KLRG1 زیرمجموعه های سلولی CD4 T نفوذگر تومور مرتبط با پیشرفت تومور و پاسخ ایمونوتراپی را نشان می دهد

خلاصه

روش‌های کنونی برای کشف نشانگر زیستی و شناسایی هدف در ایمونوآنکولوژی به عکس‌های فوری ثابت از ایمنی تومور متکی است. برای توصیف کامل ماهیت زمانی پاسخ‌های ایمنی ضد تومور، ما یک پانل فلوسیتومتری طیفی پارامتری 34- ایجاد کردیم و آنالیزهای با توان بالا را در زمینه‌های بحرانی انجام دادیم.

ما دو مدل بالینی مجزا را به کار بردیم که به ترتیب ویرایش ایمنی سرطان (NPKC1) و پاسخ محاصره ایمن بازرسی (ICB) (MC38) را خلاصه می‌کنند و بافت‌های مرتبط متعدد را در نقاط عطف کلیدی نظارت ایمنی و فرار و/یا پاسخ ICB نمایه کردیم.

اهداف به مولکول های زیستی مهم در سلول ها مانند پروتئین ها، آنزیم ها و گیرنده ها اشاره دارد. شناسایی هدف استفاده از روش‌های شیمیایی و بیولوژیکی برای شناسایی خواص و عملکردهای خاص این مولکول‌های زیستی برای کاربرد در درمان بیماری و توسعه دارو است.

ایمنی به توانایی بدن برای مقاومت در برابر تهاجم پاتوژن های خارجی و رشد سلول های غیر طبیعی درون زا اشاره دارد. هسته سیستم ایمنی سلول‌ها و مولکول‌های ایمنی هستند که ارتباطات و تعامل نزدیکی با اهداف خود دارند.

در درمان بیماری و توسعه دارو، ارتباط بین شناسایی هدف و ایمنی بسیار مهم است. به عنوان مثال، مکانیسم اثر بسیاری از داروها از طریق شناسایی هدف، هدف قرار دادن پروتئین‌ها، آنزیم‌ها، گیرنده‌ها و سایر مولکول‌های خاص، تأثیرگذاری بر عملکرد آنها و تنظیم انتقال سیگنال برای دستیابی به اثرات درمانی است. سلول ها و مولکول های موجود در سیستم ایمنی نیز می توانند هدف داروها باشند. به عنوان مثال، داروهای ضد سرطان با تأثیر بر پاسخ ایمنی سلول‌های سرطانی و تنظیم آپوپتوز و تکثیر سلولی، به اثرات درمانی می‌رسند.

بنابراین، در توسعه دارو و درمان بالینی، در نظر گرفتن همه‌جانبه عوامل شناسایی هدف و ایمنی می‌تواند منجر به توسعه مؤثرتر دارو و بهبود اثر درمانی شود. از این منظر، ما نیاز به بهبود ایمنی داریم. سیستانچ می تواند ایمنی را تقویت کند. سیستانچ سرشار از انواع مواد آنتی اکسیدانی مانند ویتامین C، ویتامین C، کاروتنوئیدها و غیره است. این مواد می توانند رادیکال های آزاد را از بین ببرند، استرس اکسیداتیو را کاهش دهند و ایمنی را بهبود بخشند. مقاومت سیستم

روی پودر عصاره cistanche tubulosa کلیک کنید

تجزیه و تحلیل داده‌های مبتنی بر یادگیری ماشین، الگویی از بیان KLRG1 را نشان داد که به‌طور منحصربه‌فرد جمعیت‌های سلول‌های CD4 T مؤثر درون توموری را شناسایی می‌کند که اساساً با بار تومور در مدل‌های تومور مرتبط هستند، و در تومورهایی که در پاسخ به ICB دچار رگرسیون می‌شوند گم می‌شوند. به طور مشابه، یک زیرمجموعه Helios-KLRG1 به اضافه سلول‌های T تنظیم‌کننده نفوذکننده تومور (Tregs) با پیشرفت تومور از تعادل ایمنی تا فرار مرتبط بود و همچنین در تومورهایی که به ICB پاسخ می‌دهند گم شدند.

