عصاره سلولی سامباک یاس به عنوان تقویت کننده آنتی اکسیدان در برابر پیری پوست قسمت 1

خلاصهاسترس اکسیداتیو از طریق تولید گونه های فعال اکسیژن و تشکیل محصولات نهایی گلیکاسیون پیشرفته (AGEs) نقش عمده ای در روند پیری پوست ایفا می کند. بنابراین ترکیبات آنتی اکسیدانی در بازار مراقبت از پوست مورد نیاز هستند و استفاده از مولکول های حاصل از کشت سلول های گیاهی فرصت منحصر به فردی را فراهم می کند. در این مقاله، ویژگی‌های یک عصاره هیدرواتانولی به‌دست‌آمده از سلول‌های سامباک یاس (JasHEx) مورد بررسی قرار گرفت. خواص آنتی اکسیدانی و ضد AGE با یک رویکرد چند رشته‌ای با ترکیب آزمایش‌های طیف‌سنجی جرمی و بیو انفورماتیک در شرایط in vitro و ex vivo مورد بررسی قرار گرفت. JasHEx حاوی مشتقات فنولیک اسید، لیگنان ها و تری ترپن ها است و مشخص شد که تولید گونه های اکسیژن فعال سیتوزولی را در کراتینوسیت های در معرض استرس اگزوژن کاهش می دهد. همچنین توانایی کاهش تشکیل AGE و افزایش تولید کلاژن نوع I در ماتریکس خارج سلولی را نشان داد. داده ها نشان داد که خواص آنتی اکسیدانی JasHEx به مهار رادیکال های آزاد و فعالیت های کیلیت فلز و فعال شدن مسیر Nrf2/ARE مربوط می شود. این به خوبی می تواند فعالیت ضد التهابی JasHEx مربوط به کاهش سطح NO در ماکروفاژهای تحریک شده با LPS را توضیح دهد. بنابراین، JasHEx را می توان یک تقویت کننده آنتی اکسیدانی قوی در برابر پیری پوست ناشی از استرس اکسیداتیو در نظر گرفت.

گلیکوزید سیستانچ همچنین می تواند فعالیت SOD را در بافت های قلب و کبد افزایش دهد و به طور قابل توجهی محتوای لیپوفوسین و MDA را در هر بافت کاهش دهد و به طور موثر رادیکال های مختلف اکسیژن فعال (OH-، H2O2 و غیره) را از بین ببرد و از آسیب DNA ناشی از آن محافظت کند. توسط رادیکال های OH گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید سیستانچ توانایی مهار قوی رادیکال های آزاد، توانایی کاهش بالاتری نسبت به ویتامین C، بهبود فعالیت SOD در سوسپانسیون اسپرم، کاهش محتوای MDA و اثر محافظتی خاصی بر عملکرد غشای اسپرم دارند. پلی ساکاریدهای سیستانچ می توانند فعالیت SOD و GSH-Px را در گلبول های قرمز و بافت ریه موش های آزمایشگاهی مسن ناشی از D-گالاکتوز افزایش دهند و همچنین محتوای MDA و کلاژن را در ریه و پلاسما کاهش دهند و محتوای الاستین را افزایش دهند. اثر پاک کنندگی خوب بر روی DPPH، طولانی شدن زمان هیپوکسی در موش های پیر، بهبود فعالیت SOD در سرم، و به تاخیر انداختن انحطاط فیزیولوژیکی ریه در موش های آزمایشگاهی پیر. و این پتانسیل را دارد که دارویی برای پیشگیری و درمان بیماری های پیری پوست باشد. در عین حال، اکیناکوزید موجود در سیستانچ توانایی قابل توجهی در از بین بردن رادیکال های آزاد DPPH دارد و می تواند گونه های فعال اکسیژن را از بین ببرد، از تخریب کلاژن ناشی از رادیکال های آزاد جلوگیری کند و همچنین اثر ترمیم خوبی بر آسیب آنیون رادیکال آزاد تیمین دارد.

