بیان بیش از حد GRP78 باعث تحریک PINK1-میتوفاژی محافظت عصبی با واسطه IP3R قسمت 3 می شود

3.1.3. القای میتوفاژی توسط بیان بیش از حد GRP78 میانجی محافظت عصبی است

ما فرض کردیم که محافظت عصبی با واسطه GRP{0}} ممکن است از طریق القای اتوفاژی انتخابی میتوکندری برای تسریع در حذف اندامک‌های معیوب باشد.

در سال های اخیر، مطالعات بیشتر و بیشتری نشان داده است که میتوکندری ها نقش مهمی در شکل گیری و حفظ حافظه دارند. میتوکندری اندام مهمی در سلول هاست که وظیفه تولید انرژی را بر عهده دارند. علاوه بر این، میتوکندری ها همچنین در تنظیم متابولیسم کل سلول و تعادل واکنش های ردوکس نقش دارند. مطالعات اخیر همچنین نشان داده‌اند که میتوکندری‌ها می‌توانند با تنظیم تغییرات در تحریک‌پذیری عصبی، بر انجماد حافظه بلندمدت تأثیر بگذارند.

میتوکندری ها مسئول متابولیسم اکسیداتیو در سلول ها هستند و انرژی سلول ها عمدتاً از طریق آدنوزین تری فسفات (ATP) در میتوکندری منتقل می شود. نورون ها به عنوان واحدهای انتقال اطلاعات بدن انسان، نیاز به انرژی بالایی دارند، بنابراین عملکرد طبیعی میتوکندری سالم آنها برای ویژگی های فیزیولوژیکی نورون ها و عملکرد طبیعی سیستم عصبی ضروری است. محققان دریافته اند که در شرایط بیماری یا پیری، سلامت میتوکندری ها آسیب می بیند و عملکرد آنها کاهش می یابد و در نتیجه عملکرد نورون ها کاهش می یابد و بر توانایی حافظه تأثیر می گذارد.

تشکیل و حفظ حافظه به هماهنگی پیچیده بین نورون ها، سیناپس ها و میتوکندری ها به طور همزمان نیاز دارد. در سیناپس‌های انتهای نورون‌ها، میتوکندری‌ها بین نورون‌ها و سلول‌های گلیال قرار دارند که از نورون‌ها پشتیبانی می‌کنند. این سیناپس ها ساختار خاصی دارند و بسیار پلاستیکی هستند که با توجه به نیازهای حافظه و یادگیری قابل تنظیم هستند. میتوکندری‌ها مانند «مرکز تولید» سیناپس‌ها هستند و انرژی و مواد مورد نیاز نورون‌ها و سیناپس‌ها را تأمین می‌کنند که می‌تواند به سرعت تحریک‌پذیری نورون‌ها را تنظیم کند و انعطاف‌پذیری و پایداری طولانی‌مدت سیناپس‌ها را حفظ کند.

یکی دیگر از جهت‌گیری‌های تحقیقاتی مرتبط با میتوکندری و حافظه، درمان سلول‌ها از طریق عوامل مرتبط با تبدیل (نوعی پروتئین) است. این درمان می تواند عملکرد میتوکندری را افزایش دهد، سرعت متابولیسم را افزایش دهد و از سلامت نورون ها و سیناپس ها محافظت کند. بر اساس این مطالعات، پیشنهاد می شود که با تقویت سلامت میتوکندری، می توانیم حافظه و توانایی فکری خود را تقویت کنیم و در عین حال خطر ابتلا به آلزایمر و سایر بیماری های عصبی را کاهش دهیم.

به طور خلاصه، میتوکندری بخشی جدایی ناپذیر از تشکیل و نگهداری حافظه است. سلامت میتوکندری ها برای عملکرد طبیعی نورون ها و سیناپس ها و برای حفظ انعطاف پذیری و ثبات طولانی مدت ضروری است. برای حفظ سلامت میتوکندری، کاهش خطر ابتلا به آلزایمر و سایر بیماری های عصبی و تقویت هوش و حافظه باید به رژیم غذایی، ورزش و عادات سبک زندگی توجه کنیم. مشاهده می شود که ما نیاز به بهبود حافظه داریم و سیستانچ می تواند حافظه را به میزان قابل توجهی بهبود بخشد زیرا می تواند تعادل انتقال دهنده های عصبی مانند افزایش سطح استیل کولین و فاکتورهای رشد را که برای حافظه و یادگیری بسیار مهم هستند، تنظیم کند. علاوه بر این، سیستانش دسرتیکولا می تواند جریان خون را بهبود بخشد و اکسیژن رسانی را تقویت کند، که می تواند اطمینان حاصل کند که مغز تغذیه و انرژی کافی را دریافت می کند و در نتیجه نشاط و استقامت مغز را بهبود می بخشد.

روی روش هایی برای بهبود حافظه خود کلیک کنید

در تأیید این فرضیه، ثابت شده است که GRP78 ماکرواتوفاژی را ترویج می‌کند [4] (که از این به بعد اتوفاژی نامیده می‌شود).

