تنظیم هماهنگی متابولیسم تریپتوفان سیستمیک و کلیه توسط ناقلان دارو OAT1 و OAT3

جفری سی. گرانادوس¹، آن ریشل²، جاهیر ام گوتیرز¹، پاتریک ژانگ³، شینلیان ژانگ⁴، ویبه بهاتناگار⁵، ناتان ای. لوئیس^1,2,6و Sanjay K. Nigam^2,7,*

^{مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com}

تجربه سیستانچ

اینکه چگونه اندام ها متابولیت های در حال گردش را حس می کنند یک سوال کلیدی است. در اینجا، ما نشان می‌دهیم که حمل‌کننده‌های آنیون آلی چندگانه داروها، OAT1 (SLC22A6 یا NKT) و OAT3 (SLC22A8)، در حس اندام نقش دارند. تجزیه و تحلیل متابولومیک سرم موش های حذفی Oat1 و Oat3 تغییراتی را در مشتقات تریپتوفان درگیر در متابولیسم و ​​سیگنال دهی نشان داد. تعدادی از این متابولیت ها از میکروبیوم روده مشتق شده اند و به عنوان سموم اورمیک درمزمنکلیهمرض. تعامل مستقیم با حمل و نقل با سنجش حمل و نقل مبتنی بر سلول پشتیبانی شد. برای ارزیابی تأثیر از دست دادن عملکرد OAT1 یا OAT3 بر کلیه، اندامی که این ناقلان جذب به شدت بیان می‌شوند، داده‌های رونویسی حذفی بر روی یک مدل محاسباتی مبتنی بر "تکلیف متابولیک" که بیش از 150 عملکرد سلولی را ارزیابی می‌کند، ترسیم شد. علیرغم تغییرات متابولیت های تریپتوفان در هر دو ناک اوت، تنها در ناک اوت Oat1 عملکردهای سلولی متعدد مرتبط با تریپتوفان افزایش یافت. بنابراین، کلیه که از توانایی دریافت کینورنین، کینورنات، آنترانیلات و N-for-mylanthranilate از طریق OAT1 محروم است، با فعال کردن مسیرهای بیوسنتزی مرتبط با تریپتوفان خود پاسخ می‌دهد. نتایج از تئوری سنجش از دور و سیگنالینگ پشتیبانی می‌کند، که توضیح می‌دهد چگونه انتقال‌دهنده‌های «دارو» به بهینه‌سازی سطوح متابولیت‌ها و مولکول‌های سیگنال‌دهنده با تسهیل گفتگوی ارگان کمک می‌کنند. از آنجایی که OAT1 و OAT3 توسط بسیاری از داروها مهار می شوند، داده ها حاکی از پتانسیل تداخلات دارو و متابولیت است. در واقع، درمان انسان با پروبنسید، یک مهارکننده OAT که برای درمان نقرس استفاده می‌شود، متابولیت‌های تریپتوفان در گردش را افزایش داد. علاوه بر این، با توجه به اینکه آژانس‌های نظارتی توصیه کرده‌اند که داروها برای اتصال یا انتقال OAT1 و OAT3 آزمایش شوند، نتیجه می‌شود که این متابولیت‌ها می‌توانند به‌عنوان نشانگرهای زیستی درون‌زا برای تعیین اینکه آیا کاندیدهای دارو با OAT1 و/یا OAT3 تداخل دارند، استفاده شوند.

انتقال دهنده های آنیون آلی OAT1 (SLC22A6، در اصل NKT (1)) و OAT3 (SLC22A8، در اصل ROCT (2)) در لوله پروگزیمال توبول یافت می شوند.کلیهو شبکه مشیمیه مغز و کنترل توزیع فیزیولوژیکی و حذف داروهای متعدد و سموم محیطی و همچنین متابولیت های درون زا مانند کتوگلوتارات، پروستاگلاندین ها و اورات (3، 4). علاوه بر این، OATs به تنظیم سطوح محصولات طبیعی بلعیده شده و ترکیبات مشتق شده از میکروبیوم روده (به عنوان مثال، اپیکاتچین، 3-ایندوکسیل سولفات، سولفات p-cresol) کمک می کند (5، 6).

OAT1 و OAT3، اعضای خانواده SLC22، از جمله شناخته‌شده‌ترین ناقل‌کننده‌های داروی چندگانه هستند. این گروه از ناقلان دارو شامل سایر اعضای خانواده های SLC (حامل املاح) و ABC (کاست اتصال دهنده ATP) می باشد (7، 8). ادبیات گسترده‌ای در مورد نقش‌های دارویی و سم‌شناسی این ناقل‌ها وجود دارد، با این حال عملکردهای درون‌زای این پروتئین‌های حفظ‌شده تکاملی، و همچنین شبکه نظارتی که در آن شرکت می‌کنند، تازه شروع به شناسایی می‌کنند (9). این ناقلین چند گونه ای بر بسیاری از جنبه های فیزیولوژی و پاتوفیزیولوژی تأثیر می گذارند، احتمالاً با عملکرد در ترکیب با ناقل های تک یا الیگو خاص. سه نمونه پاتوفیزیولوژیکی با مشخصه‌های خوب عبارتند از: نقش OAT1، OAT3، URAT1 و ABCG2 در نقرس (10)، نقش OAT1 و OAT3 در تجمع سموم اورمیک مرتبط با مزمن.کلیهبیماری (CKD) (11، 12)، و خانواده SLC22 در حادکلیهجراحت (13).

به دلیل مجموعه وسیعی از ترکیبات آنیون آلی کوچک که توسط OAT1 و OAT3 منتقل می‌شوند، طیف وسیعی از بیگانه‌بیوتیک‌ها و مولکول‌های درون‌زا می‌توانند برای دسترسی و پاکسازی کلیوی توسط این ناقل‌های OAT رقابت کنند (14، 15). این پیامدهای مهمی دارد زیرا بسیاری از متابولیت‌ها، از جمله متابولیت‌هایی که از میکروبیوم روده ناشی می‌شوند و توسط OAT1 و OAT3 منتقل می‌شوند، فیزیولوژی درون‌زا را تنظیم می‌کنند و با ایجاد اختلالات بالینی مانند CKD، سندرم متابولیک و دیابت مرتبط هستند (14, 16، 17). برای مثال، مقدار CMPF (3-کربوکسی{10}}متیل-5-پروپیل{12}} فوران پروپانوئیک اسید)، یک بستر OAT3، در گردش خون با دیابت مرتبط است. CMPF یک متابولیت اسید چرب فوران است که در روغن ماهی، روغن های گیاهی، کره و سایر غذاها یافت می شود و عملکرد سلول های پانکراس را مختل می کند که منجر به عدم تحمل گلوکز می شود (18، 19). پیامدهای بالقوه رقابت در سطح ناقل بین یک دارو و متابولیت درون زا حمل‌شده شامل (الف) تغییر غلظت درون سلولی متابولیت‌ها است زیرا داروی حمل‌شده ورود متابولیت‌ها را به سلول مسدود می‌کند. (ب) تغییر غلظت سرمی دارو، متابولیت یا هر دو، که منجر به افزایش نیمه عمر و/یا سطح متابولیت می شود. و (ج) متابولیسم سیستمیک تغییر یافته ناشی از اثرات آبشاری دیستال در مسیرهای متابولیکی متعدد که به OAT1 یا OAT3 یا هر دو بستگی دارد.