روی Where Can I Buy Cistanche کلیک کنید

【برای اطلاعات بیشتر:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

کلید واژه ها: پیری پوست گونه های اکسیژن فعال (ROS)؛ محصولات نهایی گلیکاسیون پیشرفته (AGEs)؛ عصاره هیدروالکلی سامباک یاس (JasHEx); طیف سنجی جرمی؛ متابولومیک؛ شبکه اجتماعی مولکولی محصول طبیعی جهانی (GNPS)؛ فاکتور هسته ای اریتروئید 2-فاکتور 2 مرتبط (Nrf2)

1. معرفی

عوامل درونی ژنتیکی و عوامل بیرونی مانند تابش فرابنفش، تابش مادون قرمز، بیگانه‌بیوتیک‌ها و آلاینده‌های محیطی باعث تولید گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) می‌شوند. آنها با فعال شدن زنجیره تنفسی میتوکندری، سیتوکروم p450 و NADPH اکسیدازها تولید می شوند [1]. ROS شامل رادیکال‌های آزاد (آنیون سوپراکسید، رادیکال هیدروپراکسیل، رادیکال آلکوکسی و رادیکال هیدروکسیل) و مولکول‌های غیر رادیکال (پراکسید هیدروژن و اکسیژن منفرد) است [2]. هنگامی که سیستم های آنتی اکسیدانی غرق می شوند، ROS در سلول ها تجمع می یابد و به اصطلاح استرس اکسیداتیو را ایجاد می کند که عامل اصلی پیری پوست است [3].

در واقع، استرس اکسیداتیو هم باعث آسیب DNA و هم اکسیداسیون لیپید و پروتئین می شود همراه با راه اندازی مسیر پروتئین کینازهای فعال شده با میتوژن (MAPK) (AKT، JNK، ERK، و p38) [4]. این به نوبه خود بیان سیتوکین های پیش التهابی، فاکتورهای رشد و مولکول های چسبنده را از طریق تحریک فاکتورهای رونویسی AP-1 و NF-kB ترویج می کند. علاوه بر این، فعال شدن مسیر MAPK با کاهش سطح کلاژن باعث تغییرات ماتریکس پوستی می شود. با تعدیل بیان متالوپروتئینازهای ماتریکس (MMPs) و مهارکننده‌های بافتی آنها TIMPs، تجزیه کلاژن را تسریع می‌کند و با مسدود کردن گیرنده TGF- نوع II/ سیگنال‌دهی Smad، سنتز کلاژن جدید را کاهش می‌دهد. علاوه بر این، استرس اکسیداتیو شرایط پوست را تغییر می دهد و گرادیان کلسیم اپیدرم را مختل می کند، که برای یکپارچگی و عملکرد پوشش شاخدار ضروری است، عملکرد غدد سباسه را تحریک می کند و باعث تخریب ملانوسیت می شود [5].

به موازات آن، تشکیل مولکول های زیستی اصلاح شده که به عنوان محصولات نهایی گلیکاسیون پیشرفته (AGEs) شناخته می شوند، باعث افزایش استرس اکسیداتیو در سلول ها و بافت ها می شود [6]. توسعه این نشانگرهای زیستی پیری توسط عوامل محیطی مختلف مانند دود سیگار، سطوح بالای رژیم های غذایی با کربوهیدرات تصفیه شده و ساده، غذاهای پخته شده با دمای بالا و سبک زندگی بی تحرک القا می شود. AGE ها محصولات پایدار و برگشت ناپذیری هستند که از واکنش غیر آنزیمی بین قندهای احیا کننده و پروتئین ها، اسیدهای نوکلئیک یا لیپیدها به دست می آیند و به دنبال آن بازآرایی های بیشتر انجام می شود [7]. در واقع، نقطه شروع تشکیل AGE واکنش میلارد است که در آن گروه‌های کربونیل قندهای احیاکننده به طور برگشت‌پذیر با گروه‌های آمینه آزاد پروتئین‌ها، اسیدهای نوکلئیک یا آمینوفسفولیپید واکنش می‌دهند تا بازهای شیف را تشکیل دهند. این ایمین ها به طور خود به خود به کتامین پایدارتری که محصولات آمادوری نامیده می شود، بازآرایی می شوند. آنها دی کربونیل های واکنشی (به عنوان گلیوکسال یا متیل گلیوکسال) تولید می کنند که با گروه های عملکردی پروتئین های لیزین و آرژنین واکنش می دهند و تنوع زیادی از AGE ها را به وجود می آورند [8،9]. آنها بر اساس توانایی آنها در انتشار فلورسانس و تشکیل پیوندهای عرضی به گروه های مختلفی طبقه بندی می شوند.