ما به دنبال این بودیم که مشخص کنیم آیا اتوفاژی برای محافظت عصبی ناشی از GRP{0}}با استفاده از چندین تعدیل کننده اتوفاژی خوب مشخص شده است: راپامایسین، که اتوفاژی را با مهار mTORC1 فعال می‌کند و دو مهارکننده جریان اتوفاژی: 3-متیل آدنین ({{4) }}MA)، یک مهارکننده کلاس III فسفاتیدیلینوزیتولکیناز PI3K، و LY294002، یک مهارکننده کلاس I PI3K.

هر سه تعدیل کننده اتوفاژی بقا را در هر دو گروه GFP و GRP78 در سلول های تیمار شده با Tun در مقایسه با وسیله نقلیه کاهش دادند (شکل 4A). این نتایج نشان می‌دهد که شروع صحیح اتوفاژی، از طریق مسیر PI3K-Beclin1، و شار دیررس لازم است، اگرچه کافی نیست، برای اثرات محافظت کننده عصبی بیان بیش از حد GRP78 در سلول‌های تحت استرس ER.

شکل 3. بیان بیش از حد GRP78 اختلال عملکرد میتوکندری را در سلول های تحت استرس NSC34 نجات می دهد. (الف) بلات و نمودار نواری که سطوح GRP78 را در سلول‌های NSC34 که با ناقل پلاسمید برای بیان بیش از حد GRP78 یا یک کنترل پروتئینی غیرمرتبط (GFP) نوکلئوفکت شده‌اند، نشان می‌دهد. (ب) درصد بقای سلول‌های NSC34 بیانگر GFP- یا GRP (میانگین ± SEM) پس از 24 ساعت در محیطی حاوی 1 میکروگرم در میلی‌لیتر تونیکامایسین (Tun) (سمت چپ) یا 1{14}} میکرومولار نوکودازول (سمت راست) با استفاده از سنجش MTT تعیین شد (n=4؛ * p < 0.005،** p <0.001 در مقابل GFP، آزمون t Student ). (C) تجزیه و تحلیل کمی فلورسانس MitoSOX در سلول‌هایی که GFP orGRP78 بیش از حد بیان می‌کنند و با Tun یا وسیله (سمت چپ) یا efavirenz (EFV) به عنوان شاهد یا وسیله (راست) درمان شده‌اند. (د) تجزیه و تحلیل کمی فلورسانس TMRM در سلول هایی که GFP یا GRP78 بیش از حد بیان می کنند و با Tun یا وسیله (سمت چپ) یا EFV یا وسیله (راست) درمان شده اند (GFP-Veh گروه کنترل است). (E) سمت چپ: تجزیه و تحلیل نماینده غلظت O2 (با استفاده از یک الکترود O2 نوع کلارک) به عنوان تابعی از زمان در سلول هایی که GFP یا GRP78 بیش از حد بیان می کنند و با Tun تیمار شده اند. راست: مصرف O2 بعد از 5 ساعت Tuntreatment در سلول هایی که GFP یا GRP78 بیش از حد بیان می کنند (GFP-Veh گروه کنترل است) (n=4؛ * p <0.05 در مقابل Veh-GFP، # p <0.05 در مقابل GRP78، ANOVA یک طرفه).

شکل 4. برچسب گذاری میتوکندری برای میتوفاژی با بیان بیش از حد GRP78 ممتاز است. (الف) نمودار میله‌ای از درصد سلول‌های NSC34 زنده (میانگین ± SEM) نوکلئوفکت‌شده با پلاسمیدهای GFP یا GRP78 و تیمار شده با Tun یا ترکیبی ازTun ​​با تعدیل‌کننده‌های اتوفاژی: راپامایسین (RAPA)، 3MA، یا LY-902، مربوط به وسیله نقلیه کنترل (Veh)، تعیین شده توسط روش MTT 24 ساعت پس از درمان (GFP-Veh گروه کنترل است) (n=4-8، * p <0.05 در مقابل.

Veh-GFP; # p < 0.05 در مقابل Tun-GFP. (B) تصاویر هم کانونی نشان دهنده سلول های نوکلئوفکت شده با PARK{4}}پلاسمید HA به تنهایی (بالا، پانل های میانی، کنترل) یا با پلاسمید GRP78 (پانل‌های پایین) با وسیله (Veh) یا Tun (5 ساعت) درمان شده و برای HA (سبز) و HSP60 (قرمز) رنگ‌آمیزی شده است. نوار مقیاس=10 میکرومتر. (C) میانگین ± SEM ضریب همبستگی پیرسون پارکین و هم‌محل‌سازی Hsp60 از گروه‌های Veh، Tun، و Tun+GRP78 (n=4؛ * p <0.05 در مقابل Parkin-Veh، # p <0.05 در مقابل.

