FOXO بیان پپتیدهای ضد میکروبی را تنظیم می کند و باعث تقویت فاگوسیتوز هموسیت ها در ایمنی ضد باکتریایی میگو می شود.

خلاصه

بی مهرگان برای مقاومت در برابر عفونت های بیماری زا به ایمنی ذاتی از جمله ایمنی هومورال و سلولی متکی هستند. مطالعات قبلی نشان داد که فاکتور رونویسی جعبه چنگال O (FOXO) در پاسخ های ایمنی مخاطی پستانداران و تنظیم ایمنی هومورال روده بی مهرگان شرکت می کند. با این حال، اینکه آیا FOXO در تنظیم ایمنی سیستمیک و سلولی در بی مهرگان نقش دارد ناشناخته باقی مانده است. در مطالعه حاضر، ما یک FOXO را از میگو (Marsupenaeus japonicus) شناسایی کردیم و دریافتیم که در میگوهای معمولی در سطوح نسبتاً پایه بیان می شود، اما در میگوهایی که توسط Vibrio anguillarum به چالش کشیده شده اند، به طور قابل توجهی تنظیم مثبت شده است. FOXO با ترویج بیان Relish، عامل رونویسی مسیر نقص ایمنی (IMD) برای بیان پپتیدهای ضد میکروبی (AMPs) در میگو، نقش مهمی در حفظ هموستاز همولنف و میکروبیوتای روده ایفا کرد. ما همچنین دریافتیم که عفونت پاتوژن FOXO را فعال کرده و با کاهش فعالیت سرین/ترئونین کیناز AKT باعث انتقال هسته‌ای آن می‌شود. در هسته، FOXO فعال شده به طور مستقیم بیان ژن های هدف Amp و Relish خود را در برابر عفونت باکتریایی تنظیم می کند. علاوه بر این، FOXO با ترویج فاگوسیتوز هموسیت ها از طریق تنظیم بیان گیرنده جابجایی گیرنده فاگوسیتوتیک C (Src) و دو GTPase کوچک Rab5 و Rab7 که به طور مستقیم به قاچاق فاگوزوم مرتبط هستند، در ایمنی سلولی نقش دارد. در سیتوپلاسم در مجموع، نتایج ما نشان داد که FOXO با فعال کردن مسیر IMD در میگوهای طبیعی، و به طور مستقیم یا غیرمستقیم بیان AMP و افزایش فاگوسیتوز هموسیت ها در برابر عوامل بیماری زا در میگوهای آلوده به باکتری، اثرات خود را بر روی هموستاز همولنف و میکروبیوتای روده ای اعمال می کند. این مطالعه عملکردهای مختلف FOXO را در ایمنی ضد باکتریایی مخاطی (محلی) و سیستمیک بی مهرگان نشان داد.

مزایای مکمل سیستانچ-چگونه سیستم ایمنی بدن را تقویت کنیم

برای مشاهده محصولات Cistanche Enhance Immunity اینجا را کلیک کنید

【بیشتر بخواهید】 ایمیل:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

معرفی

پروتئین‌های خانواده O فاکتور رونویسی جعبه چنگال (FOXO) در فرآیندهای حیاتی بیولوژیکی مختلف موجودات، از جمله تنظیم چرخه سلولی، ترمیم DNA آسیب‌دیده، ایمنی ضد سرطانی و تنظیم طول عمر نقش دارند [1،2]. پستانداران دارای چهار پروتئین مختلف FOXO هستند (FOXO1، FOXO3، FOXO4 و FOXO6). با این حال، بی مهرگان فقط یک FOXO دارند که در Caenorhabditis elegans [3] به نام دف نیز شناخته می شود. فعالیت رونویسی FOXO توسط انواع مختلفی از تغییرات پس از ترجمه، مانند فسفوریلاسیون، استیلاسیون، متیلاسیون و یوبی کوئیتیناسیون تنظیم می شود [4]. این تغییرات بر جابجایی هسته ای FOXO یا خروج از هسته و برهمکنش آن با سرکوبگرها و فعال کننده های کمکی تأثیر می گذارد، که می تواند فعالیت FOXO را ارتقا یا کاهش دهد و عملکردهای مختلف بیولوژیکی آن را واسطه کند [5،6]. پس از فعال‌سازی، FOXO در بسیاری از عملکردهای فیزیولوژیکی با تنظیم رونویسی انواع ژن‌های هدف شرکت می‌کند [7]. FOXO ها توسط محرک های خارج سلولی مختلف از جمله فاکتورهای رشد، سیتوکین ها و هورمون ها فعال می شوند [8]. سیگنال‌های رشد، مانند انسولین یا فاکتور رشد شبه انسولین 1 (IGF{19}})، با گیرنده‌های مسیر انسولین تعامل می‌کنند و سیگنال‌دهی فسفاتیدیل‌لینوزیتول 3-کیناز (PI3K) را فعال می‌کنند که منجر به فسفوریلاسیون FOXO توسط سرین/ترئونین کیناز، پروتئین کیناز B (AKT) [9]. FOXO فسفریله شده از هسته به سیتوزول منتقل می شود، یا از انتقال آن از سیتوزول به هسته جلوگیری می کند، جایی که یوبیکوئیتین می شود و منجر به تخریب آن توسط پروتئازوم می شود [10]. در مقابل، در غیاب سیگنال‌های رشد خارجی، مسیر سیگنال‌دهی PI3K-AKT غیرفعال است و FOXO فسفریله نشده به هسته منتقل می‌شود تا رونویسی ژن هدف را تقویت کند [11]. FOXO همچنین در پاسخ های ایمنی ذاتی ضد باکتریایی و ضد ویروسی بی مهرگان شرکت می کند [12،13]. فعال شدن مزمن FOXO در روده های پیر مگس سرکه بیان پروتئین شناسایی پپتیدوگلیکان SC2 (تنظیم کننده منفی مسیر کمبود ایمنی (IMD)) را سرکوب می کند و هموستاز ایمنی روده را می شکند [14]. FOXO مستقیماً ژن‌های پپتید ضد میکروبی (AMP) را در بافت‌های اپیتلیال مگس سرکه غیر آلوده در پاسخ به استرس گرسنگی تنظیم می‌کند، که مستقل از مسیرهای ایمنی ذاتی پاسخ‌دهنده به پاتوژن است [15]. با این حال، عفونت پاتوژن همچنین می تواند انتروسیت FOXO را وادار کند تا مستقیماً در روده های مگس سرکه از سیتوپلاسم وارد هسته شود [12]. تنظیم وابسته به FOXO AMPs در بافت‌های اپیتلیال پستانداران نیز اتفاق می‌افتد، که نشان می‌دهد این به طور تکاملی در حیوانات حفظ می‌شود [16]. چندین مطالعه نشان داد که FOXO ها توسط پاتوژن ها یا تحریک سیتوکین در پاسخ های ایمنی مخاطی فعال می شوند [17]. انتقال آنها به هسته و اتصال به پروموترهای ژن های هدف آنها توسط مسیر کیناز پروتئین فعال شده با میتوژن (MAP) تحریک شده و توسط مسیر PI3K/AKT مهار می شود. ژن‌های هدف FOXOها شامل مولکول‌های سیگنال‌دهنده پیش‌التهابی، مولکول‌های چسبنده و گیرنده‌های کموکاین هستند [17]. اینکه آیا FOXO ها در پاسخ های ایمنی سیستمیک در برابر پاتوژن ها دخیل هستند یا خیر هنوز مشخص نیست. ترویج بیان AMP ها در برابر پاتوژن ها یک مکانیسم مهم ایمنی ذاتی هومورال در بی مهرگان است [18]. در ایمنی ذاتی مگس سرکه، مسیرهای Toll و IMD در تنظیم بیان AMP نقش دارند و AMPها نقش مهمی در از بین بردن پاتوژن های مهاجم دارند [19-21]. مشابه ایمنی حشرات، مبدل سیگنال Toll، IMD و Janus kinase (JAK) و مسیرهای فعال کننده رونویسی (STAT) در تنظیم بیان AMP در سخت پوستان نقش دارند [22،23]. اینکه آیا FOXO می‌تواند بیان AMPها را مستقل از مسیرهای Toll، IMD و JAK/STAT در برابر عفونت پاتوژن‌ها در سخت‌پوستان تنظیم کند، نیاز به توضیح دارد. علاوه بر ایمنی هومورال، بی مهرگان به ایمنی سلولی نیز برای انجام عملکردهای ایمنی ذاتی در برابر عفونت پاتوژن متکی هستند. فاگوسیتوز توسط هموسیت ها یکی از مکانیسم های مهم برای ایمنی سلولی در برابر عفونت پاتوژن است [24]. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که اتوفاژی با واسطه FOXO برای رشد سلول‌های کشنده طبیعی (NK) مورد نیاز است [25]. علاوه بر این، FOXO در ترویج فاگوسیتوز باکتریایی توسط نوتروفیل ها نقش دارد [26]. اگرچه هیچ سلول ایمنی تخصصی در سخت پوستان، مانند سلول‌های NK یا نوتروفیل‌ها وجود ندارد، هموسیت‌های میگو می‌توانند از طریق فاگوسیتوز ایمنی ذاتی سیستمیک را در برابر عفونت باکتری‌های بیماری‌زا اعمال کنند [27]. با این حال، اینکه آیا FOXO در فاگوسیتوز پاتوژن هموسیت ها در میگو شرکت می کند، مشخص نیست. آبزی پروری میگو یکی از صنایع با رشد سریع در تولید پروتئین های حیوانی در جهان است و سهم قابل توجهی در تامین تقاضای فزاینده جهانی برای پروتئین های حیوانی داشته است. در حال حاضر تولید جهانی میگو تقریباً 4.88 میلیون تن با ارزشی در حدود 39 میلیارد دلار است [28]. با این حال، پرورش تعداد زیادی از حیوانات با هم منجر به استرس قابل توجهی در حیوانات می‌شود که عوامل بیماری‌زا از جمله باکتری‌ها و ویروس‌ها، تکثیر و بیماری‌های بالینی را تسهیل می‌کند که منجر به خسارات اقتصادی زیادی به صنعت می‌شود [29]. مطالعات مکانیسم‌های ایمنی میگو می‌تواند استراتژی‌های جدیدی برای پیشگیری و کنترل بیماری ارائه دهد [30]. در مطالعه حاضر، ما یک FOXO را در میگو کوروما (Marsupenaeus japonicus) شناسایی کردیم. پس از کاهش بیان Foxo، به دنبال چالش Vibrio anguillarum، متوجه شدیم که توانایی پاکسازی باکتریایی و میزان بقای میگو به طور قابل توجهی کاهش یافته است. مطالعه بیشتر نشان داد که FOXO بیان AMP ها را به طور مستقیم یا غیرمستقیم ترویج می کند و فاگوسیتوز باکتری ها را در میگو افزایش می دهد. مکانیسم‌های احتمالی اثرات FOXO در برابر عفونت پاتوژن در میگو مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

نتایج

FOXO در سطوح پایه در میگوهای بدون چالش بیان می شود و در میگوهایی که با V. anguillarum به چالش کشیده شده اند تنظیم مثبت می شود.