عمل AGE توسط گیرنده های AGE ها (RAGEs) که پروتئین های گذرنده متعلق به ابرخانواده ایمونوگلوبولین های مولکول های سطح سلولی نوع I هستند، انجام می شود که در انواع مختلف سلول از جمله کراتینوسیت ها، فیبروبلاست ها و ماکروفاژها بیان می شوند. اتصال AGEs/RAGEs تولید ROS را عمدتاً با فعال‌سازی NADPH اکسیدازها (NOX) و زنجیره تنفسی میتوکندری افزایش می‌دهد که منجر به استرس اکسیداتیو و تمام اثرات متعاقب آن می‌شود [6،8].

علاوه بر این، پروتئین های ماتریکس خارج سلولی (ECM)، به ویژه کلاژن، به گلیکوزیشن بسیار حساس هستند. در واقع، سطوح ساختار AGE پنتوسیدین، مشتق شده از کلاژن، در افراد مسن به طور قابل توجهی بالاتر از افراد جوان است [10]. گلیکاسیون کلاژن نه تنها خواص مکانیکی خود کلاژن را تغییر می‌دهد، که سفت‌تر و شکننده‌تر می‌شود [11]، بلکه خواص ماتریکس خارج سلولی را نیز تغییر می‌دهد و بر رفتار سلول‌های ساکن (رشد، تمایز، تحرک، بیان ژن و پاسخ به سیتوکین ها) و برهمکنش های ماتریکس-سلول [12].

در این سناریو، مواد آنتی اکسیدانی در زمینه آرایشی برای کاهش تشکیل AGE و آبشار اکسیداتیو مربوط به آنها تقاضای زیادی دارند: عصاره های مشتق شده از گونه Jasminum sambac، متعلق به خانواده Oleaceae، به دلیل خواص آنتی اکسیدانی و استفاده مشترک آنها در مردم جالب هستند. دارو برای درمان بیماری های پوستی [13]. با این حال، عصاره های گیاهی معایب متعددی مانند پایداری زیستی ضعیف، آلودگی بالقوه با آفت کش ها، کودها یا عوامل بیماری زا، و تنوع ترکیب کمی و کیفی آنها تحت تأثیر فصول و شرایط محیطی را نشان می دهند. یک جایگزین معتبر برای گیاهان، به‌عنوان منبعی از مواد آرایشی فعال زیستی، توسط کشت‌های سلولی گیاهی ارائه می‌شود که چندین مزیت را ارائه می‌دهند: (1) پایداری بالای فرآیند تولید، زیرا به زمین کشاورزی نیاز نیست. (2) عرضه مستمر محصولات طبیعی بدون وابستگی جغرافیایی، فصلی و چرخه تولیدمثلی گیاهی؛ (iii) عدم خطر آلودگی توسط پاتوژن ها، آلاینده های محیطی، و باقی مانده های شیمیایی کشاورزی؛ (IV) شرایط رشد استاندارد که امکان دستیابی به نرخ‌های بالاتر و قابل تکرار بیشتری از زیست توده و عملکرد متابولیت را فراهم می‌کند. (v) تطبیق پذیری بالا، زیرا غلظت ترکیبات را می توان با تغییر شرایط کشت و (vi) پروتکل های استخراج آسان تر و وقت گیرتر، کاهش نیاز به حلال های تهاجمی بهینه کرد [14،15].

در اینجا، یک عصاره هیدرواتانولی مشتق شده از کشت های سلولی سامباک یاس (JasHEx) مورد مطالعه قرار گرفت. هدف از مطالعه ما توصیف شیمیایی و بیولوژیکی گسترده JasHEx، به ویژه بررسی خواص ضد گلیکوزیشن و ضد پیری آن است. ابتدا، رویکردهای مبتنی بر طیف سنجی جرمی پیشرفته برای به دست آوردن مشخصات ساختاری دقیق از عصاره استفاده شد. سپس، آزمایش‌های in vitro و ex vivo برای اثبات فعالیت بیولوژیکی JasHEx به عنوان یک آنتی اکسیدان انجام شد.