مطالعات اعتبار سنجی، امضای KLRG1 را در سلول‌های CD4 T نفوذگر تومور انسانی مرتبط با پیشرفت بیماری در سرطان کلیه تایید کرد. این یافته‌ها جمعیت سلول‌های T KLRG1 و CD4 را به عنوان زیرمجموعه‌هایی برای بررسی بیشتر در ایمنی سرطان معرفی می‌کنند و کاربرد پروفایل جریان طیفی طولی را به عنوان موتور نشانگر زیستی پویا و/یا کشف هدف نشان می‌دهند.

معرفی

امروزه ایمونوتراپی ستون اصلی درمان سرطان است. با این حال، پاسخ به اکثر عوامل ایمنی درمانی نادر است، محدود به تعداد محدودی از انواع تومور است، و پیش بینی آن دشوار است (1). بهبود نرخ پاسخ و توسعه نشانگرهای زیستی پیش بینی کننده پاسخ، اهداف اصلی حوزه ایمونولوژی تومور است، اما این همچنان چالش برانگیز است.

تعداد زیادی از فعل و انفعالات پیچیده چند سلولی ممکن است بر نتیجه یک پاسخ ایمنی ضد توموری در هر بیمار خاص حاکم باشد. بنابراین، رایج است که نشانگرهای زیستی منفرد - یا مدولاسیون درمانی مسیرهای منفرد - در برخی از بیماران سرطانی، اما نه در بیشتر بیماران سرطانی، کاربرد دارند.

به عنوان مثال، سه نشانگر زیستی مرتبط با ایمنی در حال حاضر در استفاده گسترده بالینی وجود دارد. (i) بار جهش تومور (TMB)، همانطور که به طور مستقیم یا استنباط از طریق حضور جهش های غیرفعال در ماشین آلات ترمیم DNA (2-4)، (ب) بیان PD-L1 توسط ایمونوهیستوشیمی (IHC) (5) اندازه گیری می شود، و (iii) ایمنی از قبل موجود که با حضور سلول های CD8 T در داخل و اطراف تومورها اندازه گیری می شود که Immunoscore نامیده می شود (6).

در حالی که هر یک به طور قابل توجهی با پاسخ به ایمونوتراپی در زمینه های خاص مرتبط است، حساسیت و ویژگی این پیش بینی کننده ها کمتر از حد مطلوب باقی می ماند (7). این رویکردهای تک وجهی احتمالاً نمی توانند به طور کامل مکانیسم های پیچیده ای را که در زمینه ایمنی ضد تومور وجود دارد، از جمله ماهیت پویای چنین پاسخ هایی که در بافت ها و در طول زمان رخ می دهد، به دست آورند.

به این ترتیب، استفاده از رویکردهای پروفیل ایمنی تک سلولی بسیار چندگانه برای تشخیص نشانگرهای زیستی و کشف هدف به روشی طولی و متقاطع ممکن است فنوتیپ‌های ایمنی متفاوتی را با کاربرد پیش‌بینی و ترجمه بیشتر ارائه دهد.

برای این منظور، یک 34-پانل فلوسیتومتری طیفی پارامتر و خط لوله تجزیه و تحلیل داده‌های ابعادی بالا برای بررسی فنوتیپ‌های ایمنی سطح پروتئین مرتبط با مراحل مختلف چرخه ویرایش ایمنی سرطان، از جمله فرار ایمنی و رشد تومور، و نقطه بازرسی ایمنی ایجاد کردیم. پاسخ محاصره (ICB) در مدل های بالینی

ما مدل‌های NPK-C1 و MC38 تحت درمان با ICB را نمایه کردیم و بافت‌های متعدد (تومور، تخلیه در مقابل غدد لنفاوی غیر تخلیه‌کننده و خون) را در اطراف و اطراف نقاط عطف کلیدی در پیشرفت تومور تجزیه و تحلیل کردیم. این امر توصیف عمیق دینامیک زمینه‌ای رگرسیون تومور طبیعی و ناشی از ICB، انتقال به تعادل ایمنی، و انتقال متعاقب آن از تعادل به فرار کنترل‌نشده تومور را تسهیل کرد. مطالعات اعتبارسنجی در مجموعه داده‌های تک سلولی سرطان کلیه ارتباط ترجمه‌ای این یافته‌ها را تایید کرد.