Parkin-Tun، ANOVA یک طرفه). (D) وسترن بلات سمت چپ برای پروتئین‌های مشخص شده در بخش‌های ترکیبی میتوکندری (میتو) و سیتوزولی (سیتو) از سلول‌های GFP- orGRP{3}}که با وسیله نقلیه یا Tun به مدت 5 ساعت درمان شده‌اند. پروتئین های مورد تجزیه و تحلیل عبارتند از OPA{5}}، CV-، PDI، GRP78، باقیمانده های یوبیکوئیتین شده، LC3 و اکتین. سمت راست، نمودار میله‌ای میانگین تغییر برابری GRP78 در هر دو کسر ترکیبی و LC{1{2{2{23}}}}}II در بخش میتوکندری نسبت به اکتین (سیتوزول) یا زیرواحد بتا مجتمع V (CV-B) (میتوکندری) در گروه GFP. (E) نمودار میله ای درصد سلول های زنده (میانگین ± SEM) بیان کننده بیش از حد پروتئین های GFP یا GRP78 و تیمار شده با Tun به تنهایی یا در ترکیب با CCCP، CSA، یا BAPTA-AM، تعیین شده توسط روش MTT 24 ساعت پس از درمان مربوط به تیمار با وسیله نقلیه کنترل سلول ها (F) نمودار میله ای مشابهی از زنده ماندن سلول برای سلول های تیمار شده با تاپسیگارژین (THA)با یا بدون CCCP (GFP-Veh گروه کنترل است) (n=4-8، در 3 آزمایش مختلف، * p <0.05 در مقابل کنترل-Veh;# p <0.05 در مقابل GRP{25}}Tun).

پارکین همیشه در میتوفاژی شرکت نمی کند زیرا می تواند از طریق مکانیسم های جایگزین نیز تحریک شود [46]. برای تعیین اینکه آیا پارکین در اثر واسطه‌شده GRP نقش دارد یا خیر، مکان درون سلولی پارکین با برچسب HA بیان شده در سلول‌هایNSC34 با و بدون استرس ER را تعیین کردیم.

با میکروسکوپ کانفوکال، ما مشاهده کردیم که پارکین پس از 5 ساعت درمان با وسیله نقلیه یا Tun در سراسر سلول NSC34 توزیع شده است (شکل 4B). در مقابل، در سلول هایی که GRP78 بیش از حد بیان می کنند، افزایش هم زمان پارکین با HSP60، یک پروتئین میتوکندری، وجود دارد. ، هدف قرار دادن این اندامک را نشان می دهد (شکل 4B، C).

علاوه بر این، بخش‌های میتوکندری و سیتوزولی را از سلول‌هایی که GFP یا GRP78 بیش از حد بیان می‌کردند جدا کردیم و 5 ساعت پس از توهین با Tun یا وسیله‌ای به عنوان شاهد درمان شدند. خلوص فراکسیون های میتوکندری ادغام شده با تجزیه و تحلیل حضور OPA1 و CV، و عدم وجود یک پروتئین مقیم ER، پروتئین دی سولفید ایزومراز (PDI) تایید شد (شکل 4D).

جالب توجه است، ما همچنین تمایل به افزایش فراوانی GRP78 را در بخش‌های میتوکندری ادغام شده سلول‌های تحت استرس ER در مقایسه با شاهد مشاهده کردیم. توجه داشته باشید که اگرچه محرک Tun همچنین ممکن است باعث افزایش سطح GRP78 در سیتوزول شود، این در بخش میتوکندری دیده نشد.

بیان بیش از حد اجباری GRP78 تمایل به افزایش تجمع PINK1 و پارکین را در بخش میتوکندریایی افزایش داد (شکل 4D و شکل S4). گزارش شده است که وجود پارکینا تجمع Ub را تقویت می کند و میتوفاژی را در مقایسه با حضور PINK به تنهایی افزایش می دهد [42،47]. بر این اساس، ایمونوبلات یوبی‌کوئیتین (Ub) تفاوت‌هایی را در مشخصات آن در بخش‌های میتوکندری از سلول‌های بیان‌کننده GRP در مقایسه با گروه GFP نشان داد (شکل 4D).

تحت شرایط استرس زا، یوبیکوئیتیلاسیون پروتئین میتوکندری منجر به جذب اجزای ماشین اتوفاگوزومی می شود که با تجمع ایزوفرم لیپید شده LC3 و LC3II آغاز می شود [42،48].