2. مواد و روشها

2.1. کشت بافت گیاهی و تهیه عصاره

یاس عربی معتبر (Jasminum sambac) از یک مهد کودک محلی ("Ladre di Piante"، Pistoia، منطقه Toscana، ایتالیا) به دست آمد. برگهای سامباک یاس در اتانول 70 درصد (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) به مدت 1 دقیقه خیسانده شدند و با 1 درصد (v/v) سفیدکننده تجاری تکمیل شده با Tween 2{{{{{ 9}} (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) به مدت 8 دقیقه و سپس سه بار شستشو در آب مقطر استریل. سپس برگ‌ها به قطعات 5-1.5 سانتی‌متری برداشته شدند و روی محیط کشت کامل MS [16] حاوی 3 درصد (w/v) ساکارز، 0 کشت شدند. .2 mg/L 2,4D و 8 g/L فیتوآگار. ریزنمونه ها به مدت سه ماه به صورت ماهانه در محیط کشت تازه کشت شدند. هنگامی که کالوس سبز مایل به زرد، شکننده و با رشد سریع به دست آمد، سلول های گیاهی به محیط مایع MS، همراه با 3 درصد (وزنی/حجم) ساکارز و 0.2 میلی گرم در لیتر 2,4D منتقل شدند. سوسپانسیون در یک تکان دهنده چرخشی در ساعت 110 شب و در دمای 27 درجه سانتیگراد در یک اتاق آب و هوای تاریک هم زده شد. سلول های تیره رشد کرده هر هفته از فلاسک های کوچک به مقیاس بزرگ بزرگ می شوند تا زمانی که کشت سوسپانسیون مایع حدود 177 گرم در لیتر برسد. تهیه عصاره آبی اتانولی کشت سلولی یاس (JasHEx) با افزودن 2000 میلی لیتر محلول اتانول/آب (10/90، V/V) به 500 گرم سلول انجام شد. مخلوط به مدت 3 دقیقه در 1500 دور در دقیقه و 6 دقیقه در 3800 دور در دقیقه با استفاده از آسیاب چاقویی Grindomix GM300 (Retsch GmbH, Haan, Germany) همگن شد. سوسپانسیون به دست آمده با دور 400 به مدت 2 ساعت در دمای 25 درجه سانتیگراد و اجتناب از قرار گرفتن در معرض نور به هم زده شد. سپس سوسپانسیون در 6300 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه در دمای 4◦C سانتریفیوژ شد. مایع رویی خارج شد، فیلتر شد و سپس تحت خلاء در اواپراتور چرخشی (IKA RV8، IKA-Werke GmbH & Co.، Staufen، آلمان) که روی 25 درجه سانتیگراد تنظیم شده است، غلیظ شد. در نهایت، pH با 10 نیتروژن NaOH به 7.0 رسید و سپس خشک شد تا پودر ریز به دست آید.

2.2. تجزیه و تحلیل UPLC-MS/MS برای خصوصیات شیمیایی JasHEx

استخراج دوفازی بوتانول / آب به دست آمد. بخش بوتانول قبل از انجام آنالیز UPLC-MS/MS بر روی یک طیف سنج جرمی کلاسیک Q-Exactive مجهز به سیستم Ultimate™ 3000 UPLC (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) در متانول (10 میلی گرم در میلی لیتر) خشک و ذوب شد. ). تمام مراحل کروماتوگرافی همانطور که قبلاً توسط Ceccacci و همکاران توضیح داده شد انجام شد. [17].

2.3. تجزیه و تحلیل شبکه های مولکولی اجتماعی محصولات طبیعی جهانی

برای شناسایی متابولیت، شبکه اجتماعی مولکولی محصولات طبیعی جهانی استفاده شد [18]. همه آن سیگنال‌های MS و MSMS که توسط GNPS تخصیص نیافته‌اند، عاقلانه مورد بررسی قرار گرفتند و بر اساس ادبیات تخصیص داده شدند. فایل های خام قبل از جستجوی کتابخانه طیفی GNPS توسط نرم افزار MS Converter General User Interface به فرمت mzXML تبدیل شدند. با استفاده از تحمل جرم یون پیش‌ساز 0 انجام شد.025 دا، تحمل جرم یون قطعه 02/0 دا، حداقل پیک‌های همسان 2، و آستانه امتیاز 7/0. نتایج به صورت دستی تایید شد.