ما یک رویکرد زیست‌شناسی سیستمی را به کار بردیم که از داده‌های متابولومیک و رونویسی موش‌های Oat1 و Oat3knockout (KO) برای تجزیه و تحلیل عملکردهای متابولیک اصلی که تحت‌تاثیر OAT1 و OAT3 هستند، استفاده کردیم. داده‌های متابولومیک سرم موش‌های Oat1 و Oat3 KO نشان‌دهنده تأثیر این ناقل‌ها بر متابولیسم سیستمیک درون‌زا است. ما از داده‌های رونویسی استفاده کردیمکلیهکه محل بیان ژن های ناقل رمزکننده است، برای ارزیابی فعالیت صدها عملکرد متابولیک با استفاده از تجزیه و تحلیل وظایف متابولیک. با انجام این کار، ما توانستیم درک تغییرات متابولیت خارج سلولی به دلیل از دست دادن ناقل OAT1 یا OAT3 را با تجزیه و تحلیل مسیرهای متابولیک داخل سلولی تحت تاثیر قرار دهیم.

با هم، رویکرد چند omics و تجزیه و تحلیل زیست‌شناسی سیستم‌های مورد استفاده در اینجا تصویری از مسیرهای متابولیک و سیگنالینگ محلی و سیستمیک ارائه می‌دهند که به طور جداگانه و مشترک توسط OAT1 و OAT3 تعدیل شده‌اند. ما نشان می‌دهیم که OAT1 نه تنها متابولیسم تریپتوفان را به صورت سیستمی تنظیم می‌کند، بلکه نقش کلیدی در مسیرهای متابولیک تریپتوفان در داخل بافتی که در آن یافت می‌شود، بازی می‌کند. بنابراین، نتایج ما نشان می‌دهد که مطالعات موجودات دارویی جدید نه تنها باید اثرات متقابل دارو-متابولیت (DMI) در سرم را در نظر بگیرند، بلکه تغییرات بالقوه در متابولیسم سلولی را به دلیل از دست دادن هجوم متابولیت‌ها از طریق رقابت در سطح ناقل ارزیابی کنند. در حمایت از ارتباط انسانی کار ما، نشان می‌دهیم که بسیاری از تغییرات در سطوح سرمی متابولیت‌های تریپتوفان که در موش‌های ناک اوت دیده می‌شود، پس از تجویز پروبنسید، دارویی که برای درمان نقرس استفاده می‌شود و OAT1 و OAT3 را مهار می‌کند، در انسان نیز مشاهده می‌شود.

\

فواید سیستانچ برای مردان

نتایج

خلاصه رویکرد کلی

خانواده ژن SLC22 (OATs، OCTs، OCTNs) برای انتقال‌دهنده‌هایی که در جذب بسیاری از ترکیبات منحصربه‌فرد در چندین بافت شرکت می‌کنند، رمزگذاری می‌کند، اگرچه بسیاری از تحقیقات بر روی تعداد انگشت شماری از اعضای (SLC22A1، SLC22A2، SLC22A6، SLC22A8) متمرکز شده‌اند. بسیاری از داروهای رایج (20، 21). با این حال، این ژن ها به شدت حفظ شده اند، با ارتولوگ ها در مگس، کرم، ماهی و خارپشت دریایی (22). این بدان معناست که آنها نقش های فیزیولوژیکی مهمی فراتر از دست زدن به مواد مخدر دارند. برای تعیین نقش درون زا OAT1 و OAT3 در کنترل متابولیسم در سطح بافت و سطح ارگانیسم مستقل از نقش شناخته شده آنها به عنوان ناقل دارو و سم، ما داده‌های ترانس کریپتومیک بافت خاص و داده‌های متابولومیک سرم را تجزیه و تحلیل کردیم (شکل 1). ما داده‌های موش‌هایی که دارای کمبود ژنتیکی در Oat1 یا Oat3 و گروه‌های کنترل نوع وحشی آن‌ها بودند را مقایسه کردیم. این مجموعه داده‌ها قبلاً از دیدگاه شیمی‌انفورماتیک (23) و برای ارائه یک نمای کلی از مسیرهای آسیب‌دیده (24) مورد بررسی قرار گرفته‌اند، اما در اینجا ما بر نقش خاص آنها در وضعیت متابولیت‌های تریپتوفان تأکید می‌کنیم. زیرا این دو انتقال دهنده درکلیه، تجزیه و تحلیل کردیمکلیهداده‌های رونویسی با استفاده از تجزیه و تحلیل وظایف متابولیک، یک روش زیست‌شناسی سیستمی که ژن‌ها را بر اساس نقش هماهنگ‌شده‌شان در بیوسنتز مجموعه محدودی از واسطه‌های متابولیت کلیدی از ورودی‌های متابولیت مختلف گروه‌بندی می‌کند (برای جزئیات بیشتر به بخش روش‌ها مراجعه کنید). ما از این مطالعات در سنجش انتقال آزمایشگاهی حمایت کردیم. ما همچنین از ارتباط بالینی یافته های خود با داده های متابولومیک انسانی پشتیبانی می کنیم.

ویژگی‌های شناخته شده موش‌های Oat1 KO و Oat3 KO تقریباً تمام ویژگی‌های موش‌های فاقد Oat1 یا Oat3 مشابه موش‌های نوع وحشی (25-27) است (جدول 1). موش های ناک اوت با زنده ماندن قابل مقایسه با موش های نوع وحشی هستند. علاوه بر این، آنها هیچ ناهنجاری رشدی یا رشدی را نشان نمی‌دهند، و بررسی بافت‌شناسی و فیزیولوژیکی این ناک‌اوت‌های مختلف (حدود 2 تا 8 ماهگی) تفاوت‌های کمی یا هیچ تفاوتی با نوع وحشی نشان نداد، به جز موش‌های Oat3 KO که فشار خون کمی پایین‌تر داشتند. 28). روندی به سمت رسوب چربی کبدی در Oat1 KO نیز مشاهده شده است اما فقط برای موش های بسیار مسن (29).

این موش های ناک اوت ناقل از نقطه نظر دارویی و سم شناسی نیز مشخص شده اند (جدول 2). OAT1 و OAT3 نقش مهمی در مدیریت داروها و سموم مختلف، هم محیطی و هم تولید درون زا دارند (30-38). هر دو موش ناک اوت به دلیل ناتوانی این داروها در دسترسی به مجرای نفرون پاسخ‌های خود را به دیورتیک‌های لوپ و تیازیدی تغییر داده‌اند - فرآیندی که وابسته به جذب OAT1-یا OAT3-به داخل سلول توبول پروگزیمال است. . حیوانات Oat1 KO در برابر سمیت کلیوی ناشی از جیوه به دلیل کمبودکلیهجذب کونژوگه های جیوه هر دو موش سموم اورمیک را در سرم انباشته کردند و ترشح اسید اوریک را کاهش دادند. تجزیه و تحلیل ازمایشگاهی بافت‌های موش Oat1 KO یا Oat3 KO کاهش جذب چندین ضد ویروس را نشان می‌دهد.

ما گزارش کرده‌ایم که حیوانات دارای کمبود{0} جو ممکن است بیان OAT3 را کاهش داده باشند (39). با این حال، تعدادی از مطالعات نشان داده اند که تاثیر عملکردی این در بهترین حالت در حالت پایه متوسط ​​است. به عنوان مثال، ناک اوت Oat1کلیه هابه طور قابل توجهی انتقال PAH را کاهش داده اند، اما هیچ از دست دادن آشکاری در حمل و نقل بستر OAT3، سولفات استرون (26). تجزیه و تحلیل شیمی انفورماتیک مجموعه‌ای از خواص مولکولی را شناسایی کرده است که متابولیت‌های تغییر یافته در Oat1 را در مقایسه با موش‌های دارای کمبود Oat3 متمایز می‌کند (23). علاوه بر این، جنینیکلیهکشت های اندام از هر دو خط موش مجموعه های مختلفی از ضد ویروس ها را منتقل کردند (36-38). همچنین تفاوت هایی در انواع سموم اورمیک موجود در Oat1 در مقابل Oat3 KO وجود دارد (34).