پروتئین LC3II فراوان در بخش میتوکندری با تمایل به افزایش حضور بیشتر در سلول‌های تحت استرس که GRP78 را بیش از حد بیان می‌کنند در مورد آنهایی که GFP در شرایط مشابه دارند مشاهده شد (شکل 4D). در مجموع، این داده‌ها نشان می‌دهند که بیان اجباری GRP78 می‌تواند جابه‌جایی میتوکندری را تسهیل کند. برچسب گذاری برای میتوفاژی

برای تعیین ارتباط احتمالی القای میتوفاژی با اثر محافظت عصبی ناشی از بیان بیش از حد GRP78، ما تغییرات ناشی از فعال‌کننده‌ها و مهارکننده‌های میتوفاژی را ارزیابی کردیم. ما از کربونیل سیانید m-کلروفنیل هیدرازین (CCCP) برای جداسازی شیمیایی فسفوریلاسیون اکسیداتیو و القای میتوفاژی با فروپاشی پتانسیل غشای میتوکندری [49،50]، و همچنین دو مهار کننده میتوفاژی استفاده کردیم: BAPTA-AM، یک سلول نفوذگر سلولی. 2+ و سیکلوسپورین A (CSA)، بازدارنده منافذ انتقال نفوذپذیری تمیتوکندری (mPTP) که خروج کلسیم از میتوکندری را مسدود می‌کند [51].

اگرچه درمان CCCP در NSC34 برای کاهش قابل توجه زنده ماندن ناکافی بود، همانطور که به طور گسترده گزارش شده است، ما دریافتیم که همان درمان روی سلول های تحت استرس ER، بقای آن را افزایش می دهد، صرف نظر از اینکه آیا GRP78 بیش از حد بیان شده است یا نه (شکل 4E).

به طور مهمی، اثر محافظت عصبی که توسط بیان بیش از حد GRP78 بر روی سلول‌های تحت استرس ER ایجاد می‌شود، در حضور CSA یا BAPTA-AM لغو شد (شکل 4E). این یافته‌ها نشان می‌دهد که القای میتوفاژی به سلول‌ها اجازه می‌دهد تا با استرس ER و شار Ca{4} مقابله کنند. برای اثر محافظتی عصبی ارتقا یافته توسط GRP78 مهم است.

یکی از امکان‌های GRP78 برای القای میتوفاژی ممکن است تسهیل فعالیت‌های ضروری با واسطه‌ی Ca از ER تا میتوکندری. ما می‌خواستیم این امکان را با ممانعت از فعال‌سازی IP3R با استفاده از thapsigargin (THA)، یک مهارکننده Ca{9}} ATPase [52] بررسی کنیم.

Thapsigargin همچنین به عنوان تولید استرس ER در سلول ها شناخته شده است زیرا این درمان ذخایر Ca{0}} را از ER تخلیه می کند و بنابراین بیان GRP78 را به عنوان بخشی از پاسخ پروتئین تاشو متعارف افزایش می دهد [53]. شکل 4F نشان می‌دهد که تاپسیگارژین بر زنده‌مانی سلولی تأثیر می‌گذارد مانند درمان تونیکامایسین در سلول‌های کنترل GFP و درمان همزمان CCCP همانطور که با Tun مشاهده شد، از مرگ سلولی جلوگیری می‌کند.

با این حال، بیان بیش از حد اجباری GRP78 قادر به مسدود کردن اثر مضر تاپسیگارگین مانند توهین تونیکامایسین نبود. این مشاهدات دخالت ضروری شار Ca2+ را در اثر محافظت عصبی GRP78، احتمالاً از طریق IP3R تأیید می‌کند.

3.1.4. محافظت عصبی با واسطه GRP78 به PINK1 و IP3R بستگی دارد

برای شروع شناسایی واسطه‌های اثر محافظت عصبی GRP78، از فناوری shRNA استفاده شد. ابتدا، ما تأیید کردیم که shRNA انتخاب شده بیان GRP78، PINK1، یا IP3R را به ترتیب کاهش می‌دهد (شکل S4A-C) و اینکه آنها قابلیت حیات سلول‌های کنترل را به خطر نمی‌اندازند (شکل S4D). ما ابتدا تأیید کردیم که بیان خود GRP78 برای محافظت عصبی با واسطه GRP{7}} و CCCP برای رویارویی با استرس ناشی از Tun-ER ضروری است (شکل 5A).

در مرحله بعد، خاموش کردن PINK1 یا IP3R باعث مسدود شدن اثر محافظتی عصبی ناشی از بیان بیش از حد GRP78 یا درمان CCCP شد (شکل 5A). علاوه بر این، ما متوجه شدیم که تغییر GRP78، که معمولاً در یک توزیع لکه‌ای صاف در اطراف هسته توزیع می‌شود، زمانی که بیش از حد بیان می‌شود، به IP3R در کانون‌های لکه‌ای محلی می‌شود (شکل 5B).

این نتایج با هم نشان می‌دهد که GRP78 میتوفاژی محافظ را در مدل in vitro ما تعدیل می‌کند، و این محافظت عصبی را به شیوه‌ای وابسته به PINK1- و IP3R اعمال می‌کند.

4. بحث

تقویت مکانیسم‌های درون‌زا محافظت عصبی ممکن است ابزارهای درمانی کارآمدی را برای جلوگیری از فرآیندهای تخریب‌کننده عصبی پس از ضایعات یا بیماری‌های تروماتیک به همراه داشته باشد. مدل ها [4].