پیش پردازش داده ها توسط Mzmine (نسخه 2.53، Softpedia، بخارست، رومانی) [19] و یک کار شبکه مولکولی مبتنی بر ویژگی (FBMN) [20] همانطور که توسط Ceccacci و همکاران گزارش شده است، انجام شد. [17]. فایل های شبکه به دست آمده به Cytoscape (نسخه 3.9.1، موسسه ملی علوم پزشکی عمومی ایالات متحده (NIGMS)، Bethesda، MD، ایالات متحده آمریکا) وارد شدند [21].

2.4. تجزیه و تحلیل کمی لیگنان ها و تری ترپن ها

همان تنظیمات UPLC بیان شده برای آزمایش های کیفی برای تجزیه و تحلیل کمی لیگنان ها به کار گرفته شد، در حالی که برای تری ترپن ها، آنها برای جدا کردن دو جفت ایزومر، اسید آرجونولیک/آسیاتیک و اسید اولئانولیک/اورسولیک بهبود یافتند. آنالیز بر روی یک طیف سنج جرمی کلاسیک Q-Exactive همانطور که قبلاً تعریف شد انجام شد. جداسازی توسط Phenomenex Kinetex (تورنس، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) EVO C{1}} Å (15{12}} × 2.1 میلی‌متر، اندازه ذرات 5 میکرومتر) انجام شد. فاز متحرک شامل A (محلول آبی 5 میلی مولار استات آمونیوم، pH 9.{8}} تنظیم شده توسط هیدروکسید آمونیوم) و B (1{{40}}}}0 درصد استونیتریل) با استفاده از شستشوی گرادیان 13-28 درصد B در 0-20 دقیقه، 28-65 درصد B در 20-24 دقیقه، 65-75 درصد B در 24-28 دقیقه، 75-95 درصد در 28-28.5 دقیقه، 95 درصد در 28.5 دقیقه -32 دقیقه، 95-13 درصد در 32-32.1 دقیقه و 13 درصد در 32.1-44 دقیقه. سرعت جریان 0.450 میلی لیتر در دقیقه و حجم تزریق 5 میکرولیتر بود. برای لیگنان ها و تری ترپن ها، داده ها با روش توده ای توصیف شده توسط Ceccacci و همکاران به دست آمد. [17]. ما نورتاکلوژنین (#LCA52174) را از Biosynth Carbosynth، matairesinol (#80497) و ماسلینیک اسید (#83209) از PhytoLab GmbH & Co.KG، secoisolariciresinol (#60372) و اسید arjunolic (#S9-SMB0) را از شرکت PhytoLab خریداری کردیم. ، MI، ایالات متحده آمریکا)، اسید آسیایی (#0027)، اسید اولئانولیک (#0041 S) و اسید اورسولیک (#0037 S) از Extrasynthèse (Genay، فرانسه). منحنی های کالیبراسیون با تزریق استانداردها در غلظت 0.05 تا 25 میکرومولار برای لیگنان ها و 0.1 تا 25/250 میکرومولار برای تری ترپن ها به دست آمد. حد تشخیص (LOD) و حد کمیت (LOQ) برای استانداردها بر اساس نسبت سیگنال به نویز (S/N) تعیین شد.

2.5. کشت و ریزنمونه سلولی پوست

کراتینوسیت های انسانی جاودانه شده (HaCaT)، خریداری شده از Addexbio Technologies (سان دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده)، در محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM؛ Sigma Aldrich، سنت لوئیس، MO، ایالات متحده) که با 10 درصد سرم جنین گاوی تکمیل شده بود، نگهداری شد. (FBS؛ Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) در 95 درصد هوا، 5 درصد CO2 و اتمسفر مرطوب در دمای 37 درجه سانتیگراد. فیبروبلاست های پوستی انسان (HDF) در محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM؛ Sigma-Aldrich، سنت لوئیس، MO، ایالات متحده) همراه با 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS؛ Sigma-Aldrich، St. Louis، MO، ایالات متحده آمریکا) حفظ شدند ) در 95 درصد هوا، 5 درصد CO2 و اتمسفر مرطوب در دمای 37 درجه سانتیگراد. ریزنمونه‌های پوستی که از پوست اهداکنندگان زن سالم (31 و 40 ساله) در مرکز جراحی ویلا سینزیا (ناپل، ایتالیا) به‌دست آمد، در 24-صفحه‌های transwell در DMEM/FBS به‌علاوه آنتی‌بیوتیک‌ها در شرایط هوا-مایع کشت داده شدند. در دمای 37 درجه سانتیگراد در هوای مرطوب شده 5 درصد CO2. طبق اعلامیه هلسینکی، همه اهداکنندگان رضایت آگاهانه کتبی خود را برای استفاده از بافت های پوستی داده بودند.