از توالی یابی رونوشت هموسیتی M. japonicus، توالی cDNA تمام طول Foxo را به دست آوردیم (شماره دسترسی GenBank: MW080526). مقایسه دامنه نشان داد که پروتئین FOXO پیش‌بینی‌شده دارای یک دامنه Forkhead (FH) است که مشابه Homosapiens FOXO از جمله FOXO1، FOXO3، FOXO4 و FOXO6 است و دارای فسفوریلاسیون AKT مشابهی است (شکل S1A). نتایج آنالیز فیلوژنتیکی نشان داد که FOXOها به دو خوشه شامل FOXOهای مهره داران و بی مهرگان و FOXO میگو در شاخه بی مهرگان در درخت فیلوژنتیک دسته بندی شدند (شکل S1B). مشابه FOXOهای انسانی [31]، FOXO میگو دارای مکان‌های اصلاح فسفوریلاسیون کیناز تنظیم‌شده خارج سلولی (ERK) و مکان‌های اصلاح استیلاسیون پروتئین اتصال CREB (CBP) است، اما سایت‌های اصلاح deacetylation Sir tuin 1 (SIRT1) و C-JUN را ندارد. مکان های اصلاح فسفوریلاسیون کیناز (JNK) (شکل S2). آنتی بادی های پلی کلونال شناسایی FOXO میگو با استفاده از دامنه FH نوترکیب FOXO بیان شده در اشریشیا کلی (شکل 1A) تهیه شد. تجزیه و تحلیل توزیع بافتی FOXO در سطوح mRNA و پروتئین نشان داد که در تمام بافت های آزمایش شده بیان می شود (شکل 1B). دوره زمانی بیان FOXO در هموسیت ها و روده میگو که توسط V. anguillarum به چالش کشیده شده اند با استفاده از qPCR و وسترن بلات مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که FOXO در هموسیت ها و روده ها در سطح mRNA (شکل 1C و 1D) و در سطح پروتئین (شکل 1E و 1F) تنظیم مثبت شد. این نتایج نشان داد که FOXO در پاسخ به عفونت V. anguillarum نقش دارد و ما را بر آن داشت تا عملکرد FOXO را در ایمنی میگو بررسی کنیم.

FOXO در تنظیم هموستاز همولنف و میکرو فلور روده در میگوی سالم شرکت می کند.

برای بررسی عملکرد FOXO در هموستاز همولنف و میکرو فلور روده در میگو، تداخل RNA انجام شد و بار باکتریایی آنالیز شد. نتایج نشان داد که بیان Foxo به طور قابل توجهی در میگو Foxo-RNAi کاهش یافت (شکل 2A و 2B). اثرات خارج از هدف Foxo RNAi نیز با تشخیص بیان ژن‌های دیگر خانواده فاکس (از جمله Foxk2 و Foxn3) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نتایج نشان داد که شکست Foxo سطوح بیان Foxk2 یا Foxn3 را کاهش نداد (شکل S3A-S3C). با استفاده از وسترن بلات و سنجش ایمونوسیتوشیمی فلورسنت، ما بیشتر توزیع درون سلولی FOXO را در روده‌ها و هموسیت‌های میگو که توسط باکتری‌ها پس از خاموش شدن Foxo به چالش کشیده شده‌اند، مشاهده کردیم. نتایج نشان داد که در مقایسه با گروه dsGfp، سطح FOXO در هسته به طور قابل توجهی در میگو Foxo-RNAi کاهش یافت، حتی اگر میگو توسط V. anguillarum (انجیر S3D-S4E') آلوده شده بود. همه نتایج فوق نشان می‌دهد که سنجش Foxo RNAi ما می‌تواند به طور خاص Foxo را در هموسیت‌ها و روده‌ها (از جمله در سیتوپلاسم و هسته) خاموش کند. در مرحله بعد، بار باکتریایی را در همولنف و روده پس از ناک داون Foxo در میگو در شرایط عادی (بدون چالش باکتریایی) بررسی کردیم. نتایج نشان داد که تعداد باکتری‌ها در همولنف و روده‌ها پس از شکسته شدن بیان Foxo به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل 2C و 2D). ما بیشتر میزان بقای میگوی Foxo-RNAi را بدون چالش باکتریایی مورد تجزیه و تحلیل قرار دادیم و نتایج نشان داد که میزان بقای میگوی Foxo-knockdown در مقایسه با شاهد به طور قابل توجهی کاهش یافته است (شکل 2E). برای تأیید بیشتر این نتایج، میزان بقای میگوی Foxo-RNAi تیمار شده با آنتی بیوتیک را تجزیه و تحلیل کردیم و نتایج نشان داد که در مقایسه با گروه dsGfp، میزان بقای میگوی بدون میکروب به طور قابل توجهی کاهش پیدا نکرد (شکل 2F). همه نتایج نشان داد که FOXO در هموستاز میکروبیوتای درون تنی (از جمله میکروبیوتای همولنف و روده) در میگو در شرایط عادی نقش دارد.

مزایای مکمل سیستانچ - افزایش ایمنی

FOXO در تنظیم هموستاز همولنف و میکرو فلور روده با تقویت بیان Relish و Amp در میگوی سالم شرکت می کند.

مطالعات قبلی نشان می‌دهد که میگوی سالم دارای تعداد کم اما پایدار باکتری در همولنف در گردش، و مقادیر زیاد و البته ثابت باکتری در دستگاه گوارش و عوامل ایمنی مانند پپتیدهای ضد میکروبی (AMPs) تنظیم شده توسط فاکتور هسته‌ای کاپا B (NF) است. -κB) مسیر و گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) که توسط مسیر اکسیداز دوگانه (DUOX) تنظیم می‌شوند، نقش اساسی در همولنف هموستاز و میکروبیوتای روده ایفا می‌کنند [32-34]. برای بررسی مکانیسم دخالت FOXO در تنظیم هموستاز همولنف و میکرو فلور روده در شرایط عادی، ابتدا توزیع درون سلولی FOXO را در هموسیت‌ها و روده‌ها در شرایط عادی شناسایی کردیم. نتایج سیگنال ضعیفی از FOXO را در هسته هموسیت‌های میگو و سلول‌های روده در شرایط عادی نشان داد (شکل 3A و 3B)، که نشان می‌دهد کمی FOXO توسط میکروبیوتای in vivo در میگو در شرایط عادی فعال می‌شود. بیان AMP توسط مسیر IMD در روده مگس سرکه تنظیم می شود [35]. بنابراین، ما فرض کردیم که عامل رونویسی Relish ممکن است یک ژن هدف FOXO باشد. ما بیان mRNA Relish، فاکتور رونویسی مسیر IMD را در هموسیت‌ها و روده‌های میگو پس از نابودی Foxo شناسایی کردیم. نتایج نشان داد که بیان Relish به طور قابل توجهی در میگوی Foxo-knockdown کاهش یافت (شکل 3C و 3D)، و نتایج مشابهی در سطح پروتئین به دست آمد (شکل 3E و 3E'). نتایج نشان داد که FOXO می‌تواند بیان Relish را تقویت کرده و مسیر IMD را فعال کند. برای تأیید اینکه FOXO در هموستاز هموستاز دستگاه گوارش و هموستاز دستگاه گوارش از طریق سیگنال دهی IMD شرکت می کند، میگوهای بدون میکروب به دست آمد (شکل 3F) و فعال سازی RELISH و بیان AMP شناسایی شدند. در مقایسه با گروه شاهد، مقدار FOXO و RELISH در هسته سلول های روده و هموسیت ها به طور قابل توجهی کاهش یافت (شکل 3G و 3H). در همین حال، بیان AMPها، از جمله Crustins (CrusI-2 تا 5) و عوامل ضد لیپوپلی ساکارید (Alf A1، B1، C1، D1 و E1)، که احتمالاً توسط FOXO و/یا RELISH تنظیم می‌شوند، در میکروب غربالگری شد. میگوی آزاد و نتایج نشان داد که بیان CrusI{24}}، Alf-B1 و Alf-C1 به طور قابل توجهی در هموسیت ها و روده میگو کاهش یافته است (شکل 3I و 3J). با توجه به اینکه بیان Alf-B1 و Alf C1 توسط مسیر IMD [36] تنظیم می‌شود، این نتایج نشان می‌دهد که FOXO در تنظیم هموستاز همولنف و دستگاه گوارش تحت شرایط عادی از طریق مسیر IMD برای ارتقای بیان شرکت می‌کند. AMP ها