برای تعیین مکانیسم‌های زمینه‌ای، ما از مدلی از بریدگی ریشه نخاعی [55] استفاده کردیم که اتصال نورون‌های حرکتی را مختل می‌کند و باعث ایجاد یک فرآیند تخریب‌کننده عصبی رتروگراد می‌شود [20].

مرگ نورون حرکتی در این مدل با استرس ER، یک شار اتوفاژی مسدود شده مشخص می‌شود، و غیرآپوپتوز است زیرا هیچ گونه فعالی از کاسپاز 3 یا 12 مشاهده نشد، که نشان می‌دهد آپوپتوز مجری نهایی مرگ نورون نیست [20]. بر این اساس، ما قبلاً با رویکردهای پروتئومیکس تأیید کردیم که ویژگی‌های ضد آپوپتوز به موازات موارد آپوپتوز پس از RA رخ می‌دهند و اجرای موثر آپوپتوز را مسدود می‌کنند [25].

در آن زمینه عصبی، بیان بیش از حد GRP78 محافظت عصبی حرکتی را اعمال کرد [20،26،27]. در اینجا، در ابتدا، ما از تجزیه و تحلیل مقایسه ای و کمی بی طرفانه پروتئوم استفاده کردیم تا پایه اولیه این محافظت عصبی را کشف کنیم.

به طور غیرمنتظره، میتوکندری ها هدف اصلی بودند، با محتوای پروتئین اندامک کاهش یافته همراه با تزئینات میتوکندری غرق شده در وزیکول های درون نورون های حرکتی آسیب دیده که GRP78 را بیش از حد بیان می کردند.

این مشاهدات وجود میتوفاژی را به عنوان یک عنصر کلیدی برای محافظت عصبی پیشنهاد می‌کند. آزمایش‌های Deeperin vitro این فرضیه را تأیید کردند زیرا GRP78 با بازیابی تنفس میتوکندری و سطوح ROS، (ب) تحریک جابه‌جایی میتوکندری PINK1/PARKIN، برچسب‌گذاری اندامک برای میتوفاژی، و (iii) بسته به عملکرد IP3R به‌عنوان یک واسطه ضروری، حفاظت عصبی را تأیید کرد.

با توجه به دانش ما، این اولین مطالعه است که نشان می دهد بیان بیش از حد GRP78 باعث میتوفاژی محافظتی می شود. علاوه بر نقش GRP78 در همپیوندی پروتئین های تاشو نادرست و سایر عملکردهای مهتابی به عنوان یک پروتئین اتصال دهنده کلسیم [4،56]، ما عملکرد فعال آن را به آن اضافه کردیم. تحریک میتوفاژی علاوه بر این، مطالعه ما به مجموعه ای از مطالعات اخیر می پیوندد که استرس ER را با اختلال عملکرد میتوکندری مرتبط می کند [57-59].

هنگامی که GRP78 بیش از حد بیان شد و محافظت عصبی را ارتقا داد، ما علائم مشخصی را برای میتوفاژی در داخل بدن یافتیم. همین امر با استفاده از مدل‌های آزمایشگاهی مشاهده شد که برخی از ویژگی‌های فرآیند تخریب عصبی را که پس از RA رخ می‌دهد مانند استرس ER تقلید می‌کنند [20،26].

کنترل کیفیت میتوکندری توسط میتوفاژی برای نظارت بر محتوای میتوکندری و هموستاز متابولیسم بسیار مهم است. در ادبیات، هنوز این بحث وجود دارد که آیا القای میتوفاژی به دلیل تداخل گسترده آن با سیگنال آپوپتوز باعث بقا یا مرگ سلولی در چندین بیماری می شود [60]، اگرچه توضیح داده شده است که پاکسازی میتوکندری های آسیب دیده نقش اساسی در بیماری های تخریب کننده عصبی مانند بیماری آلزایمر دارد. ، بیماری پارکینسون یا پیری [61].

قبلاً گزارش شده بود که GRP78 با جلوگیری از القای CHOP [62،63]، فعال شدن کاسپاز 7 [5] یا با فعال کردن محور سیگنالینگ PI3K-AKT-mTOR [4]، آپوپتوز ایجاد شده توسط استرس ER را مهار می کند. همچنین ثابت شده است که سطوح پایین استرس اکسیداتیو و آسیب DNA را حفظ می کند [4،64]. به طور خاص، در سلول های سرطانی، نشان داده شده است که GRP78 با فعال کردن سیگنال های شبکه آندوپلاسمی آندوپلاسمی کیناز (PERK)-NRF2 پروتئین کیناز ROS را کاهش می دهد [65،66] که منجر به تنظیم مثبت ژن های مرتبط با آنتی اکسیدان و همچنین افزایش سطح پروتئین می شود. آنزیم های گلیکولیتیک [67].

