر RNA-seq را حفظ کردیم زیرا خواندن های مشاهده شده را بهتر توضیح می داد. برای یک فراخوانی آلل، خطای فراخوانی های مبتنی بر RNA-seq را به دلیل پوشش خواندن ناکافی در نظر گرفتیم.

PCR کمی (qPCR)

سطوح رونویسی mRNA HLA برای HLA-A، -B، و -C با استفاده از qPCR در سنجشی اندازه‌گیری شد که تقویت بی‌طرفانه آلل‌های مشترک در هر مکان را تضمین می‌کند و در عین حال از تقویت همه جایگاه‌های دیگر اجتناب می‌کند. آغازگرهای مورد استفاده عبارتند از: HLA-A (F، GCTCCCACTCCATGAGGTAT؛ R، AGTCTG TGACTGGGCCTTCA). HLA-B (F، ACTGAGCTTGTG GAGACCAGA؛ R، GCAGCCCCTCATGCTGT)؛ HLA-C (F، CTGGCCCTGACCGAGACCTG؛ R، CGCTTGTAC TTCTGTGTCTCC). رونویسی معکوس با استفاده از کیت RNA-to-cDNA با ظرفیت بالا (Applied Biosystems) انجام شد. تکثیر HLA و cDNA میکروگلوبولین ژن خانه داری 2 (B2M) با استفاده از Power SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems)، روی دستگاه ABI 7900HT انجام شد. توالی های پرایمر برای B2M در جدول S4 از Kulkarni و همکاران توضیح داده شده است. (2013). میانگین سطح بیان هر ژن HLA به B2M نرمال شد و با استفاده از روش 2-∆∆Ct (که Ct سیکل آستانه است) محاسبه شد.

میانگین سطوح بیان اختصاصی آلل آلل های معمولی HLA با یک مدل خطی همانطور که در رامسوران و همکارانش توضیح داده شده است، برآورد شد. (2015). به طور خاص، ما بیان را به عنوان یک تابع خطی از دو آلل حمل شده توسط هر فرد مدل‌سازی کردیم و اثرات هر آلل را بر بیان ژن استخراج کردیم. ما این مرحله را در R انجام دادیم (به بخش در دسترس بودن کد مراجعه کنید).

بیان سطحی

بیان سطح سلول HLA-C بر روی سلول های CD3 پلاس از PBMC های تازه جدا شده با فلوسیتومتری با استفاده از آنتی بادی مونوکلونال اختصاصی HLA-C DT9 اندازه گیری شد (Apps et al. 2013). برای تجزیه و تحلیل HLA-A در زیرمجموعه ای از افراد دارای A*03 و A*11، سلول ها را با آنتی بادی 0554HA (One Lambda, Inc.) رنگ آمیزی کردیم.

RNA-seq

آماده سازی RNA

RNA-seq بر روی RNA ذخیره شده در -80 درجه انجام شد. RNA کل با استفاده از روش Qubit RNA HS (Thermo Fisher) تعیین شد. کیفیت RNA با استفاده از ابزار Bioanalyzer 2100 و کیت Agilent 6000 RNA Pico (تکنولوژی های Agilent) ارزیابی شد. برای هر نمونه، 500 نانوگرم RNA کل به عنوان ورودی برای تهیه کتابخانه‌های تهی‌شده با rRNA رونوشت استفاده شد. یک کتابخانه متصل شده با آداپتور با کیت HyperPrep KAPA (KAPA Biosystems, Wilmington, MA) با استفاده از آداپتورهای بارکددار DNA NEXTfex Bioo Scientific (BioScientifc, Austin, TX, USA) طبق پروتکل ارائه شده توسط KAPA تهیه شد.

کاهش rRNA با استفاده از RiboErase

RNA ریبوزومی با انکوبه کردن RNA کل با پروب های مکمل توالی rRNA تخلیه شد. پس از هیبریداسیون، RNase H برای تجزیه آنزیمی rRNA استفاده شد. پاکسازی و هضم DNase با استفاده از Kapa Pure Beads و DNase طبق پروتکل Kapa انجام شد.

تکه تکه شدن، سنتز cDNA، و ساخت کتابخانه

نمونه‌های فاقد rRNA در 85 درجه به مدت 4.5 دقیقه در حضور منیزیم قبل از سنتز رشته‌های 1 و 2 و واکنش‌های A-Tailing قطعه قطعه شدند. آداپتورهای بارکددار NEXTfex DNA (1.5 میکرومولار) به cDNA دم A با یک بارکد منحصر به فرد برای هر نمونه متصل شدند. محصولات با Kapa Pure Beads خالص سازی شدند و 8 سیکل تقویت کتابخانه انجام شد. پس از تقویت، پاکسازی نهایی کتابخانه انجام شد و کمی سازی و QC کتابخانه با استفاده از Qubit DNA HS Assay (Thermo Fisher) و کیت Agilent DNA HS بر روی ابزار Bioanalyzer 2100 ارزیابی شد.

ترتیب دهی

کتابخانه‌های توالی‌یابی چندگانه به‌دست‌آمده در تشکیل خوشه در cBOT Illumina (Illumina، San Diego، CA، USA) و توالی‌یابی با استفاده از Illumina HiSeq 2500 به دنبال پروتکل‌های ارائه‌شده توسط Illumina برای دنباله‌های جفت 2×126 جفت باز انجام شد. هر رونوشت تا عمق هدف 40 تا 50 میلیون خوانده توالی یابی شد.

RNA-seq در نمونه های تازه از 11 نفر

برای بررسی امکان تخریب نمونه مواد ذخیره شده در 80- درجه قبل از توالی یابی RNA، که یک منبع بالقوه اختلاف با تخمین های qPCR است، خون 11 اهداکننده را دوباره جمع آوری کردیم و RNA-seq را روی نمونه های جدید انجام دادیم. آزمایش با همان آماده سازی کتابخانه و روش های قبلی انجام شد، اما با استفاده از Illumina NextSeq با خوانش 2×150 pb تعیین توالی شد.

کمی سازی بیان برای RNA-seq

رونوشت مرجع

ما از Salmon (پاترو و همکاران 2017) برای تخمین سطوح بیان برای همه رونوشت‌های مشروح‌شده در پایگاه داده Gencode v37 استفاده کردیم. ما از همه گزینه‌ها برای تصحیح سوگیری در سالمون استفاده کردیم (تعصب GC، سوگیری موقعیتی، و سوگیری خاص توالی).

شخصی شده

همانند «نسخه‌نویسی Ref»، اما با رونوشت‌های HLA شخصی‌سازی‌شده بر اساس ژنوتیپ‌های HLA-A، -B، و -C که هر فرد حمل می‌کند. شخصی‌سازی با تراز کردن توالی برای آلل HLA ژنوم مرجع با ژنوم برای بدست آوردن مختصات انجام شد. سپس، با استفاده از هم‌ترازی چند دنباله‌ای آلل موجود در ژنوم مرجع با همه آلل‌های دیگر (موجود در نسخه 3.43 IPD-IMGT/HLA.{7}} (رابینسون و همکاران 2020))، ژنومیک را نسبت دادیم. موقعیت به تمام آلل های HLA. در نهایت، ما یک رونوشت شخصی سازی شده بر اساس ترکیب اطلاعات مربوط به مختصات رونوشت و توالی آلل HLA ساختیم. این روش در R (تیم R Core 2020) با استفاده از بسته Biostrings (Pagès و همکاران 2020) و بسته متا tidyverse (Wickham et al. 2019) انجام شد.

For more information:1950477648nn@gmail.com