متابولیسم تریپتوفان به طور سیستماتیک در موش های Oat1 و Oat3 KO تغییر می کند

آنالیزهای متابولومیک منتشر شده موش‌های Oat1 KO و Oat3 KO تغییرات فیزیولوژیکی مهمی را در مدیریت متابولیت‌های درون‌زا و محصولات میکروبیوم روده، از جمله برخی از سموم اورمیک نشان می‌دهد (34، 35). در اینجا، ما 731 متابولیت با هویت شناخته شده را در سرم جمع آوری شده از موش های کنترل و Oat1 KO تجزیه و تحلیل کردیم. به همین ترتیب، 611 متابولیت با هویت شناخته شده در سرم موش های کنترل و Oat3 KO شناسایی شد.

برای موش‌های Oat1 KO، ما دریافتیم که 63 متابولیت در ابرمسیر اسید آمینه (جدول تکمیلی S1) به طور قابل‌توجهی افزایش یافته است (p کمتر یا مساوی 0). دارای تغییرات برابری بالاتر از 3) یا گرایش به افزایش قابل توجه (0.05 کمتر یا مساوی p کمتر یا مساوی 0.10، نه متابولیت)، که نشان می‌دهد آنها یا سوبستراهای OAT1 هستند یا غلظت سرمی آنها بستگی دارد در OAT1. برای موش‌های Oat3 KO، ما دریافتیم که ده متابولیت در سوپرمسیر اسید آمینه به طور قابل‌توجهی افزایش یافته است، در حالی که 11 متابولیت به سمت افزایش قابل توجهی گرایش داشتند (جدول تکمیلی S2). به عنوان مکمل مقادیر p، ما d کوهن را نیز محاسبه کردیم که اندازه اثر بزرگ (از 1.76 تا 4.17) را برای متابولیت های تریپتوفان نشان داد. مطابق با سایر داده‌های فارماکولوژیک و فیزیولوژیکی به‌دست‌آمده از موش‌های حذفی OAT1 و OAT3 یا بافت آنها که نشان‌دهنده تفاوت‌های عملکردی مهم است (23، 36، 38)، مقایسه تغییرات در متابولیت‌های سرم در راه ابرمسیر اسید آمینه بین Oat1 KO (63 متابولیت) و موش های Oat3 KO (21 متابولیت) تنها ده متابولیت همپوشانی را در این زیر مجموعه ها نشان دادند (جدول تکمیلی S3).

هر متابولیت با استفاده از نرم‌افزار متابولون به یکی از هشت مسیر فوق‌العاده (اسید آمینه، کربوهیدرات، کوفاکتورها و ویتامین‌ها، انرژی، لیپید، نوکلئوتید، پپتید، زنوبیوتیک) و یکی از 90 مسیر فرعی طبقه‌بندی شد. از 17 متابولیتی که به طور قابل توجهی در سرم حیوانات Oat1 KO و Oat3 KO انباشته شدند، چهار متابولیت به زیرمسیر متابولیسم تریپتوفان تعلق داشتند، که نشان می دهد این دو ناقل نقش مشترک مهمی در تنظیم متابولیسم سیستمیک تریپتوفان دارند (شکل 2). . به طور مستقل، متابولیسم تریپتوفان یکی از غنی‌ترین مسیرهای فرعی برای هر دو مدل حذفی بود (شکل 3). شانزده شکل 3. متابولیسم تریپتوفان یکی از مسیرهای تغییر یافته در هر دو موش حذفی است. نمودار آتشفشانی برای Oat1 KO (n=5) ​​متابولیت های تریپتوفان را در برابر سایر متابولیت های اندازه گیری شده نشان می دهد. B، متابولیسم تریپتوفان دومین مسیر غنی‌شده برای متابولیت‌های به‌طور قابل‌توجهی است. C، نمودار آتشفشانی برای Oat3 KO (n=3) که متابولیت های تریپتوفان را در برابر سایر متابولیت های اندازه گیری شده نشان می دهد. D، متابولیسم تریپتوفان غنی‌ترین مسیر برای متابولیت‌های به طور قابل‌توجهی بالا بر اساس تجزیه و تحلیل زیرمسیر متابولونی است. نقش OAT1 و OAT3 در متابولیسم تریپتوفان 4 J. Biol. شیمی. (2021) 296 100575متابولیت های تریپتوفان در سرم هر دو موش اندازه گیری شد و 12 مورد به طور قابل توجهی در حداقل یک گروه تغییر یافت. موش‌های Oat1 KO دارای 11 متابولیت بالا بودند، از جمله یکی (N-formylant hranilate) که در سرم Oat3 KO اندازه‌گیری نشد (جدول 3). تجزیه و تحلیل از Oat3 KO نشان داد که شش متابولیت از 16 متابولیت به طور قابل توجهی یا روند به سمت تغییر قابل توجهی داشتند. برخی از این متابولیت‌ها، از جمله آنهایی که از باکتری‌های موجود در میکرو فلور روده به وجود می‌آیند، شناخته شده‌اند که اثرات دیستال روی چندین اندام دیگر دارند. برای مثال، 3-ایندوکسیل سولفات با پیشرفت بیماری مرتبط استکلیهبیماری و سندرم اورمیک (12، 40). داده‌ها نشان می‌دهد که OAT1 و OAT3 برای تنظیم متابولیسم سیستمیک تریپتوفان با هم کار می‌کنند، و در عین حال عملکردهای خاصی را در متابولیسم تریپتوفان با مدیریت مجموعه‌های متابولیت‌های متمایز بر واکنش‌های بیوشیمیایی مختلف دارند.

ارزیابی تداخلات دارو و متابولیت در انسان با داروی مهارکننده OAT و متابولیت های تریپتوفان

پروبنسید، دارویی که برای درمان نقرس استفاده می‌شود، برای تعیین تأثیر کوتاه‌مدت یک داروی اتصال به OAT با میل ترکیبی بالا بر روی سطوح متابولیت‌های در گردش، برای انسان تجویز شد. پروبنسید دارای سه هدف به خوبی تثبیت شده است: SLC22A12 (URAT1، Rst)، OAT1، و OAT3، که همگی ژن‌های مرتبط نزدیک در گروه ناقل آنیون آلی از خانواده SLC22 حامل‌های املاح هستند. URAT1 یک انتقال دهنده اسید اوریک است که در غشای آپیکال (سمت رو به ادرار) لوله پروگزیمال واقع شده است، بنابراین انتظار می رود OAT1 و OAT3 که چند اختصاصی هستند و در سمت رو به خون لوله پروگزیمال بیان می شوند، اعمال کنند. تأثیر عمیق تر بر متابولوم سرم. مقایسه اندازه‌گیری‌های متابولیک خون قبل و 5 ساعت پس از دوز، تغییرات عمده‌ای را در مسیر فرعی متابولیسم تریپتوفان نشان می‌دهد (جدول 4). با توجه به پلتفرم های مختلف، 22 متابولیت در این زیرمسیر وجود داشت که 16 مورد از آنها به طور قابل توجهی تغییر یافته بودند. چهارده متابولیت در هر سه پلتفرم اندازه‌گیری شد و چندین اشتراک بین موش‌های ناک اوت و انسان‌های تحت درمان با پروبنسید را نشان داد (شکل 4). برای مثال، افزایش در 3-ایندوکسیل سولفات، کینورنین، N-استیل کینورنین، و لاکتات ایندول در هر دو گروه موش حذفی و انسان مشاهده شد. با این حال، همپوشانی بیشتری بین موش Oat1 KO و انسان‌های تحت درمان با پروبنسید وجود داشت. تمام هشت متابولیت‌هایی که به طور قابل‌توجهی در Oat1 KO افزایش یافته بودند، در انسان‌های تحت درمان با دارو نیز به طور قابل‌توجهی افزایش یافتند. فقط سروتونین که در موش Oat3 KO افزایش یافته بود، در انسان تغییری نکرد.