در عوض، ما دریافتیم که بیان بیش از حد GRP78 آنزیم‌های گلیکولیتیک (مانند ENO1 و ENO2) را کاهش می‌دهد (جدول تکمیلی). این نتایج ممکن است نشان دهد که در مدل ما، تضعیف مشاهده‌شده ROS ممکن است به افزایش میتوفاژی مرتبط باشد، اگرچه جزئیات مکانیسم درگیر باید بیشتر مورد بررسی قرار گیرد. اختلال عملکرد میتوکندری یک وضعیت شایع در بیماری‌های نورودژنراتیو است [68]، و میتوفاژی نیز درگیر شده است. در پارکینسون [49،69]، هانتینگتون [70،71]، و بیماری های آلزایمر و تائوپاتی [72].

چندین نویسنده خاطرنشان کردند که با تنظیم صحیح مسیرهای میتوفاژی، بدن می تواند از گونه های اکسیداتیو مضر اجتناب کند و تعادل ردوکس و هموستاز را تنظیم کند [73]. بنابراین، بیان بیش از حد GRP78 از طریق این القای میتوفاژی کنترل‌شده ممکن است یک استراتژی محافظت کننده عصبی در این بیماری‌ها در نظر گرفته شود. به نظر می‌رسد که محافظت عصبی با واسطه بیان بیش از حد GRP78 به شار Ca{3}} وابسته باشد زیرا توسط BAPTA-AM مسدود شده است. کلات BAPTA-AM Ca{6}} ممکن است در چندین مرحله مختلف در امتداد مسیر شار اتوفاژیک مداخله کند و نه تنها شروع اتوفاژی را مسدود کند، بلکه مراحل تشکیل و پردازش اتوفاگوزوم ها را نیز مهار کند [74].

در مقابل، استفاده از عامل دیگری که بر شار Ca{0}} تأثیر می‌گذارد، مانند آستاپسیگارگین، نتایج شگفت‌آوری به همراه داشت. Thapsigargin شبکه سارکو آندوپلاسمی Ca2+ ATPases (SERCAs) را مسدود می‌کند، افزایش سیتوزولی Ca{3}} را حفظ می‌کند، اما همچنین باعث استرس ER از طریق تخلیه مزمن ذخایر کلسیم داخل سلولی و تجمع پروتئین‌های بازشده می‌شود.

در این وضعیت، مشاهده کردیم که بیان بیش از حد GRP78 نمی‌تواند سلول‌های در حال مرگ را نجات دهد، و ما مشکوک بودیم که ممکن است به این دلیل باشد که thapsigargin همچنین از عملکرد IP3R جلوگیری می‌کند [52]. فعالیت IP3R پایه و شار مداوم کلسیم در سطح پایین از ER به میتوکندری برای ترویج تنفس میتوکندری و انرژی زیستی سلولی ضروری است [75].

GRP78 با MAMها با یک کمپلکس تشکیل شده توسط گیرنده سیگما{1} (SIGR1) و IP3R تعامل دارد [76،77]. با استرس ER، برهمکنش SIGR1-GRP78 ناشی از کاهش کلسیم کاهش می‌یابد و متعاقباً شار Ca2+ از ER به میتوکندری از طریق IP3Rها افزایش می‌یابد [76]. علاوه بر این، همچنین نشان داده شد که IP3R برای میتوفاژی ناشی از پارکین به ویژه برای اجازه دادن به خوشه‌بندی میتوکندریایی در پایین دست پارکین ضروری است [78].

نتایج ما با آن موافق است زیرا کاهش IP3R توسط فناوری shRNA، محافظت عصبی اعمال شده توسط بیان بیش از حد GRP78 در سلول‌های تحت استرس ER را لغو کرد. مشاهدات که GRP78 ممکن است در بخش میتوکندری افزایش یابد نیز جالب است. GRP78 در فضای میانی غشای داخلی و ماتریکس میتوکندری شناسایی شده است، اگرچه عملکرد آن در آنجا هنوز مشخص نشده است [79].

با این وجود، و با توجه به عملکردهای متعدد آن، ما حدس می زنیم که می تواند بافر Ca2+ باشد. اگر چنین بود، افزایش حضور آن در داخل میتوکندری در سلول‌های تحت استرس ER در صورت بروز بیش از حد ممکن است هجوم کلسیم{2}} را کاهش دهد تا از ایجاد آپوپتوز جلوگیری شود. آزمایش بیشتر در مورد آن بسیار ارزشمند خواهد بود.

محدودیت های مطالعه و تحقیقات آینده

این مطالعه راه را برای تجزیه و تحلیل های آینده در مورد نقش محافظت کننده عصبی میتوفاژی وابسته به GRP در مرگ عصبی پس از تروما عصبی هموار می کند. اولین محدودیت این مطالعه این است که میتوفاژی در یک پنجره زمانی خاص پس از RA مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و از آنجایی که میتوفاژی یک فرآیند پویا است، رمزگشایی جریان آن و اینکه کدام مولکول‌ها درگیر هستند جالب خواهد بود.