شکل 1. FOXO در میگوهایی که توسط V. anguillarum به چالش کشیده شده بودند، تنظیم مثبت شد. (الف) بیان نوترکیب دامنه FH FOXO در E. coli و وسترن بلات برای تشخیص FOXO با استفاده از آنتی بادی های پلی کلونال علیه FOXO تهیه شده در خرگوش. خط 1، کل پروتئین E. coli با Foxo-pGEX4T{4}}. خط 2، کل پروتئین های باکتری پس از القای IPTG. خط 3، FOXO نوترکیب خالص شده. خط 4، FOXO در روده میگوهای درمان نشده با استفاده از وسترن بلات شناسایی شد. M، نشانگرهای جرم مولکولی پروتئین. (B) توزیع بافتی Foxo در سطوح mRNA (پانل بالایی) و پروتئین (پانل پایینی) به ترتیب با RT-PCR و وسترن بلات شناسایی شد. ACTB مخفف -actin است. (C, D) الگوهای بیان mRNA Foxo در هموسیت‌ها (C) و روده‌ها (D) توسط qPCR با استفاده از میانگین هندسی بیان -اکتین و Ef{11}} به‌عنوان ژن‌های کنترل درون‌زا آنالیز شدند. (E, F) الگوهای بیان پروتئین FOXO در هموسیت ها (E) و روده ها (F) با وسترن بلات شناسایی شد. نتایج تجزیه و تحلیل آماری سه تکرار در پانل های پایین نشان داده شد. باندهای روی وسترن بلات با استفاده از نرم افزار ImageJ با اسکن باندها از سه تکرار مستقل دیجیتالی شدند. سطح بیان نسبی FOXO/-actin به عنوان میانگین ± انحراف معیار بیان شد و مقدار میگوی شاهد یک تعیین شد. نوارهای خطا در شکل نشان دهنده SD (سه تکرار) است.

FOXO در میگو توسط چالش V. anguillarum فعال می شود و در پاکسازی پاتوژن همولنف و روده شرکت می کند.

گزارش شده است که FOXO را می توان با تحریک باکتری یا سیتوکین فعال کرد و به هسته منتقل می شود تا بیان ژن های هدف خاص در پستانداران را تنظیم کند [17]. برای تشخیص اینکه آیا FOXO در میگوهای به چالش کشیده شده توسط باکتری ها فعال شده است یا خیر، توزیع درون سلولی FOXO در روده میگو با استفاده از وسترن بلات مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نتایج نشان داد که مقدار FOXO در سیتوپلاسم سلول های روده به تدریج از 2 تا 4 ساعت پس از چالش V. anguillarum کاهش یافت (شکل 4A). در مقابل، مقدار FOXO در هسته سلول های روده پس از عفونت با V. anguillarum به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل 4B). برای تجزیه و تحلیل نقش FOXO در ایمنی سیستمیک، یک روش ایمونوسیتوشیمیایی فلورسنت برای مشاهده جابجایی هسته‌ای FOXO در هموسیت‌های میگو 2 ساعت پس از V. تحریک سالانه لاروم استفاده شد. ما دریافتیم که انتقال FOXO ناشی از چالش باکتری به هسته به طور قابل توجهی افزایش یافته است، اما هیچ تغییر آشکاری در میگوهای به چالش کشیده شده با PBS وجود ندارد (شکل 4C و 4C'). برای بررسی اینکه آیا FOXO انتقال یافته هسته ای در پاکسازی پاتوژن نقش دارد، ما بار باکتریایی در همولنف و روده را در میگوی Foxo-knockdown در 6 ساعت پس از چالش باکتریایی تجزیه و تحلیل کردیم. ما دریافتیم که پس از نابودی Foxo، بار باکتری در همولنف و روده در مقایسه با گروه کنترل به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل 4D). علاوه بر این، میزان بقای میگوی Foxo-knockdown آلوده به V. anguillarum به طور قابل توجهی در مقایسه با شاهد کاهش یافت (شکل 4E). این نتایج نشان داد که FOXO در سلول‌های روده و هموسیت‌ها فعال می‌شود و پیشنهاد می‌کند که FOXO در پاسخ‌های ایمنی موضعی و سیستمیک در برابر عفونت باکتریایی شرکت می‌کند.

شکل 2. FOXO در پاسخ های ایمنی ضد باکتریایی روده ای (محلی) و سیستمیک شرکت می کند. (A, B) کارایی Foxo-RNAi در هموسیت‌ها (A) و روده (B) میگو، همانطور که با استفاده از qPCR (A) و وسترن بلات (B) تعیین شد. تجزیه و تحلیل تاریخ qPCR با استفاده از میانگین هندسی بیان -اکتین و Ef{3}} به عنوان ژن‌های کنترل درون‌زا. نوارهای خطا SD ها را نشان می دهند. (C) تشخیص باکتری همولنف میگو Foxo-knockdown با کشت جامد LB (سه تکرار). تزریق dsGfp به عنوان کنترل استفاده شد. نسبت رقت 1:10 بود. (د). تعداد باکتری ها در همولنف و روده در میگوهای Foxo knockdown و میگوهای تزریقی dsGfp بدون چالش باکتریایی. (E). میزان بقای میگوی Foxo-RNAi بدون چالش باکتریایی تزریق dsGfp به عنوان کنترل استفاده شد. (F). میزان بقای میگوی Foxo-RNAi تحت درمان با آنتی بیوتیک از تزریق dsGfp به عنوان کنترل استفاده شد. طبیعی: میگوهای نوع وحشی با آنتی بیوتیک درمان نمی شوند.

شکل 3. مقدار پایه FOXO به هسته هموسیت ها و سلول های روده منتقل می شود، بیان Relish را تقویت می کند و متعاقباً مسیر IMD را برای تنظیم هموستاز همولنف و میکروبیوتای روده در شرایط عادی فعال می کند. (الف) ایمونوسیتوشیمی برای تشخیص توزیع درون سلولی FOXO در هموسیت‌های میگوی طبیعی استفاده شد. نوار مقیاس=20 میکرومتر. Cy: سیتوپلاسم; شماره: هسته. (B) وسترن بلات برای تشخیص توزیع درون سلولی FOXO در سلول های روده از میگوهای طبیعی و میگوهای آلوده به V. anguillarum استفاده شد. (C) بیان Relish در سطح mRNA در هموسیت‌های میگو پس از حذف Foxo توسط qPCR با استفاده از میانگین هندسی بیان -اکتین و Ef{4}} به عنوان ژن‌های کنترل درون‌زا شناسایی شد. (د) بیان Relish در سطح mRNA در روده میگو پس از نابودی Foxo توسط qPCR با استفاده از میانگین هندسی بیان -اکتین و Ef{6}} به عنوان ژن‌های کنترل درون‌زا شناسایی شد. (E) سطح RELISH با استفاده از وسترن بلات در میگو پس از ناک دان کردن Foxo تشخیص داده شد. (E') سه تکرار از پانل E با استفاده از نرم افزار ImageJ دیجیتالی شد. (F) بار باکتریایی همولنف و روده در میگو 24 ساعت پس از درمان آنتی بیوتیکی. (G) FOXO در هسته با استفاده از وسترن بلات در هموسیت ها و روده میگو 24 ساعت پس از درمان با آنتی بیوتیک شناسایی شد. (H) RELISH در هسته با استفاده از وسترن بلات در هموسیت ها و روده میگو در 24 ساعت پس از درمان با آنتی بیوتیک تشخیص داده شد. (I, J) بیان آمپر در هموسیت (I) و روده (J) میگوی بدون میکروب با استفاده از qPCR با استفاده از -اکتین و Ef{14}} به عنوان ژن مرجع داخلی تعیین شد. میگوی معمولی (تزریق H2O) به عنوان شاهد استفاده شد.

مطالعات قبلی نشان داد که فعالیت رونویسی FOXO با اصلاح فسفوریلاسیون تنظیم می‌شود و سرین/ترئونین کیناز AKT فعالیت فاکتورهای رونویسی Forkhead را با فسفریله کردن آنها و مهار انتقال نامشخص آنها تنظیم می‌کند [9،37]. برای بررسی اینکه آیا افزایش FOXO در هسته پس از عفونت باکتری های بیماری زا تحت تأثیر AKT قرار می گیرد، ابتدا محتوای FOXO را در سیتوپلاسم و هسته با وسترن بلات پس از نابودی Akt میگو شناسایی کردیم. نتایج نشان داد که مقدار FOXO در هسته هموسیت‌ها و سلول‌های روده پس از از بین رفتن بیان Akt (شکل 5A و 5B) در میگو 2 ساعت پس از عفونت با V. anguillarum به طور قابل‌توجهی افزایش یافت (شکل 5C و 5C'). برای تأیید نتایج تجربی، ما همچنین از یک روش ایمونوسیتوشیمی برای مشاهده توزیع درون سلولی FOXO در هموسیت‌های میگو پس از نابودی Akt استفاده کردیم. نتایج نشان داد که FOXO به طور قابل‌توجهی در هسته هموسیت‌ها افزایش می‌یابد زمانی که Akt 2 ساعت پس از عفونت با V. anguillarum را از بین برد (شکل 5D و 5D'). برای بررسی اینکه آیا عفونت پاتوژن بر فعالیت AKT تأثیر می گذارد، ما تغییر فسفوریلاسیون AKT را پس از عفونت پاتوژن با استفاده از آنتی بادی p-AKT انسانی (Ser473) شناسایی کردیم (محل فسفوریلاسیون میگو AKT Ser486 است) و دریافتیم که سطح AKT فسفریله شده به طور قابل توجهی کاهش یافته است. هموسیت ها و روده های میگو پس از 30 دقیقه عفونت V. anguillarum (شکل 5E و 5F). این نتایج نشان داد که عفونت پاتوژن می تواند سطح AKT فسفریله شده را کاهش دهد، که فعالیت آنزیم را مهار می کند و توانایی AKT را برای فسفریله کردن FOXO کاهش می دهد. FOXO غیر فسفریله شده وارد هسته می شود و بیان ژن های هدف خود را القا می کند. شکل SD ها را نشان می دهد.

عصاره سیستانچ

عفونت پاتوژن فعالیت AKT را کاهش می دهد و باعث انتقال هسته ای FOXO می شود

FOXO با تنظیم بیان پپتیدهای ضد میکروبی در میگوهای آلوده به باکتری، دفاع ایمنی را در برابر باکتری های مهاجم اعمال می کند.