موش های تحت درمان با داروی مهار کننده OAT تغییراتی را در متابولیسم تریپتوفان نشان می دهند

به‌عنوان واسطه‌ای بین مدل‌های موش حذفی و انسان، ما موش‌های نوع وحشی را با پروبنسید، یک داروی شناخته شده مهارکننده OAT، درمان کردیم. این درمان دارویی منجر به افزایش شش متابولیت تریپتوفان، از جمله کینورنین، کینورنات و ایندوللاکتات شد (شکل 5). این متابولیت ها در یک یا هر دو آزمایش حذفی و انسان های تحت درمان با پروبنسید افزایش یافتند.

بنابراین، نتایج کلی در انسان‌ها و موش‌های تحت درمان با پروبنسید، و همچنین موش‌های حذفی، از نقش OAT1 و OAT3 در تنظیم سطوح متابولیت‌های تریپتوفان در گردش حمایت می‌کنند.

متابولیت‌های تریپتوفان با سنجش‌های حمل‌ونقل آزمایشگاهی OAT1 و OAT3 انسانی تعامل دارند. بسیاری از متابولیت‌های موجود در این مسیر فرعی علیه این ناقل‌ها آزمایش شده‌اند (جدول 3)، اما متابولیت‌های دیگر کشف نشده باقی می‌مانند. سنجش حمل و نقل برای اسید ایندولاستیک (ILA) نشان داد که ILA با OAT1 و OAT3 تعامل دارد (به ترتیب 74.56 ± .1 IC{7}}، 23.29 ± 74.49 میکرومولار) (شکل 6). علاوه بر این، سروتونین، که به طور منحصر به فرد در Oat3 KO افزایش یافته بود، تنها با OAT3 در شرایط آزمایشگاهی تعامل داشت (IC{18}}.2 ± 167.0 میکرومولار) (داده‌ها نشان داده نشده است). سپس مقادیر IC50 با مقادیر Km شناخته شده برای محاسبه ثابت های بازدارنده ادغام شدند. ثابت مهاری (Ki) برای ILA با OAT1 119.3 میکرومولار بود.

تجزیه و تحلیل تکلیف متابولومیک کلیه ناک اوت نقش محوری OAT1 را در سنجش توبول پروگزیمال متابولیت های تریپتوفان نشان می دهد.

ما از داده های ریزآرایه استفاده کردیمکلیه هاOat1 KO، Oat3 KO، و کنترل‌های نوع وحشی آنها برای شناسایی اینکه چگونه تغییرات حمل‌کننده برکلیهعملکردهای متابولیک برای این منظور، ما از یک روش زیست‌شناسی سیستم (تجزیه و تحلیل وظایف متابولیک (41) از ابزار CellFie) استفاده کردیم که پیش‌بینی می‌کند چگونه تغییرات در بیان ژن بر فهرست از پیش تعریف‌شده‌ای از 175 کار متابولیک تأثیر می‌گذارد (جدول تکمیلی S4)، که سیستم‌های متابولیکی عمومی را پوشش می‌دهد. سلول (انرژی، نوکلئوتید، کربوهیدرات، اسید آمینه، لیپید، ویتامین و کوفاکتور و متابولیسم گلیکان). همانطور که در روش‌ها توضیح داده شد، محاسبه یک «نمره کار متابولیک» داده‌های رونویسی می‌گیرد و امتیاز فعالیت ژن را برای هر ژن نسبت می‌دهد. یک مدل متابولیسم در مقیاس ژنوم برای تهیه فهرستی از واکنش های مورد نیاز برای انجام هر یک از 175 وظیفه متابولیک استفاده می شود. بنابراین، تجزیه و تحلیل transcriptomic می تواند به طور مستقیم برای مقایسه کمی فعالیت نسبی هر عملکرد متابولیک تحت شرایط مختلف استفاده شود (به عنوان مثال، نوع وحشی در مقابل Oat1 KO، نوع وحشی در مقابل Oat3 KO).

ما دریافتیم که وظایف متابولیک مرتبط با تریپتوفان در بین موش‌هایی که تفاوت زیادی بین Oat KO و موش‌های نوع وحشی داشتند، رایج بود. با این حال، آنچه غیر منتظره بود این بود کهکلیهوظایف متابولیک مربوط به تریپتوفان به OAT1 وابسته بود اما نه به OAT3. در موش‌های Oat1 KO، سنتز کینورنین، کینورنات، آنترانیلات، و N-for-mylanthranilate از تریپتوفان، نمرات تکالیف متابولیکی را افزایش داد، در حالی که هر یک از این کارها نمره تکلیف متابولیکی کاهش یافته در Oat3 KO داشتند. این با آنالیزهای متابولومیک سرم مطابقت دارد، که نشان دهنده افزایش قابل توجهی در سطوح کینورنین، کینورنات، آنترانیلات و N-for-mylanthranilate در Oat1 KO است.

بحث

OAT1 و OAT3 به ​​دلیل نقششان در حذف صدها دارو شناخته شده اند (42). با این حال، مطالعات in vivo و in vitro OAT1 و OAT3 نشان داده‌اند که این پروتئین‌ها در انتقال متابولیت‌های درون‌زا و مشتق از میکروب‌های روده، سموم اورمیک، مولکول‌های سیگنال‌دهنده، مواد مغذی مصرف‌شده، سموم صنعتی و محصولات طبیعی نقش دارند. 24، 26، 34، 35، 43). به نظر می رسد که این مورد در مورد سایر ناقلان دارویی چندگانه نیز صادق است، و نشان می دهد که سهم آنها در متابولیسم درون زا بسیار ناچیز است (44).

این ناقل‌های دارویی چندگانه تقریباً در تمام بافت‌ها بیان می‌شوند و نقش مهمی در شکل 4 دارند. یک نمودار ون از متابولیت های تریپتوفان تغییر یافته قابل توجه در موش های حذفی و انسان های تحت درمان با پروبنسید. از 14 متابولیت مشترک در هر سه پلت فرم، 12 مورد به طور قابل توجهی در حداقل یکی از آزمایش ها افزایش یافتند. چهار متابولیت به طور قابل توجهی در هر آزمایش بالا بود. B، ساختارهای شیمیایی متابولیت ها در هر آزمایش افزایش یافت: 3-ایندوکسیل سولفات، ایندوللاکتات، کینورنین و N-استیل کینورنین. C، نمودارهای جعبه‌ای برای هر متابولیت در انسان‌های تحت درمان با پروبنسید (n=20)، موش Oat1 KO (n=5)، و موش Oat3 KO (n=3). خطوط در نمودار جعبه نشان دهنده میانه است. نقش OAT1 و OAT3 در متابولیسم تریپتوفان. Biol. شیمی. (2021) 296 100575 7سدهای اپیتلیال و اندوتلیال بین خون و سایر مایعات/بخش های بدن (به عنوان مثال، سد خونی-مغزی، سد خونی-شبکیه، سد خونی-CSF، سد بینی-مغزی، سد خونی-ادرار). به عنوان تنظیم کننده متابولیسم سیستمیک، و همچنین متابولیسم موضعی در بافت بیان آنها، نوع مطالعات و تجزیه و تحلیل هایی که در اینجا توضیح داده ایم، اگر برای همه ناقلین "دارو" انجام شود، ممکن است به طور اساسی دیدگاه فیزیولوژیکی ما را در مورد این پروتئین های حفظ شده تکاملی تغییر دهد.