بنابراین، آزمایش‌های بیشتری برای تعدیل میتوفاژی (از طریق روش‌های دارویی یا ژنتیکی) مورد نیاز است تا مشخص شود آیا اثرات مشاهده شده در داخل بدن کاملاً به میتوفاژی وابسته است یا خیر.

این به ما اجازه می دهد تا تأیید کنیم که بیان بیش از حد GRP78 بقای MN را از طریق میتوفاژی افزایش می دهد. از آنجایی که بین میتوکندری و آپوپتوز یک پیوند به خوبی توصیف شده وجود دارد، دستکاری‌های بیشتر در شرایط in vitro و in vivo برای رمزگشایی اینکه کدام مکانیسم مرگ باعث مرگ MN در مدل ما می‌شود، ضروری است. این به روشن شدن اینکه آیا GRP78 مستقیماً مکانیسم مرگ سلولی را با مسدود کردن آن تعدیل می کند یا خیر یا اینکه حضور آن به MN ها اجازه می دهد تا با آن کنار بیایند و زنده بمانند، کمک می کند.

5. نتیجه گیری

مطالعه حاضر اولین موردی بود که نقش جدیدی را برای GRP78 در تعدیل میتوفاژی برای دستیابی به محافظت نورون حرکتی توصیف کرد. نتایج ما نشان می‌دهد که GRP78 می‌تواند میتوفاژی را برای ارتقای محافظت عصبی از نورون‌های حرکتی در حال انحطاط به دنبال آسیب عصبی شدید تروماتیک، بازیابی عملکرد آسیب‌دیده میتوکندری در سلول‌های عصبی تحریک کند. علاوه بر این، این محافظت عصبی با واسطه GRP به PINK1 و IP3R وابسته است. بنابراین، فعال سازی میتوفاژی تنظیم شده، از طریق ژن درمانی با GPR78 یا سایر نامزدها، ممکن است به عنوان یک رویکرد درمانی جدید برای آسیب های تروماتیک سیستم عصبی استفاده شود. .

مواد تکمیلی: موارد زیر به صورت آنلاین در https://www.mdpi.com/article/10.3390/biomedicines9081039/s1 موجود است. شکل S1: تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک. شکل S2: سطوح GRP78 درون زا پس از درمان Tun. شکل S3: Tun و EFV باعث اختلال عملکرد میتوکندری در سلول های NSC34 می شوند. شکل S4: بدون عنوان. شکل S5: تجزیه و تحلیل بقای سلول پس از تکثیر هسته shRNA مواد تکمیلی همچنین شامل جداول با تمام پروتئین های شناسایی شده در آنالیز پروتئومی است.

مشارکت نویسنده: TL-R. و DR-G. آزمایش ها را طراحی و اجرا کرد، نتایج را تجزیه و تحلیل کرد و بخشی از نسخه خطی را نوشت. MH-G. و JF با آزمایش های in vivo کمک کردند.PM-G. و JML خالص سازی میتوکندری را انجام دادند. MP، CB و NA به تجزیه و تحلیل عملکردی میتوکندری کمک کردند. VP و AB تمام پلاسمیدهای GRP78 و ناقلهای ویروسی مورد استفاده را تهیه کردند. CC تمام آزمایش ها را تصور، طراحی، نظارت و تجزیه و تحلیل کرد و نسخه خطی آن را نوشت. همه نویسندگان نسخه منتشر شده نسخه خطی را خوانده و با آن موافقت کرده اند.

بودجه: این کار عمدتاً توسط وزارت اقتصاد و رقابت اسپانیا (#SAF 2014-59701) و توسط Marató de TV3 (#201607.10) پشتیبانی شد. ما همچنین از حمایت مالی CIBERNED و Generalitat de Catalunya سپاسگزاریم. CB دریافت کننده قرارداد Miguel Servet (CP19/00077) از موسسه بهداشت کارلوس III است.

بیانیه هیئت بررسی نهادی: همه رویه‌هایی که شامل حیوانات می‌شد توسط دانشگاه Autònoma de Barcelona و Generalitat de Catalunya تأیید شد و از دستورالعمل شورای جامعه اروپایی 2010/63/EU پیروی کرد.

بیانیه رضایت آگاهانه: قابل اجرا نیست.

بیانیه در دسترس بودن داده ها: تمام داده های تولید شده یا تجزیه و تحلیل شده در این مطالعه در این مقاله منتشر شده و فایل های اطلاعات تکمیلی آن گنجانده شده است.

تشکر و قدردانی: ما از مارتا مونسرات، آریادنا آرانسانز، میگل چیلون، جولیا لورنزو، سارا مارمولجو، و گروه نوروپلاستی و بازسازی در UAB تشکر می کنیم. ما از Carlos Guillem (دانشگاه Complutense de Madrid) به خاطر ارائه مهربانی PARK2-HAplasmid و Elena Galea و Esther Dalfo در UAB برای آنتی بادی‌ها تشکر ویژه داریم.