2.6. سنجش ROS سیتوزولی در سلول‌های H2O{3}}HaCaT استرس‌دار

برای این فرآیند، 1.8 × 104 HaCaT در 96-صفحات چاهی کاشته شد و به مدت 20 ساعت رشد کرد. سپس سلول‌ها به مدت 2 ساعت با غلظت‌های مختلف JasHEx ({10}}.0006 درصد، 0.002 درصد و 0.006 درصد p/v) یا با اسید اسکوربیک 500 میکرومولار به‌عنوان کنترل مثبت تیمار شدند. پس از آن، آنها در PBS (سالین بافر فسفات) شسته شده و در دمای 37 درجه سانتیگراد با 100 میکرولیتر در چاه محلول حاوی: 10 میلی‌مولار هپس، 1.3 میلی‌مولار CaCl2، 1 میلی‌مولار MgSO4، 5 میلی‌مولار گلوکز و 5 انکوبه شدند. μM CM-H2DCFDA (5-(و{27}})-کلرومتیل-20،{30}}دی کلرودی هیدروفلورسین دی استات، اینویتروژن). پس از 45 دقیقه، شستشوی PBS انجام شد و شدت فلورسانس پایه سلول ها در طول موج 535 نانومتر (تحریک 485 نانومتر)، با استفاده از ابزار EnVision (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) اندازه گیری شد. سپس با افزودن 450 میکرومولار H2O2، استرس اکسیداتیو القا شد و فلورسانس نمونه‌ها پس از 30 دقیقه اندازه‌گیری شد.

2.7. سنجش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم (ELISA) برای تشخیص سن در سلول‌های فیبروبلاست پوستی انسانی (HDF) تحت استرس گلیوکسال

برای این مرحله، 1.5×104 HDF در 96-صفحه‌های چاهی کاشته شد و به مدت 2 روز رشد کرد. پس از شستشو با PBS، سلول ها به مدت 1{{1{0}} دقیقه با 100 میکرولیتر فرمالدئید 4 درصد در PBS تثبیت شدند. سپس با JasHEx (0006/0 درصد و 002/0 درصد p/v) یا کنترل مثبت 1 میکرومولار آمینوگوانیدین در حضور 5/0 درصد گلیوکسال در دمای 50 درجه سانتیگراد به مدت 1 هفته تحت درمان قرار گرفتند. پس از انکوباسیون، آنها برای یک سنجش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم (ELISA) با استفاده از یک آنتی بادی خاص علیه AGE (Abcam ab23722) پردازش شدند.

2.8. سنجش ایمونوهیستو فلورسانس بر روی ریزنمونه های پوستی تحت فشار متیل گلیوکسال برای تشخیص فیبریلین{3}}