اهمیت دارویی بالینی این ناقل‌ها بسیار زیاد است و آژانس‌های نظارتی غربالگری موجودیت‌های دارویی جدید را در برابر حداقل هفت ناقل داروی چندگانه (OAT1، OAT3، OATP1B1، OATP1B3، OCT2، P-GP، BCRP) توصیه کرده‌اند تا احتمال دارو را محدود کنند. تداخلات دارویی (DDI) - مواردی که دو یا چند دارو برای دسترسی به یک ناقل با هم رقابت می کنند. DDI های واسطه انتقال دهنده می توانند غلظت داروها را در خون تغییر دهند و به طور بالقوه منجر به اثرات بالینی نامطلوب شوند (45). با توجه به تعداد سوبستراهای OAT1 و OAT3، یک پدیده مشابه ممکن است بین داروها و متابولیت های در گردش رخ دهد. این DMIها همچنین پتانسیل تأثیرگذاری بر عملکرد بافت را دارند، زیرا متابولیت‌ها و مولکول‌های سیگنال‌دهنده ممکن است نتوانند وارد سلول شوند و تأثیرات خود را بر فیزیولوژی سلولی طبیعی اعمال کنند. مطالعه حاضر این احتمال را تایید می کند.

در تجزیه و تحلیل های متابولومیک ما از سرم موش های حذفی Oat1 و Oat3، تغییرات مشخصی در متابولیت های مرتبط با تریپتوفان وجود داشت. افزایش سطح سیستمیک متابولیت ها، به دلیل عدم وجود این ناقلین در سطح مشترک خون باکلیه، احتمال کاهش غلظت درون سلولی را افزایش دادکلیهسلول های لوله پروگزیمال این سلول ها به نوبه خود چگونه ممکن است پاسخ دهند؟ ما برای پرداختن به این سوال از تحلیل تکلیف متابولیک مبتنی بر رونویسی استفاده کردیم. ما چندین وظایف متابولیکی مرتبط با تریپتوفان محلی (کلیه) را شناسایی کردیم که تحت تأثیر نبود ناقلین قرار گرفتند. این تغییرات در نمرات کار متابولیک ناشی از افزایش جبرانی در بیان ژن‌های مرتبط با وظیفه متابولیک در زمینه کمبود OAT1 است. در حالی که بسیاری از مسیرهای متابولیک توسط تجزیه و تحلیل وظایف متابولیک مبتنی بر متابولومیک و ترانس کریپتومیکس مورد بررسی قرار گرفتند، استفاده از هر دو رویکرد بینش منحصر به فردی را در مورد چگونگی مشارکت برخی ناقلین دارو در ارتباط بین بافت و محیط خارج سلولی به ما ارائه کرد. بنابراین، در حالی که متابولیت های تریپتوفان توسط هر دو ناقل در سطح سیستمیک تنظیم می شد، وظایف متابولیکی مربوط به تریپتوفان در کلیه در درجه اول به OAT1 وابسته بود.

نتایج نشان می دهد که لوله پروگزیمال ازکلیهدر جایی که OATs یافت می شود، صرفاً مجرای برای حذف کلیه متابولیت های تریپتوفان نیست. متابولیت های تریپتوفان را حس می کند و به تغییرات فراوانی درون سلولی آنها پاسخ می دهد. در مجموع، داده‌ها از این دیدگاه حمایت می‌کنند که OAT1 نه تنها در پاکسازی متابولیت‌های مرتبط با تریپتوفان از گردش خون با ترویج جذب آنها توسطکلیهبلکه این ناقل متابولیسم داخل سلولی، به ویژه متابولیسم تریپتوفان را تنظیم می کند.

این دیدگاه را پشتیبانی می‌کند که انتقال واسطه‌ای OAT{0}}کینورنین، کینورنات، آنترانیلات و N-برای میلانترانیلات برایکلیهتابع (شکل 8). این چهار متابولیت متعلق به زیرمسیر کینورنین تجزیه تریپتوفان هستند و به جز کینورنات، در تولید انرژی سلولی از طریق سنتز NAD پلاس نقش دارند (46). بنابراین، ممکن است فقدان OAT1 منجر به اختلال در متابولیسم سلولی شود که می تواند حداقل تا حدی از طریق تولید این متابولیت ها بهبود یابد.

تقریباً تمام تریپتوفان خورده شده به سه زیر مسیر اصلی متابولیزه می شود: کینورنین، سروتونین و ایندول (47، 48). علاوه بر نقش خود در تولید NAD plus، زیرمسیر کینورنین متابولیت هایی تولید می کند که عملکردهای مختلفی در هر دو حالت سالم و بیمار دارند (46، 49). مسیر سروتونین انتقال دهنده عصبی، سروتونین را تولید می کند که در بسیاری از فرآیندهای فیزیولوژیکی نقش دارد، به ویژه به عنوان تنظیم کننده عملکرد CNS (50). مسیر فرعی ایندول که با واسطه میکروبیوم روده انجام می‌شود، مولکول‌های سیگنالی تولید می‌کند که در ارتباطات میزبان-میکروبی شرکت می‌کنند (51). از نظر سیستمی، OAT1 و OAT3 فراهمی زیستی متابولیت های تریپتوفان را از هر یک از سه مسیر فرعی تعدیل می کنند، اگرچه بیشتر متابولیت ها از مسیرهای فرعی کینورنین و ایندول می آیند.

با توجه به نقش های سیگنال دهی بی شماری که متابولیت های افزایش یافته دارند، پتانسیل OAT1 و OAT3 وجود دارد که بر بسیاری از جنبه های فیزیولوژی تأثیر بگذارند. به عنوان مثال، کینورنات GPR35، یک هدف دارویی، و یک GPCR درگیر در پاسخ های التهابی و بیماری های قلبی عروقی را فعال می کند (52). بسیاری از متابولیت‌های تریپتوفان که به‌طور قابل‌توجهی تغییر یافته‌اند، همچنین لیگاندهای احتمالی گیرنده هیدروکربنی آریل (AhR) هستند (جدول 3)، یک تنظیم‌کننده رونویسی که تقریباً در تمام بافت‌هایی که به بیگانه‌بیوتیک‌ها پاسخ می‌دهند بیان می‌شود (53).

مطالعات متابولومیک دو موش ناک اوت نشان داد که یک عملکرد درون زا کلیدی OAT1 و OAT3 تنظیم سطوح سیستمیک متابولیت های تریپتوفان است. بنابراین، انتظار می رود دارویی که OAT1 و OAT3 را هدف قرار می دهد تأثیر مشابهی بر متابولوم داشته باشد. همانطور که پیش‌بینی شد، پتانسیل انتقالی موش‌های حذفی ما به‌عنوان مدل‌های DMI به‌شدت توسط نتایج انسان‌های تحت درمان با پروبنسید، یک داروی مهارکننده OAT که در سراسر جهان برای درمان نقرس استفاده می‌شود، پشتیبانی شد. تعدادی از متابولیت‌های تریپتوفان هم در سرم انسان و هم در موش‌های حذفی افزایش یافت.

بنابراین، پتانسیلی برای ترکیبات افزایش یافته در مطالعات انسانی و جوندگان وجود دارد تا به عنوان نشانگرهای زیستی برای موجودیت های دارویی جدید که ممکن است OAT1 و OAT3 را مهار کنند، استفاده شوند. در حالی که مدل‌های موش حذفی (که امید به زندگی طبیعی دارند) و انسان‌های تحت درمان با پروبنسید سالم بودند، برخی از متابولیت‌های بالا سموم اورمیک شناخته شده‌ای هستند که در سرم انسان‌هایی که از نارسایی مزمن کلیوی رنج می‌برند افزایش یافته و با پیامدهای منفی همراه است (54). ، 55). همپوشانی متابولیت‌های دخیل در جنبه‌های CKD و مطالعات ما نشان می‌دهد که OATs ممکن است نقش کلیدی در تظاهرات CKD یا پیشرفت آن داشته باشد، اگرچه ممکن است غلظت متابولیت‌ها به دلیل از دست دادن ترشح در نتیجه بافت افزایش یابد. آسیب (56، 57). CKD همچنین می‌تواند منجر به نارسایی چند ارگانی شود که بخشی از آن به دلیل تجمع سموم اورمیک است و این ممکن است تا حدی به دلیل جذب به بافت‌های دیگر از طریق انتقال‌دهنده‌های دارویی SLC و ABC باشد (12، 58).