برای کشف مکانیسمی که توسط آن FOXO بر پاسخ در برابر عفونت باکتریایی در میگو تأثیر می گذارد، ابتدا ژن های عامل ایمنی تنظیم شده توسط FOXO را شناسایی کردیم. پس از شکست موفقیت آمیز Foxo در هموسیت ها و روده میگو با یا بدون چالش V. anguillarum، سطح بیان CrusI-3، Alf-B1، Alf-C1 و Alf-E1 به طور قابل توجهی در میگو خاموش شده کاهش یافت. با افراد گروه کنترل (شکل 6A و 6B). برای بررسی بیشتر نتایج، ما همچنین بیان چهار AMP را پس از شکست Akt شناسایی کردیم. نتایج نشان داد که بیان چهار AMP به طور قابل توجهی 6 ساعت پس از عفونت لارو V. anguil در مقایسه با گروه کنترل افزایش یافت (شکل 6C و 6D). در مقایسه با AMP های تنظیم شده (از جمله Alf-B1 و Alf-C1) در شرایط عادی (شکل 3I و 3J)، ژن اضافی AMPs (CrusI{18}}، Alf-E1) نیز در میگوهای آلوده به V تنظیم مثبت شد. anguillarum (شکل 6A و 6B). مطالعه قبلی ما نشان داد که RELISH بیان Alf-B1 و Alf-C1 را در میگو تقویت کرد [36]. این نتایج نشان می‌دهد که FOXO ممکن است مستقیماً بیان AMP مانند CrusI-3 و Alf-E1 را مستقل از مسیر سیگنالینگ IMD تنظیم کند. برای تایید این فرضیه، یک سنجش تراشه برای تشخیص اینکه آیا FOXO می‌تواند به پروموتر Alf-E1 متصل شود، انجام شد. توالی پروموتر Alf-E1 به دست آمد (شکل S4) و مکان های اتصال FOXO پیش بینی شد (شکل 6E). نتیجه تراشه نشان داد که FOXO می تواند به پروموتر Alf-E1 متصل شود (شکل 6F). این نتایج نشان می دهد که FOXO همچنین با تنظیم مستقیم بیان AMPs در میگو در ایمنی ضد باکتریایی شرکت می کند.

شکل 4. FOXO به هسته میگو منتقل شده توسط V. anguillarum. (A، B) الگوهای توزیع FOXO در سیتوپلاسم (A) و هسته (B) سلول‌های روده میگو که توسط باکتری‌ها به چالش کشیده شده‌اند، همانطور که با استفاده از وسترن بلات (پانل‌های پایین‌تر A و B) آنالیز شد. باندهای وسترن بلات با استفاده از نرم افزار ImageJ با اسکن باندها از سه تکرار دیجیتالی شدند. سطح بیان نسبی FOXO/-actin یا FOXO/Histone 3 به عنوان میانگین ± SD بیان شد و مقدار میگوی شاهد یک تعیین شد. (C) انتقال هسته ای FOXO در هموسیت های میگو 2 ساعت پس از V. چالش anguillarum با استفاده از سنجش ایمونوسیتوشیمی فلورسنت تشخیص داده شد. از تزریق PBS به عنوان کنترل استفاده شد. نوار مقیاس=20 میکرومتر. (C') تجزیه و تحلیل آماری پانل C کولوکالیزاسیون هسته‌های رنگ‌آمیزی شده با FOXO و DAPI در هموسیت‌ها توسط نرم‌افزار WCIF ImageJ آنالیز شد. (د) تعداد باکتری در همولنف و روده میگو Foxo-knockdown به دنبال تزریق V. anguillarum. از تزریق dsGfp در میگو به دنبال تزریق باکتری به عنوان شاهد استفاده شد. (E) میزان بقای میگو Foxo-RNAi آلوده به V. anguillarum. تزریق dsGfp به عنوان کنترل استفاده شد.

FOXO با افزایش بیان SRC، فاگوسیتوز هموسیت ها را در برابر باکتری ها ترویج می کند

مطالعات قبلی گزارش کرده اند که FOXO به طور مستقیم با نواحی پروموتر CXCR2 و CD11b برای تنظیم فاگوسیتوز نوتروفیل ها در پستانداران تعامل دارد [26]. برای آزمایش اینکه آیا FOXO با فاگوسیتوز هموسیتی در ایمنی ضد باکتریایی میگو مرتبط است، ما میزان فاگوسیتی را پس از تداخل با Foxo با استفاده از روش‌های مختلف بررسی کردیم. پس از نابودی Foxo، میزان فاگوسیتوز و شاخص فاگوسیتوز گروه Foxo-knockdown به طور قابل توجهی کمتر از گروه کنترل (dsGfp) بود (شکل 7A و 7A'). ما همچنین از فلوسیتومتری برای تعیین کمیت میزان فاگوسیتوز هموسیت ها پس از خاموش شدن Foxo استفاده کردیم. نتایج نشان داد که میزان سیتوز فاژ در گروه Foxo-RNAi نیز به طور قابل توجهی در مقایسه با گروه dsGfp کاهش یافت (شکل 7B و 7B'). برای تأیید بیشتر این نتایج، ما همچنین میزان فاگوسیت را پس از ناک‌داون Akt بررسی کردیم. نتایج نشان داد که در مقایسه با گروه کنترل، میزان فاگوسیتیزگی و شاخص فاگوسیتوز به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل 7C و 7C'). این نتایج نشان داد که FOXO باعث فاگوسیتوز هموسیت ها در میگو می شود. برای بررسی اینکه چگونه FOXO فاگوسیتوز هموسیتی را در میگو افزایش می‌دهد، بیان ژن‌های گزارش‌شده قبلی در فاگوسیتوز میگو را شناسایی کردیم. گزارش شده است که گیرنده روبنده کلاس B (SRB) و کلاس C (SRC) در فاگوسیتوز هموسیتی نقش دارند [38،39]. ما دریافتیم که سطح بیان mRNA Src، به جای Srb، به طور قابل توجهی پس از خاموش کردن Foxo در هموسیت ها و روده ها کاهش می یابد (شکل 7D و 7E)، در حالی که بیان Src به طور قابل توجهی پس از نابودی Akt در میگو افزایش می یابد (شکل 7F). نتایج مشابهی در سطح پروتئین به دست آمد (شکل 7G و 7G'). این نتایج نشان داد که FOXO با افزایش بیان SRC، فاگوسیتوز هموسیتی پاتوژن‌ها را در میگو ترویج می‌کند.

FOXO بیان RAB5 و RAB7 را در طول فاگوسیتوز در میگو ترویج می کند

مطالعات قبلی نشان داده اند که GTPase های کوچک، RAB5 و RAB7، تنظیم کننده های کلیدی انتقال وزیکول های تازه اندوسیتوز شده به اندوزوم های اولیه و دیررس هستند [40]. RAB5 یک تنظیم کننده کلیدی رویدادهای همجوشی اولیه است و نشانگر اندوزوم های اولیه است [41،42]. RAB7 برای همجوشی فاگوزوم-لیزوزوم دیررس مورد نیاز است و نشانگر آندوزوم های دیررس است [43]. برای بررسی اینکه آیا RAB5 و RAB7 در پاکسازی پاتوژن در میگو نقش دارند، ابتدا الگوهای بیان Rab5 و Rab7 را تجزیه و تحلیل کردیم و دریافتیم که دو GTPase کوچک در میگوهایی که با باکتری ها به چالش کشیده شده اند تنظیم مثبت شده اند (شکل S5A-S5D). ما میزان بقای میگوهای Rab{15}}RNAi و Rab{16}}RNAi را بعد از چالش باکتریایی بیشتر مورد تجزیه و تحلیل قرار دادیم و نتایج نشان داد که میزان بقای میگوهای حذفی Rab5 و Rab7 به طور قابل توجهی در مقایسه با شاهد کاهش یافت. S5E و S5F شکل). این نتایج نشان داد که RAB5 و RAB7 عملکردهای مهمی در مقاومت در برابر پاتوژن های باکتریایی ایفا می کنند. برای بررسی اینکه آیا RAB5 و RAB7 در فاگوسیتوز با واسطه FOXO دخالت دارند، ما سطوح بیان mRNA Rab5 و Rab7 را پس از تداخل با بیان Foxo در میگو بررسی کردیم. نتایج نشان داد که سطح بیان Rab5 و Rab7 به طور قابل توجهی در هموسیت ها و روده ها کاهش یافت (شکل 8A و S6A). در حالی که بیان Rab5 و Rab7 به طور قابل توجهی پس از نابودی Akt در میگو افزایش یافت (شکل 8B). برای تایید بیشتر نتایج فوق، سطح پروتئین RAB5 و RAB7 در میگوی ناک داون Foxo یا Akt نیز شناسایی شد. در مقایسه با گروه تزریق dsGfp، سطوح RAB5 و RAB7 نیز به طور قابل توجهی در هموسیت ها و روده ها در میگوی Foxo-knockdown کاهش یافت، اما در میگوی Akt-knockdown در 2 ساعت پس از تحریک توسط V. anguillarum به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل های 8B-8D'؛ S6؛ S6). و S6B'). این نتایج نشان می‌دهد که RAB5 و RAB7 در سیتوز فاژی هموسیت‌ها با واسطه FOXO در میگو شرکت می‌کنند. ما بیشتر تشخیص دادیم که RAB5 و RAB7 با V. anguillarum در هموسیت‌های میگو هم‌لوکال شده‌اند (شکل 9). روی هم رفته، نتایج نشان داد که RAB5 و RAB7 در فاگوسیتوز با واسطه FOXO در میگو نقش دارند.