ریزنمونه های پوستی از دو بیمار 31 و 4{2}} ساله گرفته شد. از هر بیوپسی پوست، سه پانچ برای هر درمان که در فصل مشترک هوا-مایع اتفاق می‌افتد، ایجاد شد. در روز اول، پانچ ها با JasHEx (0.{22}}02 درصد و 0.006 درصد p/v) یا کنترل مثبت (1 میلی مولار آمینوگوانیدین) و پس از 24 ساعت، 500 میکرومولار متیل درمان شدند. گلیوکسال اضافه شد. تیمارها هر دو روز یکبار و در مجموع هفت روز تجدید شدند. در پایان دوره، پانچ ها برای تجزیه و تحلیل بافت شناسی پردازش شدند، در 4 درصد PFA تثبیت شدند، در 15 درصد ساکارز و سپس در 30 درصد ساکارز انکوبه شدند و در ترکیب OCT (دمای بهینه برش) در دمای 80- درجه سانتیگراد ذخیره شدند. . برودت 5 میکرومتر با کرایوستات CM1520 Leica (Leica Biosystems، Buffalo، IL، USA) به دست آمد. اسلایدهای دارای برودت به مدت 30 دقیقه در PBS هیدراته شدند و به مدت 1 ساعت در محلول مسدود کننده (6 درصد BSA، 5 درصد سرم، 20 میلی مولار MgCl2، 0.2 درصد توئین) قرار گرفتند. سپس با آنتی بادی اولیه ضد فیبریلین 1 (MA{27}}، Thermo Scientific، Waltham، MA، USA) انکوبه شدند. به مدت 16 ساعت در 4 ◦C. اسلایدها با PBS به مدت 30 دقیقه شسته شدند و سپس با آنتی بادی ثانویه ضد خرگوش Alexa-Fluor 546 (A11035, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) به مدت 1 ساعت انکوبه شدند. هسته ها با DAPI (40، 6-5 دی آمیدینو{38}}فنیلندول) 1 گرم در میلی لیتر در PBS به مدت 10 دقیقه رنگ آمیزی شدند. تصاویر با میکروسکوپ فلورسانس به دست آمد و با نرم افزار ImageJ (نسخه 1.53a، مؤسسه ملی بهداشت، ایالات متحده آمریکا) تجزیه و تحلیل شد.

2.9. سنجش آلفاالیزا برای اندازه‌گیری محتوای پروکلاژن نوع یک پپتید C (PIP)

در این مرحله، 8 × 103 HDF در یک 96-صفحه چاهی کاشته شد و به مدت 24 ساعت با JasHEx (0).0006 درصد، 0.002 درصد، و 0.006 درصد p/v) یا با TGF- (2.5 نانوگرم در میلی لیتر). پس از درمان، سلول ها طبق دستورالعمل های ارائه دهنده کیت کلاژن آلفا LISA hPIP (AL353HV، (PerkinElmer، Waltham، MA، USA)) پردازش شدند.

2.10. سنجش فعال‌سازی رونویسی مبتنی بر لوسیفراز Nrf2

در اینجا، 6 × 103 سلول HaCaT در یک صفحه 96- چاه کاشته شدند و به مدت 16 ساعت رشد کردند. پس از آن، آنها با استفاده از کیت گزارشگر ARE BPS Bioscience (سان دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده، #6{15}}514) تحت یک سنجش فعال‌سازی رونویسی مبتنی بر Nrf2 لوسیفراز قرار گرفتند. یک وکتور گزارشگر لوسیفراز ARE آماده ترانسفکشن (حاوی ژن لوسیفراز کرم شب تاب تحت کنترل عناصر پاسخگو ARE که در بالادست یک پروموتر حداقلی قرار دارد) همراه با یک کنترل داخلی (یک ناقل رنیل لوسیفراز با بیان ساختاری) به طور موقت با استفاده از سلول های HaCaT به سلول های HaCaT انتقال داده شدند. معرف ترانسفکشن DNA HP ژن X-TREME (Roche, Basilea, Switzerland, #6366244{17}}01). پس از انتقال به مدت 24 ساعت، سلول ها به مدت 2 ساعت با عصاره (0.0006 درصد، 0.002 درصد و 0.006 درصد p/v) یا رزوراترول کنترل مثبت (50 میکرومولار) تیمار شدند. پس از آن، آنها تحت آزمایش لوسیفراز با سیستم سنجش لوسیفراز Dual-Glo (Promega، رم، ایتالیا #E2920) قرار گرفتند. به طور خلاصه، سلول‌ها با سوبسترای لوسیفراز کرم شب‌تاب به مدت 10 دقیقه قبل از اندازه‌گیری لومینسانس در یک صفحه‌خوان چاهک 96- انکوبه شدند (Victor Nivo, Waltham, MA, USA). نسبت لومینسانس از کرم شب تاب و Renilla برای عادی سازی و مقایسه فعالیت رونویسی Nrf2 محاسبه شد.