مسیر متابولیسم تریپتوفان به عملکرد هماهنگ چندین اندام نیاز دارد. تریپتوفان توسط روده جذب می شود، توسط کبد یا سایر اندام ها اصلاح می شود و متابولیت ها در نهایت توسط روده منتقل می شوند.کلیه، تا حدی از طریق عملکرد OAT1 و OAT3. به طور معمول، این به سادگی به عنوان یک مسیر حذف در نظر گرفته می شود. نتایج ما، که نشان می دهد سلول هایکلیهبه عدم وجود این متابولیت‌ها و مولکول‌های سیگنال‌دهنده با آماده‌سازی برای تولید آنها پاسخ دهید، در غیر این صورت پیشنهاد می‌شود. اگرچه نقش خاص آنها درکلیهتوبول پروگزیمال به خوبی تعریف نشده است، واضح است که بسیاری از واسطه های تولید شده انتقال دهنده های عصبی هستند و نقش مهمی در عملکرد CNS دارند (46، 49، 59، 60). علاوه بر ارتباطات بین ارگانی، متابولیسم تریپتوفان نیز منعکس کننده ارتباط بین ارگانیسمی بین میزبان و میکروبیوم روده است. در واقع، سرم موش‌های بدون میکروب سطوح 3-ایندوکسیل سولفات، ایندولپروپیونات و سروتونین را کاهش داده است (61). علاوه بر این، مطالعات قبلی نشان داده‌اند که در سلول‌های OAT مثبت کلیوی، 3-ایندوکسیل سولفات در سیگنال‌دهی سلولی با فعال کردن AhR و تنظیم ترشح خود از طریق OAT1 عمل می‌کند (62). یافته‌های ما مبنی بر افزایش متابولیت‌های مشتق شده از روده در سرم موش‌های Oat1 KO و Oat3 KO-همراه با اثبات ما که برخی لیگاندها در شرایط آزمایشگاهی هستند، پشتیبانی بیشتری از اهمیت این ناقل‌ها در تنظیم ارتباط بین میزبان و کامنسال ارائه می‌دهد. ارگانیسم ها در مجموع، نتایج ما با تئوری سنجش از راه دور و سیگنالینگ مطابقت دارد، که پیشنهاد می‌کند انتقال‌دهنده‌های دارو و آنزیم‌های متابولیزه‌کننده دارو از طریق انتقال و اصلاح مولکول‌های کوچک برای حفظ هموستاز، در ارتباطات بین ارگانی و بین ارگانیسمی شرکت می‌کنند (63، 64). بنابراین، درک طیف عملکردهای فیزیولوژیکی درون زا ناقلین دارو به صورت سیستمی و محلی بسیار مهم است.

با بهبود داده‌های متابولومیک، متابولیت‌های تحت‌تاثیر فقدان OAT1 و OAT3 را در مدل‌های جوندگان و متابولیت‌های تحت‌تاثیر مهار OAT1 و OAT3 در انسان‌های تحت درمان با داروهای مهارکننده OAT شناسایی کردیم. گروه ما قبلاً از شبکه‌های بازسازی متابولیک برای پیش‌بینی عملکرد متابولیک استفاده کرده و چندین مسیر مشترک و منحصربه‌فرد را که توسط OAT1 و OAT3 تنظیم شده‌اند گزارش کرده‌اند (43، 65). با این حال، این مطالعات با نسخه های اولیه ابزار بازسازی و داده های متابولومیک بسیار کمی محدود شد. در اینجا، با استفاده از یک رویکرد متفاوت، تجزیه و تحلیل وظیفه متابولیک تأکید بسیار بیشتری بر نقش OAT1 در متابولیسم تریپتوفان درون سلولی قرار داد.کلیه. رویکرد ما می‌تواند برای بررسی عملکردهای درون‌زای سایر اعضای خانواده SLC و ABC و ایجاد شبکه‌های مجزا اما همپوشانی برای همه این ناقل‌کننده‌های دارو، که نه تنها در موش‌ها، بلکه در کامل و کرم‌ها نیز یافت می‌شوند، به کار رود (20، 66). چنین نمایش‌هایی همچنین درک میزان کامل DMI را برای داروهایی که با OAT1، OAT3 یا هر دو تعامل دارند، تسهیل می‌کند، که احتمالاً فراتر از رقابت ساده در سطح ناقل است.

فرایندهای تجربی

حیوانات

تمام پروتکل های آزمایشی مربوط به استفاده از حیوانات توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات سازمانی UCSD (IACUC) تایید شد. همه حیوانات مطابق با دستورالعمل های سازمانی در مورد استفاده از حیوانات زنده برای تحقیقات رفتار شدند. نرهای بالغ WT، Oat1 KO و Oat3 KO به طور جداگانه تحت یک چرخه نور-تاریکی 12- ساعت قرار گرفتند و به طور آزاد به غذا و آب دسترسی داشتند. این حیوانات در انتشارات قبلی (26، 27) توضیح داده شده است. موش های تحت درمان با پروبنسید یک تزریق داخل صفاقی روزانه 200 میلی گرم بر کیلوگرم پروبنسید یا PBS به مدت 3 روز قبل از قربانی داده شدند. تزریق نهایی 2 ساعت قبل از قربانی انجام شد. مجموعه داده های مورد استفاده برای این تحلیل نیز تا حدی شرح داده شده است (23، 24). مجموعه داده های Oat1 KO تا حدی از دیدگاه شیمی انفورماتیک مورد مطالعه قرار گرفته است، اما تجزیه و تحلیل مسیر دقیق انجام نشد (23). مجموعه داده های Oat3 KO مجددا مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و تنها دو گروه با هم مقایسه شدند (24).

مطالعات انسانی با پروبنسید

تمام پروتکل‌های آزمایشی توسط هیئت بازنگری سازمانی مورد بررسی و تایید قرار گرفتند و از اعلامیه اصول اخلاقی هلسینکی تبعیت کردند. نمونه خون کامل از 20 نفر (14 زن، 6 مرد) جمع آوری شد. میانگین سنی 98/10 ± 85/30 و میانگین BMI 52/3 ± 18/24 بود. شرکت‌کنندگانی که در طول مطالعه هیچ دارویی مصرف نمی‌کردند و رژیم‌های گیاهخواری داشتند. دوز خوراکی 1 گرم پروبنسید تجویز شد و پس از 5 ساعت، خون کامل دوباره جمع آوری شد. هر نمونه تا آنالیز متابولومیک در دمای 80- درجه منجمد نگه داشته شد.