شکل 5. عفونت پاتوژن فعالیت AKT را کاهش داد، که باعث افزایش جابجایی هسته ای FOXO در هموسیت ها و سلول های روده میگو شد. (A, B) کارایی Akt-RNAi در هموسیت‌ها و روده‌های میگو، همانطور که توسط qPCR با استفاده از میانگین هندسی بیان -اکتین و Ef{3}} به عنوان ژن‌های کنترل درون‌زا (A) و وسترن بلات (B) تعیین شد. (C) مقدار FOXO در سیتوپلاسم و هسته روده از میگو Akt-knockdown توسط وسترن بلات مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. dsGfp به عنوان کنترل استفاده شد. (C') تجزیه و تحلیل آماری پانل (C). از نرم افزار ImageJ برای دیجیتالی کردن باندها با اسکن تصاویر سه تکراری استفاده شد. (D) انتقال هسته ای FOXO در هموسیت های میگوی Akt-knockdown 2 ساعت پس از چالش V. anguillarum با استفاده از روش ایمونوسیتوشیمی فلورسنت تشخیص داده شد. dsGfp به عنوان کنترل استفاده شد. نوار مقیاس=20 میکرومتر. (D') تجزیه و تحلیل آماری (D). پس از تثبیت مقدار نوردهی، از نرم‌افزار WCIF ImageJ برای تجزیه و تحلیل هم‌محل‌سازی با نسبت شدت فلورسانس هسته ضد FOXO (سبز) و رنگ‌آمیزی DAPI (آبی) در هموسیت‌ها استفاده شد. (E, F) تغییر محتوای AKT فسفریله (p-AKT) در هموسیت ها (E) و روده (F) میگو که توسط V. anguillarum به چالش کشیده شده است. پانل های پایینی به ترتیب بر اساس باندهای وسترن بلات و تجزیه و تحلیل آماری، ارقام دیجیتالی (E) و (F) هستند.

چای سیستانچ

بحث

FOXO به عنوان یک فاکتور رونویسی بسیار مهم، در بسیاری از عملکردهای فیزیولوژیکی و متابولیک شرکت می کند [44،45]. در مطالعه حاضر، ما یک FOXO را از میگو (M. japonicus) شناسایی کردیم و دریافتیم که با تنظیم بیان AMP در شرایط عادی در تنظیم هموستاز همولنف و میکروبیوتای روده ای شرکت می کند. FOXO می تواند با عفونت باکتریایی در میگو فعال شود و به هسته منتقل شود، جایی که به طور مستقیم و غیرمستقیم (از طریق مسیر IMD) بیان AMP ها را تنظیم می کند. FOXO بیان ژن‌های مرتبط با فاگوسیتوز، مانند SRC و GTPases کوچک، RAB5 و RAB7 را افزایش داد تا فاگوسیتوز هموسیتی را در برابر پاتوژن‌ها تقویت کند. بنابراین، FOXO میگو نقش های متفاوتی در پاسخ های ایمنی سیستمیک و موضعی (روده ای) در برابر پاتوژن ها ایفا می کند (شکل 10). در مقایسه با FOXOهای انسانی، FOXO میگو دارای یک توالی اسید آمینه نسبتاً حفظ شده و مکان‌های فسفوریلاسیون AKT است. با این حال، دومین محل فسفوریلاسیون AKT FOXO میگو، ترئونین به جای سرین است. فسفوریلاسیون AKT FOXO انتقال هسته ای و سیتوپلاسمی FOXO را کنترل می کند [9]. در این مطالعه، ما دریافتیم که AKT با کنترل ورود هسته ای FOXO مرتبط است. پس از عفونت V. anguillarum، سطح AKT فسفریله به طور قابل توجهی کاهش یافت، که نشان می‌دهد فعالیت AKT در میگوهای آلوده به پاتوژن کاهش یافته است، بنابراین احتباس هسته‌ای یا جابه‌جایی هسته‌ای FOXO و متعاقباً القای بیان ژن‌های هدف افزایش می‌یابد. مانند Relish و Amp برای مقاومت در برابر عفونت پاتوژن. مطالعات قبلی نشان داده اند که FOXO با سرکوب بیان پروتئین شناسایی پپتیدوگلیکان SC2 (تنظیم کننده منفی مسیر IMD) در هموستاز میکروفلور روده مگس سرکه شرکت می کند تا مسیر بیان AMP را فعال کند [14]. RELISH به عنوان یک ژن هدف کلیدی FOXO در کنترل تحمل هیپوکسی در مگس سرکه گزارش شد [46]. مانند سایر حیوانات، دستگاه گوارش میگو حاوی میکروبیوتای نسبتاً زیاد و ثابتی است. شواهد فزاینده همچنین نشان می دهد که همولنف برخی از بی مهرگان آبزی سالم، از جمله میگو نیز حاوی مقادیر پایدار باکتری است [47]. مطالعه قبلی ما نشان داد که یک لکتین نوع C با حفظ بیان AMPs در تنظیم هموستاز میکروبیوتای همولنف شرکت می کند [34]، اما ما نمی دانیم چه مسیرهای سیگنالی در تنظیم بیان AMP دخیل هستند. در اینجا، نتایج ما نشان داد که FOXO در تنظیم هموستاز همولنف و میکرو فلور روده از طریق سیگنال دهی IMD در شرایط عادی نقش دارد. در میگوهای غیر آلوده، شکست Foxo منجر به کاهش قابل توجه بیان Relish شد و میزان بقای میگو حتی بدون عفونت باکتریایی به میزان قابل توجهی کاهش یافت. ما همچنین مقدار کمی FOXO را در هسته سلول های طبیعی میگو یافتیم. بنابراین، ما فکر می کنیم که FOXO در تنظیم هموستاز همولنف و فلور روده در شرایط عادی با ترویج بیان Relish و پس از آن افزایش بیان AMP توسط مسیر IMD شرکت می کند. این نتایج نشان داد که FOXO در ایمنی موضعی و سیستمیک برای ارتقای هموستاز میکروبی همولنف و دستگاه گوارش در میگو شرکت می‌کند. ایمنی هومورال نقش مهمی در مقاومت در برابر عفونت پاتوژن با نرخ معکوس از طریق تولید باتری AMP ایفا می کند [21،48]. پاسخ هومورال شامل سنتز و ترشح القایی AMP ها است که به عنوان یک پاسخ سیستمیک به داخل همولنف رها می شوند یا به عنوان یک پاسخ موضعی بر روی سطح اپیدرم یا حفره دستگاه گوارش آزاد می شوند [19]. بیان AMP عمدتاً توسط مسیرهای سیگنال دهی Toll/Dif و IMD/Relish در مگس میوه تنظیم می شود [49]. در حال حاضر، چندین خانواده از AMPها در میگو شناسایی شده اند، از جمله پوسته ها، عوامل ضد لیپوپلی ساکارید (Alfs) و پنائیدین ها [50]. مطالعه حاضر نشان داد که FOXO می تواند به طور مستقیم یا غیرمستقیم (از طریق سیگنالینگ IMD/Relish) بیان AMPها از جمله CrusI{22}}، Alf-B1، Alf-C1 و Alf-E1 را تنظیم کند. ما فکر می‌کردیم که فعال‌سازی کم FOXO در هموسیت‌ها و روده‌های میگو در شرایط عادی می‌تواند ژن هدف کلیدی Foxo، یعنی Relish را برای حفظ هموستاز میکروبیوتای in vivo تنظیم کند. در طول عفونت، پاتوژن‌های مهاجم، FOXO را فعال می‌کنند، که بیشتر آن به هسته منتقل می‌شود، جایی که ژن‌های هدف بیشتری از جمله برخی از AMP‌ها مانند Alf-E1 و CrusI{31}} را علاوه بر Relish تنظیم می‌کند. روی هم رفته، FOXO در تنظیم هموستاز همولنف و میکروبیوتای روده در میگوی سالم از طریق فعال سازی سیگنال IMD در سطح پایه در همولنف و دستگاه گوارش شرکت می کند. عفونت پاتوژن FOXO را با کاهش فعالیت AKT فعال می کند و بیان AMP ها را به طور مستقیم و غیرمستقیم در ایمنی سیستمیک و ایمنی موضعی (روده ای) افزایش می دهد. فاگوسیتوز یک پدیده وابسته به گیرنده، وابسته به اکتین و ATP است که با اتصال ذرات یا پاتوژن ها به گیرنده های سیتوممبران خاص ایجاد می شود و نشان دهنده یک فرآیند ایمنی مهم است که از طریق آن میزبان می تواند از خود در برابر عوامل بیماری زا محافظت کند [24]. GTPaseهای کوچک، مانند RAB5 و RAB7، در ادامه بازسازی غشاء و ترافیک وزیکول در فاگوسیتوز نقش دارند. مطالعه قبلی ما گزارش داد که گیرنده های روبنده SRB و SRC در فاگوسیتوز هموسیتی به عنوان گیرنده در میگو نقش دارند [38،39]. در مطالعه حاضر، ما دریافتیم که پس از نابودی Foxo، بیان Src به طور قابل توجهی کاهش یافت، و نرخ فاگوسیتوز هموسیت به طور قابل توجهی کاهش یافت، که نشان می‌دهد Src یک ژن هدف FOXO است و FOXO در فاگوسیتوز باکتری‌های بیماری‌زا با واسطه SRC نقش دارد. FOXO همچنین می تواند بیان دو GTPase کوچک، RAB5 و RAB7 را ترویج کند. این GTPaseهای کوچک در انتقال متوالی فاگوزوم‌های اولیه و دیررس نقش دارند و تعیین‌کننده‌های کلیدی هستند [51]. فاگوزوم ها از حاشیه سلول به ناحیه داخل سلولی مهاجرت می کنند، با RAB5 در حین انتقال با RAB7 جایگزین می شود و کالاهای نهایی برای تجزیه به لیزوزوم منتقل می شوند [52،53]. ما همچنین دریافتیم که RAB5 و RAB7 می‌توانند با پاتوژن‌های موجود در هموسیت‌ها محلی شوند، که نشان می‌دهد پاتوژن‌ها قبل از تجزیه در لیزوزوم‌ها توسط هموسیت‌ها در میگو با عبور از فاگوزوم‌های اولیه و دیررس فاگوسیت می‌شوند. بنابراین، FOXO با ترویج فاگوسیتوز هموسیت ها در پاسخ ایمنی سلولی نقش دارد. در نتیجه، نتایج ما نشان می‌دهد که FOXO نه تنها در تنظیم هموستاز میکروبی در شرایط عادی، بلکه در پاکسازی باکتری‌های بیماری‌زا در میگوهای آلوده با ترویج بیان AMPs و فاگوسیتوز هموسیت‌ها نیز شرکت می‌کند.