2.11. تجزیه و تحلیل بیان ژن‌های SOD-1(NM_000454.5) و OH-1(NM{_002133.3) در سلول‌های HaCaT

برای این فرآیند، 1.5 × 105 سلول HaCaT در هر چاهک به مدت 16 ساعت در صفحات چاهک رشد داده شد و به مدت 6 ساعت با عصاره ({8}}.002 درصد و 0.006 درصد) انکوبه شد. p/v) یا 50 میکرومولار رسوراترول به عنوان کنترل مثبت. در پایان انکوباسیون، RNA کل با استفاده از کیت "GenElute™ Total RNA Purification" (از Sigma-Aldrich (سنت لوئیس، MI، ایالات متحده آمریکا) استخراج شد و با DNase I (Thermo Scientific، Waltham، MA، USA) در 37 تیمار شد. ◦C به مدت 30 دقیقه، برای حذف آلاینده DNA ژنومی، 500 نانوگرم از RNA کل با استفاده از آنزیم Reverse transcriptase رونویسی شد (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). RT-PCR های نیمه کمی با استفاده از جفت یونیورسال انجام شد. پرایمرهای 18S پرایمر/رقیب (Invitrogen- Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) به عنوان استانداردهای داخلی محصولات PCR روی ژل آگارز 1.5 درصد جدا شدند و با استفاده از ابزار iBright (Invitrogen Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) مشاهده شدند. توالی پرایمرهای مورد استفاده برای تکثیر به شرح زیر بود: HsSOD1Fw: GAAAGTAATGGACCAGTGAAGG؛ HsSOD1Rv: ATTGGGCGATCCCAATTACACC؛ OH{24}}Fw GAACTTCAGAAGGGTCAGG؛ OH{GACTGCAGAGATGATT.

2.12. سنجش اکسید نیتریک در RAW 264.7 تحریک شده با LPS

غلظت NO در ماکروفاژهای موش RAW 264.7 تعیین شد، در غلظت 1.5 × 1{8}}5 سلول در چاهک به مدت 24 ساعت کشت شد و با عصاره پیش تیمار شد ({{11} 0}}.0006 درصد، 0.002 درصد و 0.006 درصد p/v) یا با 10 میکرومولار TPCK (کنترل مثبت) به مدت 2 ساعت، قبل از انکوباسیون با 2 میکروگرم در میلی لیتر LPS به مدت 18 ساعت. مقدار NO تبدیل به نیتریت با افزودن معرف گریس (محلول N-({19}}نفتیل)اتیلن دی آمین و اسید سولفانیلیک، Invitrogen- Thermo Scientific، Waltham، MA، USA) محاسبه شد و پس از 30 دقیقه، جذب در 540 نانومتر توسط دستگاه خوان چند چاهی اندازه گیری شد (EnVision، PerkinElmer، Waltham، MA، USA)

3. نتایج

3.1. تجزیه و تحلیل کمی و کیفی عصاره هیدروالکلی کشت سلولی یاس سمباک (JasHEx)

تجزیه و تحلیل UPLC-MS/MS JasHEx انجام شد و داده‌های طیف‌سنجی با وضوح بالا با استفاده از شبکه‌های مولکولی اجتماعی محصولات طبیعی جهانی (GNPS)، یک سیستم طیف‌سنجی جرمی مبتنی بر وب که به حاشیه‌نویسی محصولات طبیعی (NPs) کمک می‌کند، تجزیه و تحلیل شدند [18] . به طور خاص، یک کتابخانه طیفی GNPS برای دستیابی به replication آنلاین انجام شد. گونه‌های شیمیایی که توسط GNPS شناسایی نشده‌اند، بر اساس ادبیات تخصیص داده شدند. همانطور که در شکل های 1 و 2 و جدول 1 نشان داده شده است، بیش از 50 ترکیب متعلق به چندین کلاس از متابولیت های ثانویه، عمدتاً پلی فنل ها و ترپن ها، شناسایی شدند. در واقع، عصاره JasHEx حاوی مشتقات اسید فنولیک، لیگنان ها (secoisolariciresinol، nortrachelogenin، و matairesinol) و تری ترپنوئیدها (آرجونولیک اسید، اسید آسپارتیک، اسید ماسلینیک، اسید اولئانولیک و اسید اورسولیک) است.

【برای اطلاعات بیشتر:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】