نمونه‌های سرم انسانی بلافاصله در دمای 80- درجه نگهداری شدند و روی یخ خشک به شرکت متابولون فرستاده شدند. به طور خلاصه، برای هر نمونه، پروفایل متابولومیک هدفمند توسط Metabolon Inc انجام شد. سیستم MicroLab STAR از شرکت Hamilton برای تهیه هر نمونه استفاده شد و چندین استاندارد بازیابی برای کنترل کیفیت اضافه شد. سرم با متانول ته نشین شد و با Glen Mills GenoGrinder 2000 هم زده شد تا پروتئین ها از سرم خارج شود و مولکول های متصل به آن پروتئین ها آزاد شود. محلول به دست آمده به چهار نمونه کوچکتر جدا شد. دو با استفاده از فاز معکوس (RP) کروماتوگرافی مایع فوق عملکرد (UPLC) طیف سنجی جرمی (MS) با یونیزاسیون الکترواسپری حالت یون مثبت (ESI). یک نمونه توسط RP/UPLC-MS/MS با حالت یون منفی ESI آنالیز شد. یک نمونه توسط HILIC/UPLC-MS/MS آنالیز شد. حلال آلی با قرار دادن هر نمونه روی TurboVap (Zymark) حذف شد.

آمار

برای هر دو نمونه انسان و موش، مقادیر خام به حجم نرمال شد، تبدیل به ورود به سیستم شد، و مقادیر گمشده با کمترین مقدار مشاهده شده برای هر ترکیب جایگزین شدند. در نمونه‌های سرم انسانی، اهمیت آماری با استفاده از کنتراست‌های ANCOVA که شامل BMI و سن هستند، تعیین شد. برای نمونه‌های سرم موش، معنی‌داری با استفاده از آزمون t دو نمونه‌ای ولش با متابولیت‌هایی که به معنی‌دار آماری بودند (p کمتر یا مساوی 0). 0.05 کمتر یا مساوی p کمتر یا مساوی 0.10) در تحلیل های بعدی گنجانده شده است. غنی‌سازی با استفاده از رابطه 1 تعیین شد، که در آن k تعداد متابولیت‌های تغییر یافته قابل‌توجه در یک مسیر فرعی، m تعداد متابولیت‌ها در یک مسیر فرعی، n تعداد متابولیت‌های به‌طور قابل‌توجهی تغییر یافته در کل مجموعه داده‌ها و N تعداد متابولیت‌های تغییر یافته است. متابولیت های اندازه گیری شده در کل مجموعه داده ها

تجزیه و تحلیل وظایف متابولیک

ما از تجزیه و تحلیل وظایف متابولیک، همانطور که در ماژول CellFie در GenePattern پیاده سازی شده است، برای تعیین کمیت استفاده کردیم.کلیه هاعملکردهای متابولیک و تأثیر تغییرات ناقل OAT از داده‌های بیان ژن (41) (یعنی داده‌های ریزآرایه از کلیه‌های Oat1 KO، Oat3 KO، و کنترل‌های نوع وحشی آنها). این تجزیه و تحلیل، فعالیت مجموعه‌ای از صدها کار را که هفت فعالیت متابولیکی اصلی یک سلول (تولید انرژی، نوکلئوتید، کربوهیدرات، اسید آمینه، لیپید، ویتامین و کوفاکتور و متابولیسم گلیکان) را پوشش می‌دهد، مستقیماً از داده‌های رونویسی با استفاده از ژنوم پیش‌بینی می‌کند. مدل های مقیاس متابولیسم انسان به طور خاص، محاسبه فعالیت نسبی یک کار متابولیک (یعنی امتیاز کار متابولیک) ابتدا به پیش پردازش داده‌های رونویسی موجود و نسبت دادن امتیاز فعالیت ژن برای هر ژن متکی است (67). مدل متابولیسم انسان در مقیاس ژنوم بیشتر برای شناسایی لیستی از واکنش‌های مورد نیاز برای انجام هر کار متابولیک و با انجام این کار، برای شناسایی فهرستی از ژن‌هایی که ممکن است به کسب عملکرد متابولیک بر اساس قوانین GPR کمک کنند، استفاده می‌شود. قوانین واکنش ژن پروتئین). بنابراین، امتیاز کار متابولیک به عنوان میانگین امتیاز فعالیت تمام ژن‌هایی که در عملکرد متابولیک نقش دارند، محاسبه می‌شود. با انجام این کار، داده‌های رونویسی می‌توانند مستقیماً برای تعیین کمیت فعالیت نسبی هر عملکرد متابولیک در یک شرایط خاص استفاده شوند.

سنجش انتقال در شرایط آزمایشگاهی

جنینی انسانکلیه(HEK)-293 سلول‌هایی که OAT1 و OAT3 انسانی را به‌طور پایدار بیان می‌کنند (Solvo Biotechnology) در محیط Eagle's Modified Dulbecco (Invitrogen) با 10 درصد سرم جنین گاو و 1 درصد پنی‌سیلین/استرپتومایسین به یکدیگر متصل شدند و در 5 نگهداری شدند. درصد CO2 در دمای 37 درجه سانتیگراد. سلولهای بیان کننده OAT در حضور بلاستیدین و سلولهای بیان کننده OAT در حضور پورومایسین انتخاب شدند. هر دو رده سلولی برای آلودگی مایکوپلاسما منفی بودند. قبل از سنجش عملکردی، سلول‌ها در 96-صفحه‌های چاهک قرار داده شدند، به مدت 24 ساعت انکوبه شدند و با محیط تکمیل شدند. آزمایش‌های جذب رقابتی با انکوبه کردن سلول‌ها در محلول بافر با غلظت ثابت 10 میکرومولار6-کربوکسی فلورسین و غلظت رقیق‌شده سریالی از بستر پیشنهادی که از 2 میلی‌مولار شروع می‌شود، انجام شد. بافر پس از 10-دقیقه انکوباسیون در دمای اتاق برداشته شد و سلول ها با DPBS سه بار شستشو داده شدند. سپس فلورسانس FL با استفاده از صفحه خوان فلورسنت FL ارزیابی شد. مقادیر IC50 با استفاده از GraphPad Prism 8 تعیین شد.

مقادیر شدت فلورسنت نرمال شد به طوری که کمترین مقدار روی 0 درصد و بیشترین مقدار روی 100 درصد تنظیم شد. پس از نرمال سازی، داده ها با یک مدل غیر خطی برازش شدند و IC50 با استفاده از معادله 2 تعیین شد.

سپس Ki برای هر متابولیت با استفاده از معادله چنگ-پروسوف (معادله 3)، با کیلومتر برای سلول‌های hOAT1 HEK293 که از آزمایش‌های قبلی مشتق شده بود، محاسبه شد (68).

در دسترس بودن داده ها

تمام داده های مربوط به متابولومیک در مقاله و مطالب تکمیلی موجود است. داده‌های رونویسی در صورت درخواست از snigam@health.ucsd.edu در دسترس هستند. فرضیه، نظارت بر پروژه، طراحی آزمایش ها، و نگارش و ویرایش مقاله.

بودجه و اطلاعات تکمیلی— این کار با کمک مالی مؤسسه ملی بهداشت (NIH) به SKN از مؤسسه ملی علوم پزشکی عمومی (NIGMS) (R01GM132938) حمایت شد. پشتیبانی از JCG از طریق کمک هزینه آموزشی اعطا شده توسط موسسه ملی تصویربرداری زیست پزشکی و مهندسی زیستی (NIBIB) (T32EB009380) و مکمل R01GM132938 است. این کار تا حدی با بودجه سخاوتمندانه NIGMS به NEL (R35GM119850)، موسسه ملی آلرژی و بیماری‌های عفونی (NIAID) به NEL (UH2AI153029)، کمک هزینه تحصیلی LIFA به AR، و کمک هزینه به JMG از دولت مکزیک ( CONACYT) و موسسه دانشگاه کالیفرنیا برای مکزیک و ایالات متحده (UC-MEXUS). مسئولیت محتوا صرفاً بر عهده نویسندگان است و لزوماً بیانگر دیدگاه‌های رسمی NIH نیست. برخی از ارقام با استفاده از Biorender تولید شدند. این مقاله به خاطره ویبا بهاتناگار، MD، MPH اختصاص دارد.