شکل 6. FOXO نقش ضد باکتریایی خود را در میگو با تنظیم بیان AMP ها انجام می دهد. (A، B) بیان آمپر در هموسیت‌ها (A) و روده‌های (B) میگوی Foxo-knockdown، همانطور که توسط qPCR با استفاده از میانگین هندسی بیان -اکتین و Ef{3}} به عنوان ژن‌های کنترل درون‌زا تعیین شد. از تزریق dsGfp در میگو به عنوان شاهد استفاده شد. داده ها با استفاده از آزمون Mann-Whiteny U مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفتند. (C, D) بیان آمپر در هموسیت ها (C) و روده (D) میگوی Knockdown Akt با استفاده از qPCR با استفاده از میانگین هندسی بیان -اکتین و Ef{6}} به عنوان ژن های کنترل درون زا مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. از تزریق dsGfp در میگو به عنوان شاهد استفاده شد. تفاوت های معنی دار با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. (E) نمودار شماتیک از محل های اتصال پیش بینی شده FOXO در پروموتر Alf-E1. (F) ChIP و RT-PCR برای تشخیص اتصال FOXO به توالی پروموتر Alf-E1 با استفاده از پرایمرها (Alf-E{14}}F و Alf-E1-R، جدول 1) استفاده شد. RT-PCR همچنین برای تقویت ناحیه رمزگذاری Alf-E1 با پرایمرهای RT-PCR (Alf-E{23}}RT-F و Alf-E1-RT-R. جدول 1) با استفاده از تراشه مورد استفاده قرار گرفت. DNA را به عنوان الگو به دست آورد. آنتی بادی IgG به عنوان شاهد استفاده شد و قطعه DNA ژنومی طبیعی تکثیر شده برای تایید باند هدف استفاده شد.

شکل 7. FOXO فاگوسیتوز هموسیتی پاتوژن ها را در میگو با افزایش بیان SRC افزایش می دهد. (الف) فاگوسیتوز هموسیتی V. anguillarum با استفاده از روش ایمونوسیتوشیمی فلورسنت در زیر میکروسکوپ فلورسانس مشاهده شد. V. anguillarum با FITC (سبز) و هسته سلولی با DAPI (آبی) رنگ آمیزی شد. فلش قرمز نشان دهنده هموسیت های فاگوسیتیک است. نوار مقیاس=20 میکرومتر. (A') تجزیه و تحلیل آماری میزان فاگوسیتوز و شاخص فاگوسیتوز در میگوی Foxo-knockdown. از گروه تزریق dsGfp به عنوان کنترل استفاده شد. در هر آزمایش پانصد هموسیت در زیر میکروسکوپ فلورسانس شمارش شد. داده ها با استفاده از آزمون t-test مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت. (B) فاگوسیتوز باکتریایی توسط هموسیت ها با استفاده از فلوسیتومتری تجزیه و تحلیل شد. هموسیت‌های فاگوسیتوز شده حاوی باکتری (R2) از هموسیت‌های فاگوسیتوز نشده (R3) بر اساس سیگنال فلورسانس باکتری‌های نشان‌دار در هموسیت‌ها با استفاده از نرم‌افزار IDEAS Application v6.{8}} جدا شدند. (B') نرخ فاگوسیتی هموسیت ها بر اساس داده های فلوسیتومتری. برای هر آنالیز سه هزار هموسیت شمارش شد و سه تکرار انجام شد. از گروه dsGfp به عنوان کنترل استفاده شد. (C) فاگوسیتوز هموسیتی V. anguillarum در میگوی Knockdown Akt در زیر میکروسکوپ فلورسانس مشاهده می شود. نوار مقیاس=10 میکرومتر. (C') تجزیه و تحلیل آماری نرخ فاگوسیتوز و شاخص فاگوسیتیز بر اساس داده های پانل (C). (د) سطح بیان mRNA Srb و Src در هموسیت‌های میگوی Foxo knockdown با qPCR با استفاده از میانگین هندسی بیان -اکتین و Ef{11}} به عنوان ژن‌های کنترل درون‌زا تجزیه و تحلیل شد. تزریق dsGfp به عنوان کنترل استفاده شد. (E) بیان mRNA Srb و Src در روده میگو Foxo-RNAi با استفاده از میانگین هندسی بیان -اکتین و Ef{14}} به عنوان ژن‌های کنترل درون‌زا با qPCR تجزیه و تحلیل شد. (F) بیان mRNA Src در هموسیت‌های میگو Akt-RNAi با استفاده از میانگین هندسی بیان -اکتین و Ef{17}} به عنوان ژن‌های کنترل درون‌زا با qPCR تجزیه و تحلیل شد. (G) سطح پروتئین SRC در هموسیت‌های میگو Foxo-RNAi یا Akt-RNAi، همانطور که با استفاده از وسترن بلات تجزیه و تحلیل شد. تزریق dsGfp به عنوان کنترل استفاده می شود. (G') تجزیه و تحلیل آماری بر اساس داده های سه تکرار پانل (G).

مواد و روش ها

بیانیه اخلاق

تمام آزمایش‌های حیوانی مطابق با دستورالعمل‌های ملی چین (GB 14922.2-2011 و GB 14925-2010) انجام شد. آزمایش‌های خرگوش برای آماده‌سازی آنتی‌بادی در این مطالعه مطابق با پروتکل‌های تایید شده توسط کمیته مراقبت و رفاه حیوانات در دانشکده علوم زندگی دانشگاه شاندونگ (SYDWLL{5}}) انجام شد. تایید طبق مقررات استفاده از میگو در مطالعه ما ضروری نبود، زیرا تحقیقات ما از تعداد محدودی از میگوهای معمولی که اغلب توسط جامعه مصرف می‌شوند استفاده می‌کند.

حیوانات

میگوی سالم (Marsupenaeus japonicus)، با وزن حدود 6 تا 10 گرم، از بازار محصولات آبزی در چینگدائو، استان شاندونگ، چین به دست آمد. قبل از آزمایش، میگوها حداقل به مدت 1 روز در سیستم پرورش میگو با آب دریای هوادهی شده در دمای 23-25 ​​درجه سانتیگراد برای سازگاری با محیط جدید کشت شدند.

شکل 8. RAB5 و RAB7 در فاگوسیتوز هموسیت با واسطه FOXO در میگو نقش دارند. (A، B) qPCR برای تجزیه و تحلیل سطوح بیان mRNA Rab5 و Rab7 در هموسیت‌های میگو Foxo-knockdown (A) و میگو Akt-knockdown (B) با و بدون عفونت باکتریایی استفاده شد. qPCR از میانگین هندسی بیان -اکتین و Ef{9}} به عنوان ژن‌های کنترل درون‌زا استفاده کرد. (C) سطح پروتئین RAB5 و RAB7 در هموسیت‌های میگو Foxo-knockdown در 2 ساعت پس از چالش V. anguillarum با استفاده از وسترن بلات تعیین شد. (C') تجزیه و تحلیل آماری بر اساس داده های سه تکرار پانل (C). (D) سطح پروتئین RAB5 و RAB7 در هموسیت‌های میگو Akt-knockdown در 2 ساعت پس از چالش V. anguillarum با استفاده از وسترن بلات تعیین شد. (D') تجزیه و تحلیل آماری بر اساس داده های سه تکرار پانل (D).

تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک

توالی cDNA تمام طول Foxo از هموسیت ها و توالی نویسی روده ای M. japonicus (BGI، شنژن، چین) به دست آمد. چارچوب خواندن باز (ORF) Foxo با استفاده از یک جفت آغازگر (Foxo-EX-F و Foxo-EX-R؛ جدول 1) برای تایید توالی تقویت شد. cDNA مربوطه به صورت مفهومی برای به دست آوردن توالی پروتئین استنباط شده با استفاده از ابزار ExPASy-Translation (http://cn.expasy.org/) ترجمه شد. تحلیل شباهت با استفاده از BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/)، و پیش‌بینی معماری دامنه با استفاده از SMART (http://smart.emblheidelberg.de) انجام شد. درخت فیلوژنتیکی از FOXOها از گونه های مختلف با استفاده از برنامه MEGA 6.{8}} [54] ساخته شد.

شکل 9. RAB5 و RAB7 همزمان با V. anguillarum موضعی می شوند. محلی سازی مشترک RAB5 و RAB7 با FITC با برچسب-V. anguillarum در هموسیت‌های میگو، همانطور که با استفاده از روش ایمونوسیتوشیمی فلورسنت تجزیه و تحلیل شد. باکتری ها با FITC (سبز) برچسب گذاری شدند و به میگو تزریق شدند. هموسیت ها از پنج میگو در 30 دقیقه و 1 ساعت پس از تزریق باکتری جمع آوری شد و با آنتی بادی های anti-RAB5 یا anti RAB7 انکوبه شدند. آنتی بادی ثانویه ضد خرگوش IgG Alexa{13}} (قرمز) بود. هسته ها با DAPI (آبی) رنگ آمیزی شدند. محلی سازی همزمان در هموسیت ها با فلش های سفید نشان داده می شود. نوار مقیاس=10 میکرومتر.