تضاد منافع: نویسندگان هیچ گونه تضاد منافع را اعلام نمی کنند.

بیانیه ویژه: نویسندگان مایلند به یاد کیتی کاساس، دانشمند تأثیرگذار و فردی شگفت انگیز و شجاع، که در سن 54 سالگی نابهنگام درگذشت، یادبود ویژه ای اختصاص دهند. اشتراک بخشی از او باعث افتخار و افتخار بوده است. زندگی، ظرفیت حرفه ای و ارزش های اخلاقی و انسانی او.

مراجع

1. کنفورتی، ال. گیلی، جی. کلمن، نماینده انحطاط والرین: یک مسیر مرگ آکسون در حال ظهور که آسیب و بیماری را به هم مرتبط می کند. Nat.Rev. نوروسک. 2014، 15، 394-409. [CrossRef]

2. رومئو گیتارت، دی. فورس، جی. هراندو-گرابولوسا، ام. والس، آر. لیوا رودریگز، تی. گالیا، ای. گونزالس-پرز، اف. ناوارو، ایکس.؛ پتگنیف، وی. بوش، آ. و همکاران داروی محافظت کننده عصبی برای ترومای عصبی با استفاده از هوش مصنوعی کشف شد. علمی Rep. 2018, 8,1879. [CrossRef]

3. رومئو گیتارت، دی. فورس، جی. ناوارو، ایکس. Casas، C. تقویت بازسازی و کاهش آتروفی عضلانی عصب کشی شده توسط NeuroHealin یک مدل پیش بالینی از برداشتن ریشه کمر با کاشت مجدد تاخیری. علمی Rep. 2017, 7, 12028. [CrossRef]

4. Casas، C. Grp78 در مرکز مرحله در تخریب عصبی و سرطان. جلو. نوروسک. 2017، 11، 1-15. [CrossRef]

5. ردی، ر.ک. مائو، سی. باومایستر، پی. آستین، آرسی کافمن، RJ; لی، AS پروتئین چاپرون شبکه آندوپلاسمی GRP78 از سلول ها در برابر آپوپتوز ناشی از مهارکننده های توپوایزومراز محافظت می کند. نقش سایت اتصال ATP در سرکوب فعال شدن کاسپاز{2}}. جی. بیول. شیمی. 2003، 278، 20915–20924. [CrossRef] [PubMed]

6. وانگ، م. کافمن، RJ پروتئین در شبکه آندوپلاسمی به‌عنوان مجرای بیماری‌های انسانی تاخوردگی نادرست دارد. Nature 2016, 529,326–335. [CrossRef] [PubMed] 7. پرینتسف، آی. کوریل، دی. کنترل کمیت پروتئین غشایی Carraway، KL در شبکه آندوپلاسمی. J. Membr. Biol. 2016,250، 1-14. [CrossRef] [PubMed]

8. Shu, C.-W.; Sun، F.-C.; چو، J.-H. لین، سی.-سی. لیو، پی.-ف. چن، P.-Y. چانگ، MD-T. فو، H.-W. لای، ی.-ک. GRP78 و Raf با همکاری یکدیگر در برابر آپوپتوز ناشی از استرس شبکه آندوپلاسمی مقاومت ایجاد می‌کنند. جی. سلول. فیزیول. 2008، 215، 627-635. [CrossRef]

9. کوک، KL; کلارک، آر. شوک حرارتی 70 کیلو دالتون پروتئین 5/پروتئین تنظیم شده با گلوکز 78 "AMP" که باعث اتوفاژی می شود. اتوفاژی 2012، 8،1827-1829. [CrossRef]

10. لی، ز. وانگ، ی. نیوتن، IP; ژانگ، ال. جی، پی. Li, Z. GRP78 در تعدیل گلیکولیز هوازی تومور با ترویج تخریب اتوفاژیک IKK نقش دارد. سلول سیگنال. 2015، 27، 1237-1245. [CrossRef]

11. چا-مولستاد، اچ. یو، جی; لی، SH; کیم، جی جی. سونگ، KS; هوانگ، جی. یو، وای. لی، YJ; کیم، ST; لی، دی اچ. و همکاران تعدیل فعالیت SQSTM1/p62 توسط آرژینیلاسیون N ترمینال چپرون شبکه آندوپلاسمی HSPA5/GRP78/BiP. اتوفاژی 2016، 12، 426-428. [CrossRef]

12. چا-مولستاد، اچ. سونگ، KS; هوانگ، جی. کیم، کا. یو، جی; یو، وای. جانگ، جی.ام. هان، دی اچ. مولستاد، م. کیم، جی جی. و همکاران. آرژینیلاسیون آمینو ترمینال، چاپرون BiP شبکه آندوپلاسمی را برای اتوفاژی از طریق اتصال p62 هدف قرار می دهد. نات. Cell Biol.2015، 17، 917-929. [CrossRef] [PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com