تضاد علاقه— نویسندگان اعلام می کنند که هیچ گونه تضاد منافعی با محتوای این مقاله ندارند.

اختصاراتاختصارات استفاده شده عبارتند از: AhR، گیرنده هیدروکربن آریل. CKD، مزمنکلیهمرض؛ DMI، تعامل دارو و متابولیت؛ ESI، یونیزاسیون الکترواسپری؛ HEK، جنین انسانکلیه; ILA، ایندول استیک اسید؛ KO، ناک اوت؛ RP/UPLC/MS، کروماتوگرافی مایع با عملکرد فوق العاده فاز معکوس – طیف سنجی جرمی.

Cistanche tubulosa از بیماری کلیوی جلوگیری می کند، برای دریافت نمونه اینجا را کلیک کنید

از 1 دپارتمان مهندسی زیستی، 2 دپارتمان اطفال، 3 دپارتمان زیست شناسی، 4 بخش آمار زیستی و بیوانفورماتیک، دپارتمان پزشکی خانواده و بهداشت عمومی، 5 دپارتمان خانواده و پزشکی پیشگیرانه، 6NovoNordisk Foundation for Biosustainability of Santiago of andC دانشگاه کالیفرنیا سن دیگو، لا جولا، کالیفرنیا، ایالات متحده ویرایش

توسط مایک شیپستون

منابع

1. LopezNieto, CE, You, GF, Bush, KT, Barros, EJG, Beier, DR, and Nigam, SK (1997) شبیه سازی مولکولی و خصوصیات NKT، یک محصول ژنی مربوط به خانواده ناقل کاتیون های آلی که تقریباً منحصراً است. بیان شده درکلیه. جی. بیول. شیمی. 272، 6471-6478

2. Brady، KP، Dushkin، H.، Fornzler، D.، Koike، T.، Magner، F.، Her، H.، Gullans، S.، Segre، GV، Green، RM، و Beier، DR (1999 ) یک ناقل فرضی جدید به جهش استئواسکلروز (oc) نقشه می‌دهد و در موش جهش یافته OC بیان نمی‌شود. ژنومیکس 56، 254-261

3. Riedmaier, AE, Nies, AT, Schaeffeler, E., and Schwab, M. (2012) انتقال دهنده های آنیون آلی و پیامدهای آنها در فارماکوتراپی. Pharmacol. Rev. 64, 421-449

4. Ahn, SY, and Bhatnagar, V. (2008) به روز رسانی در مورد فیزیولوژی مولکولی ناقلان آنیون آلی. کر. نظر. نفرول. فشار خون بالا 17، 499-505

5. Nigam, SK (2018) خانواده ناقل SLC22: الگویی برای تأثیر ناقلین دارو بر مسیرهای متابولیک، سیگنال دهی و بیماری. آنو. کشیش فارماکول. 58، 663-687

6. Lowenstein، J.، و Grantham، JJ (2016) تولد دوباره علاقه به عملکرد لوله های کلیوی. صبح. جی. فیزیول. Renal 310, F1351–F1355

7. Govindarjan, R., and Sparreboom, A. (2016) Drug transporters: Advances and فرصت ها. کلین داروسازی آنجا 100، 398-403

8. پیشگفتار You, GF, and Morris, ME (2014). در خصوصیات مولکولی ناقلین دارو و نقش در وضعیت مواد مخدر، ویرایش دوم. دیسک دارویی ویلی سر، هوبوکن، نیوجرسی. Xix

9. Nigam, SK, Wu, W., Bush, KT, Hoenig, MP, Blantz, RC, and Bhatnagar, V. (2015) مدیریت داروها, متابولیتها و سموم اورمیک توسطکلیهانتقال دهنده های دارو با لوله پروگزیمال کلین مربا. Soc. نفرول. 10، 2039–2049

10. Bhatnagar, V., Richard, EL, Wu, W., Nievergelt, CM, Lipkowitz, MS, Jeff, J., Maihofer, AX, and Nigam, SK (2016) تجزیه و تحلیل ABCG2 و سایر ناقلان اورات در اسید اوریک هموستاز در مزمنکلیهبیماری: نقش بالقوه سنجش از دور و سیگنالینگ کلینکلیهJ. 9, 444-453 نقش OAT1 و OAT3 در متابولیسم تریپتوفان

12 J. Biol. شیمی. (2021) 296 100575

11. Nigam, SK, and Bhatnagar, V. (2018) بیولوژی سیستمی انتقال دهنده های اسید اوریک: نقش سنجش از دور و سیگنالینگ. کر. نظر. نفرول. فشار خون بالا 27، 305-313

12. Nigam, SK, and Bush, KT (2019) سندرم اورامی مزمنکلیهبیماری: تغییر سنجش از دور و سیگنالینگ. نات. کشیش نفرول. 15، 301-316

13. Saito, H. (2010) تنظیم پاتوفیزیولوژیک ناقلین سازمان SLC22A کلیه در حادکلیهآسیب: پیامدهای دارویی و سمی داروسازی درمان. 125، 79-91

14. Lepist, EI, and Ray, AS (2017) فراتر از تداخلات دارو و دارو: اثرات مهار ناقل بر روی آنتی بیوتیک ها، مواد مغذی و سموم. نظر کارشناس دارو متاب. سموم 13، 1075-1087

15. Duan, P., Li, SS, Ai, N., Hu, LQ, Welsh, WJ, and You, GF (2012) بازدارنده های قوی ناقلان آنیون آلی انسانی 1 و 3 از کتابخانه های دارویی بالینی: کشف و خصوصیات مولکولی . مول. داروسازی 9، 3340-3346

16. Evers، R.، Piquette-Miller، M.، Polli، JW، Russel، FGM، Sprowl، JA، Tohyama، K.، Ware، JA، de Wildt، SN، Xie، W.، Brouwer، KLR، و کنسرسیوم، IT (2018) تغییرات مرتبط با بیماری در ناقلین دارو ممکن است بر فارماکوکینتیک و/یا سمیت داروها تأثیر بگذارد: یک مقاله سفید از کنسرسیوم حمل و نقل بین المللی. کلین داروسازی Ther.104، 900–915

17. Masereeuw, R., Mutsaers, HA, Toyohara, T., Abe, T., Jhawar, S., Sweet, DH, and Lowenstein, J. (2014) Theکلیهو حذف سم اورمیک: گلومرول یا توبول؟ سمین. نفرول. 34، 191-208

18. لیو، ی.، پرنتیس، کی جی، اورسلی، جی، هو، سی، باتچولون، بی.، لیوی، ک.، هنسن، جی بی، وی، دی دبلیو، کاکس، بی، دای، FHF، جیا، WP و Wheeler، MB (2016) افزایش سریع CMPF ممکن است به عنوان نقطه عطفی در توسعه دیابت عمل کند. Cell Rep. 14, 2889-2900

19. پرنتیس، کی جی، لو، ال.، آلیستر، EM، لیو، ی.، جون، LS، اسلوپ، KW، هاردی، AB، وی، ال.، جیا، WP، Fantus، IG، Sweet، DH، Sweeney , G., Retnakaran, R., Dai, FF, and Wheeler, MB (2014) متابولیت اسید چرب فوران CMPF در دیابت افزایش می یابد و باعث ایجاد اختلال در عملکرد سلول های بتا می شود. سلول متاب. 19، 653-666

20. Engelhart, DC, Granados, JC, Shi, D., Saier, MH, Jr., Baker, ME, Jr., Abagyan, R., and Nigam, SK (2020) تجزیه و تحلیل زیست شناسی سیستم ها هشت زیر گروه ناقل SLC22 را نشان می دهد. از جمله OATs، OCTs، و OCTNs.Int. جی. مول. علمی 21، 1791