شکل 10. نمایش شماتیک دخالت FOXO در ایمنی ذاتی موضعی و سیستمیک در میگو. (الف) در شرایط غیر عفونی، FOXO با ترویج Relish و متعاقبا بیان AMP، هموستاز همولنف و میکروبیوتای روده را حفظ می کند. (ب) در شرایط آلوده، فسفوریلاسیون AKT با عفونت پاتوژن کاهش می یابد و در نتیجه محتوای FOXO در هسته افزایش می یابد. FOXO به طور مستقیم بیان Relish و AMPs را برای از بین بردن پاتوژن های مهاجم ترویج می کند. از سوی دیگر، FOXO فاگوسیتوز پاتوژن ها را از طریق مسیر فاگوسیتوز با واسطه SRC ترویج می کند.

چالش باکتری و جمع آوری نمونه

Vibrio anguillarum (ATCC 43305) از کالج دریایی، دانشگاه شاندونگ (وی های، چین) به دست آمده و اکنون در آزمایشگاه ما نگهداری می شود. V. anguillarum یک شبه در دمای 37 درجه سانتیگراد در محیط LB کشت داده شد و در روز دوم در ساعت 1:100 به مدت 4 ساعت مجدداً کشت شد. باکتری ها در فاز رشد لگاریتمی با سانتریفیوژ در 5000 × گرم به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد جمع آوری شدند و دو بار با سالین بافر فسفات (PBS: 10 میلی مولار Na2HPO4، 140 میلی مولار NaCl، 2.7 میلی مولار KCl، و 1.8 میلی مولار KCl، و 1.8 mM KCl و KH2PO4، 1.8 میلی مولار شستشو شدند. pH 7.4). V. anguillarum مجدداً در سالین بافر فسفات برای چالش میگو معلق شد. تقریباً 2×107 واحد تشکیل کلنی (CFU)/ میگو با استفاده از میکروسرنگ به شکم هر میگو تزریق شد. به گروه کنترل با همان حجم PBS تزریق شد. هموسیت‌ها، قلب، هپاتوپانکراس، آبشش، معده و روده‌ها از حداقل سه میگو برای استخراج RNA و پروتئین جمع‌آوری شدند. برای جمع آوری هموسیت، همولنف از سینوس شکمی با استفاده از یک سرنگ از قبل بارگذاری شده با 0.8 میلی لیتر بافر ضد انعقاد (10 درصد سدیم سیترات) استخراج شد و سپس به سرعت در 700 × گرم به مدت 8 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد برای جداسازی هموسیت سانتریفیوژ شد.

استخراج RNA و پروتئین و سنتز cDNA

RNA کل از هموسیت ها و اندام های مختلف میگو با استفاده از TRIZol (ET101، Transgen، پکن، چین) استخراج شد. پروتئین‌ها از اندام‌های مختلف با استفاده از روش رادیو ایمونوپسیتیشن (RIPA) Lysis Buffer (P0013B، Beyotime، Jiangsu، چین) استخراج شدند. سنتز cDNA رشته اول با استفاده از کیت سنتز cDNA (5x All-in-One RT MasterMix؛ Applied Biological Materials-abm، ونکوور، کانادا)، به دنبال دستورالعمل های سازنده انجام شد.

جدول 1. توالی پرایمرهای مورد استفاده در این مطالعه.

MasterMix; Applied Biological Materials-abm، ونکوور، کانادا)، با پیروی از دستورالعمل‌های سازنده.

بیان نوترکیب و آماده سازی آنتی بادی

توالی cDNA Foxo توسط واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس (RT-PCR) با استفاده از پرایمرهای Foxo-EX-F و Foxo-EX-R (جدول 1) تکثیر شد. سپس محصولات PCR خالص شده با استفاده از آنزیم های محدود کننده هضم و به پلاسمید pGEX-4T{7}} (GE Healthcare، Piscataway، NJ، USA) متصل شدند. و پلاسمیدهای ساخته شده به سلولهای Escher ichia coli Rosseta (DE3) تبدیل شدند. بیان پروتئین با استفاده از 1 میلی مولار ایزوپروپیل{10}} D-thio galactopyranoside در دمای 37 درجه سانتیگراد القا شد. پروتئین‌های نوترکیب تحت کروماتوگرافی میل ترکیبی با استفاده از رزین گلوتاتیون (GST) (C600031، BBI، شانگهای، چین)، به دنبال دستورالعمل‌های سازنده قرار گرفتند. آنتی سرم خرگوش علیه FOXO طبق روشی که قبلا شرح داده شده بود [55] تهیه شد.

وسترن بلاتینگ

پروتئین های استخراج شده از اندام ها یا هموسیت های مختلف با استفاده از الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید دودسیل سولفات سدیم 10 درصد (SDS-PAGE) جدا شدند. پروتئین‌های موجود در ژل‌های SDS-PAGE با استفاده از بافر انتقال (25 میلی‌مولار Tris-HCl، 2{14}} میلی‌مولار گلیسین، 0.037% mM SDS، و 20% اتانول) به غشای نیترات سلولز منتقل شدند. و در 5% شیر بدون چربی یا 3% آلبومین سرم گاوی (BSA) در سالین بافر Tris (TBS: 150 میلی مولار NaCl، 10 میلی مولار Tris HCl، pH 8.0) به مدت 1 ساعت با تکان دادن ملایم در دمای اتاق انکوبه شد. سپس غشاها با آنتی سرم اولیه انکوبه شدند: Anti-FOXO در رقت 1:100، anti-RAB5 در 1:25، anti Rab7 در 1:25، آنتی بتا اکتین (ACTB) در 1:250 (تهیه شده در آزمایشگاه ما ) آنتی بادی های پلی کلونال هیستون (A2348, ABclonal, Wuhan, China, 1:2500); آنتی بادی های پلی کلونال ضد فسفریله (p)-AKT (WLP001a, Wanleibio, Shenyang, China, 1:500) و به آرامی در طول شب در دمای 4 درجه سانتیگراد تکان داده شوند. پس از سه بار شستشو با TBST (0.1% Tween{41}} اضافه شده به TBS)، مم بران ها با آنتی بادی ثانویه (ZB2308 ZSGB-Bio, Beijing, China, 1:5,{46}}) یا ( ZB2301 ZSGB-Bio, Beijing, China, 1:5,000) به مدت 3 ساعت در دمای اتاق با تکان دادن ملایم. باندهای پروتئین واکنش پذیر با استفاده از یک کلرید آبی نیتروتترازولیوم (A610379، BBI) و محلول P-toluidine (A610072، BBI) در شرایط تاریک یا با استفاده از نورتابی شیمیایی افزایش یافته (ECL) ایجاد شدند. -اکتین یا هیستون{57}} مرجع استفاده شدs.

توزیع بافت و الگوهای بیان در میگوهای به چالش کشیده شده توسط باکتری ها

توزیع بافتی Foxo/FOXO در هموسیت‌ها، قلب، آبشش، خلط، معده و روده با استفاده از RT-PCR با پرایمرهای Foxo-F و Foxo-R (جدول 1) و با وسترن بلات با آنتی‌بادی‌های ضد FOXO تجزیه و تحلیل شد. به ترتیب. روش PCR شامل انکوباسیون اولیه در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه بود. به دنبال آن 35 چرخه 94 درجه سانتی گراد برای 30 ثانیه، 50 درجه سانتی گراد برای 30 ثانیه، و 72 درجه سانتی گراد برای 30 ثانیه. و سپس 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه. محصولات PCR با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز (1.5% آگارز) آنالیز شدند. ژن -اکتین (-actin-F و -actin-R؛ جدول 1) به عنوان کنترل داخلی استفاده شد. الگوهای بیان دوره زمانی Foxo/FOXO در سطوح RNA و پروتئین در میگوهای به چالش کشیده شده با V. anguillarum با استفاده از PCR زمان واقعی کمی (qPCR) در یک سیکلر حرارتی (qTOWER3، ANALYTIK JENA AG، Jena، آلمان) و توسط آنالیز شد. وست ارن بلاتینگ به ترتیب. روش qPCR شامل: 95 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه. 40 چرخه در دمای 95 درجه سانتیگراد برای 10 ثانیه و 60 درجه سانتیگراد برای 50 ثانیه. و سپس یک دوره ذوب از 65 درجه سانتیگراد تا 95 درجه سانتیگراد. فایل های بیان پرو فوکسو با استفاده از روش 2-ΔΔCT [56] با استفاده از میانگین هندسی دو ژن کنترل داخلی -اکتین و Ef{38}} برای نرمال سازی تولید شدند. کارایی جفت پرایمر در qPCR به دنبال روش MIQE [57] با رقت لگاریتمی {40} برابر مخلوط cDNA برای ایجاد یک منحنی استاندارد خطی تجزیه و تحلیل شد.

جداسازی پروتئین های هسته ای و سیتوپلاسمی

بافت روده از میگو جدا شد و سه بار در PBS شسته شد. استخراج پروتئین با استفاده از کیت استخراج پروتئین هسته ای و سیتوپلاسمی (R0050, Solarbio, Beijing, China) طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. حداقل سه میگو برای استخراج پروتئین برای حذف تفاوت های فردی استفاده شد.

سنجش تداخل RNA

برای تجزیه و تحلیل عملکرد ژن، ما سنجش تداخل RNA (RNAi) را انجام دادیم. چندین جفت پرایمر حاوی توالی پروموتر T7 (Foxo-RI-F و Foxo-RI-R؛ Rab5-RI-F and Rab5 -RI-R; Rab7-RI- F و Rab7 -RI-R؛ Akt-RI-F و Akt-RI-R. جدول 1) برای تقویت الگوهای سنتز dsRNA طراحی شدند. با استفاده از T7 RNA پلیمراز (EP0111، Thermo Fisher Scientific، Waltham، MA، USA) و الگوی cDNA، قطعات dsRNA را سنتز کردیم. پروتئین فلورسنت سبز دو رشته ای dsGfp RNA به عنوان شاهد استفاده شد که با استفاده از Gfp-RI-F و Gfp-RI-R (جدول 1) به عنوان آغازگر برای سنتز dsGfp تقویت شد. سپس قطعات dsRNA (50 میکروگرم در هر کدام) با استفاده از میکروسرنگ به بخش شکمی M. japonicus تزریق شد و 12 ساعت بعد با همان دوز تزریق دوم انجام شد. کارایی تداخل RNA با استفاده از PCR رونویسی معکوس کمّی (qRT-PCR، شامل رونویسی معکوس RNA برای تشکیل cDNA، که سپس به عنوان الگو در سنجش qPCR استفاده شد) یا وسترن بلات 24 ساعت پس از تزریق دوم مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. -اکتین به عنوان مرجع داخلی استفاده شد.

منابع

1. Calnan DR، Brunet A. کد FoxO. انکوژن. 2008; 27 (16): 2276-2288. https://doi.org/10.1038/ onc.2008.21 PMID: 18391970.

2. Tran H، Brunet A، Grenier JM، Datta SR، Fornace AJ، DiStefano PS، و همکاران. مسیر ترمیم DNA توسط فاکتور رونویسی پیشانی FOXO3a از طریق پروتئین Gadd45 تحریک می شود. علوم پایه. 2002; 296 (5567): 530-534. https://doi.org/10.1126/science.1068712 PMID: 11964479.

3. Martins R, Lithgow GJ, Link W. زنده باد FOXO: کشف نقش پروتئین های FOXO در پیری و رشد طولانی مدت. سلول پیری 2016; 15 (2): 196-207. https://doi.org/10.1111/acel.12427 PMID: 26643314.

4. Vogt PK، Jiang H، Aoki M. سه لایه کنترل فسفوریلاسیون، استیلاسیون و یوبی کوئیتیناسیون پروتئین های FOXO. چرخه سلولی. 2005; 4 (7): 908-913. https://doi.org/10.4161/cc.4.7.1796 PMID: 15917664. 5. Daitoku H, Sakamaki J, Fukamizu A. تنظیم فاکتورهای رونویسی FoxO توسط استیلاسیون و برهمکنش های پروتیین-پروتئین. Bba-Mol Cell Res. 2011; 1813 (11): 1954-1960. https://doi.org/10.1016/j. bbamcr.2011.03.001 PMID: 21396404.

6. Wang Y، Zhou YM، Graves DT. عوامل رونویسی FOXO: اهمیت و تنظیم بالینی آنها Biomed Res Int. 2014; 2014: 1-13. https://doi.org/10.1155/2014/925350 PMID: 24864265.

7. مورفی CT، مک کارول SA، Bargmann CI، Fraser A، Kamath RS، Ahringer J، و همکاران. ژن هایی که در پایین جریان DAF-16 عمل می کنند تا بر طول عمر Caenorhabditis elegans تأثیر بگذارند. طبیعت. 2003; 424(6946):277– 284. https://doi.org/10.1038/nature01789 PMID: 12845331. 8. سرگی سی، شن اف، لیو اس ام. مسیرهای انسولین/IGF-1R، SIRT1، و FOXOs - یک صفحه تعاملی جالب برای استخوان و استئوسارکوم. اندوکرینول جلویی (لوزان). 2019; 10:93-103. https://doi.org/10. 3389/fendo.2019.00093 PMID: 30881341.

9. Brunet A, Bonni A, Zigmond MJ, Lin MZ, Juo P, Hu LS, et al. Akt با فسفریله کردن و مهار فاکتور رونویسی پیشانی، بقای سلولی را تقویت می کند. سلول. 1999; 96 (6): 857-868. https://doi.org/10.1016/ s0092-8674(00){10}} PMID: 10102273.

10. Huang H، Regan KM، Wang F، Wang DP، Smith DI، van Deursen JMA، و همکاران. Skp2 از طریق تخریب با واسطه یوبیکوئیتین، FOX01 را در سرکوب تومور مهار می کند. P Natl Acad Sci ایالات متحده آمریکا. 2005; 102(5):1649– 1654. https://doi.org/10.1073/pnas.0406789102 PMID: 15668399.

11. Ogg S، Paradis S، Gottlieb S، Patterson GI، Lee L، Tissenbaum HA، و همکاران. فاکتور رونویسی سر چنگال DAF-16 سیگنال‌های متابولیک و طول عمر شبه انسولین را در C. elegans انتقال می‌دهد. طبیعت. 1997; 389 (6654): 994-999. https://doi.org/10.1038/40194 PMID: 9353126.

12. Fink C، Hoffmann J، Knop M، Li Y، Isermann K، Roeder T. برای زنده ماندن عفونت دهان در مگس سرکه سیگنالینگ FoxO روده مورد نیاز است. ایمونول مخاطی. 2016; 9 (4): 927-936. https://doi.org/10.1038/mi. 2015.112 PMID: 26627459.

13. اسپلبرگ ام جی، مار ام تی. FOXO تداخل RNA در مگس سرکه را تنظیم می کند و از عفونت ویروس RNA محافظت می کند. P Natl Acad Sci ایالات متحده آمریکا. 2015; 112 (47): 14587-14592. https://doi.org/10.1073/pnas. 1517124112 PMID: 26553999.

14. Guo LL، Karpac J، Tran SL، Jasper H. PGRP-SC2 هموستاز ایمنی روده را برای محدود کردن دیسبیوز commen sal و افزایش طول عمر ترویج می کند. سلول. 2014; 156 (1-2): 109-122. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.12. 018 PMID: 24439372.

15. Becker T، Loch G، Beyer M، Zinke I، Aschenbrenner AC، Carrera P، و همکاران. تنظیم وابسته به FOXO هموستاز ایمنی ذاتی طبیعت. 2010; 463 (7279): 369-373. https://doi.org/10.1038/ nature08698 PMID: 20090753.

16. Seiler F, Hellberg J, Lepper PM, Kamyschnikow A, Herr C, Bischoff M, et al. فاکتورهای رونویسی FOXO مکانیسم های ایمنی ذاتی را در سلول های اپیتلیال تنفسی تنظیم می کنند. جی ایمونول. 2013; 190(4): 1603– 1613. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1200596 PMID: 23315071.

17. Graves DT، Milovanova TN. ایمنی مخاطی و فاکتورهای رونویسی FOXO1 جلو ایمونول. 2019; 10:2530-2541. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02530 PMID: 31849924.

18. Bulet P, Stocklin R, Menin L. پپتیدهای ضد میکروبی: از بی مهرگان تا مهره داران. Immunol Rev. 2004; 198:169-184. https://doi.org/10.1111/j.0105-2896.2004.0124.x PMID: 15199962.

19. Buchon N، Silverman N، Cherry S. ایمنی در Drosophila melanogaster - از تشخیص میکروبی تا فیزیولوژی کل ارگانیسم. Nat Rev Immunol. 2014; 14 (12): 796-810. https://doi.org/10.1038/nri3763 PMID: 25421701.

20. Hoffmann JA, Reichhart JM. مصونیت ذاتی مگس سرکه: دیدگاهی تکاملی نات ایمونول. 2002; 3 (2): 121-126. https://doi.org/10.1038/ni0202-121 PMID: 11812988.

21. ایمنی Hultmark D. Drosophila: مسیرها و الگوها. Curr Opin Immunol. 2003; 15 (1): 12-19. https:// doi.org/10.1016/s0952-7915(02){10}} PMID: 12495727.

22. Li FH، Xiang JH. پیشرفت های اخیر در تحقیقات در مورد ایمنی ذاتی میگو در چین. Dev Comp Immunol. 2013; 39 (1-2): 11-26. https://doi.org/10.1016/j.dci.2012.03.016 PMID: 22484214.

23. Sun JJ، Lan JF، Zhao XF، Vasta GR، Wang JX. اتصال دامنه سیم پیچی لکتین نوع C به گیرنده Domeless مستقیماً مسیر JAK/STAT را در پاسخ ایمنی میگو به عفونت باکتریایی فعال می کند. PLoS Pathog. 2017; 13 (9): e1006626. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006626 PMID: 28931061.

24. گوردون اس. فاگوسیتوز: یک فرآیند ایمونوبیولوژیک. مصونیت. 2016; 44 (3): 463-475. https://doi.org/ 10.1016/j.immuni.2016.02.026 PMID: 26982354.

25. Wang S، Xia PY، Huang GL، Zhu PP، Liu J، Ye BQ، و همکاران. اتوفاژی با واسطه FoxO1-برای رشد سلول های NK و ایمنی ذاتی لازم است. Nat Commun. 2016; 7:11023-11037. https://doi.org/10.1038/ ncomms11023 PMID: 27010363.

26. دونگ جی، سونگ ال، تیان سی، وانگ ای، میائو اف، ژنگ جی، و همکاران. FOXO1 فعالیت نوتروفیل های ناشی از باکتری را تنظیم می کند. جلو ایمونول. 2017; 8:1088-1102. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01088 PMID: 28928749.

27. وانگ ایکس دبلیو، ژائو ایکس اف، وانگ جی ایکس. لکتین نوع C به بتا-اینتگرین متصل می شود تا فاگوسیتوز هموسیتی را در یک بی مهرگان تقویت کند. جی بیول شیمی. 2014; 289 (4): 2405-2414. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.528885 PMID: 24324258.

28. Norouzitallab P، Baruah K، Vanrompay D، Bossier P. آموزش دفاع شخصی میگو برای مبارزه با عفونت ها. روند بیوتکنول. 2019; 37 (1): 16-19. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.05.007 PMID: 29914649.

29. Flegel TW. ظهور تاریخی، تأثیر و وضعیت فعلی پاتوژن های میگو در آسیا J Invertebr Pathol. 2012; 110 (2): 166-173. https://doi.org/10.1016/j.jip.2012.03.004 PMID: 22429834.

30. Wang PH، Huang TZ، Zhang XB، He JG. دفاع ضد ویروسی در میگو: از ایمنی ذاتی تا عفونت ویروسی Antivir Res. 2014; 108:129-141. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2014.05.013 PMID: 24886688.

31. Obsil T، Obsilova V. روابط ساختار/عملکرد زیربنای تنظیم عوامل رونویسی FOXO. انکوژن. 2008; 27 (16): 2263-2275. https://doi.org/10.1038/onc.2008.20 PMID: 18391969.