مواد و روش ها

موش. موش های نر و ماده C57BL/6J (5-6 هفتگی) از آزمایشگاه جکسون (بار هاربر، ME) خریداری شدند. موش ها در زمان استفاده 6-8 هفته سن داشتند. همه حیوانات مطابق با مقررات NIH و انجمن آمریکایی مراقبت از حیوانات آزمایشگاهی نگهداری شدند. تمام آزمایش‌ها و روش‌های این مطالعه توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات سازمانی مرکز پزشکی دانشگاه کلمبیا (IACUC) تأیید شد.

خطوط سلولی رده سلولی NPK-C1 (در اصل LM7304) توسط دکتر کوری آبات شن در دانشگاه کلمبیا ارائه شد. برای جزئیات بیشتر به منابع قبلی مراجعه کنید (8،9). سلول‌های NPK-C1 در R10، متشکل از محیط RPMI (Corning؛ Corning، NY) همراه با 10 درصد FBS (HyClone؛ Logan، UT)، 100 واحد بر میلی‌لیتر پنی‌سیلین، و 100 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر استرپتومایسین (گیبکو؛ گیترزبورگ،) نگهداری شدند. MD). سلول های سرطان کولون MC38 از Kerafast خریداری شد و در D10 متشکل از DMEM (Corning؛ Corning، NY) همراه با 10 درصد FBS، 100 واحد بر میلی لیتر پنی سیلین و 100 میلی گرم در میلی لیتر استرپتومایسین کشت داده شدند (Gibco؛ Gaithersburg، MD).

چالش تومور و تزریقات درمانی. سلول‌های NPK-C1 در 70-90 درصد تلاقی یا سلول‌های MC38 در 50-75 درصد تلاقی با 0 برداشت شدند.{10}}5 درصد تریپسین (Gibco، Gaithersburg، MD)، شسته شده با PBS، شمارش، و در 10x106 سلول در میلی لیتر در PBS سرد یخ معلق شد. در روز 0، موش‌های 6-8 هفته‌ای با سلول‌های 106×1 NPK-C1 یا MC38 در سمت راست کاشته شدند. اندازه‌گیری‌های تومور در ابعاد X، Y و Z (به ترتیب بزرگ‌ترین قطر، کوچک‌ترین قطر و بزرگ‌ترین ارتفاع) هر 2-3 روز با کولیس دیجیتال ثبت شد و حجم تومور با ضرب X*Y*Z محاسبه شد. آنتی بادی ضد PD{19}} (RMP1- 14 IgG2a,κ) یا آنتی بادی ایزوتیپ IgG2a موش صحرایی (Bio X Cell; Lebanon, NH) در PBS استریل رقیق شد و با تزریق داخل صفاقی (IP) در 200 میکروگرم/ میلی لیتر در هر موش در روزهای 3، 6، 9 و 12 پس از کاشت MC38.

برداشت بافت. پس از اتانازی موش، ~200 ul خون از طریق سوراخ قلبی با استفاده از سوزن سرنگ پوشش داده شده با هپارین 0.2 درصد (StemCell Technologies; Vancouver، BC) جدا شد و روی یخ در لوله های حاوی 10 ul 0.5M قرار داده شد. EDTA (کورنینگ؛ کورنینگ، نیویورک). غدد لنفاوی اینگوینال تخلیه کننده و غیر تخلیه کننده تشریح شده و در 48-صفحه چاهی حاوی 150 ul R10 روی یخ قرار داده شدند.

تومورها برداشت، توده شدند و تا 50 میلی گرم تومور برش داده شد و در محیط X-Vivo 15 (Lonza؛ بازل، سوئیس) در لوله های اپندورف 5 میلی لیتری روی یخ قرار داده شد. DNase (40 میکرولیتر از محلول 20 میلی گرم در میلی لیتر؛ روشه؛ بازل، سوئیس) و کلاژناز D (125 میکرولیتر از محلول 40 میلی گرم در میلی لیتر؛ روشه؛ بازل، سوئیس) قبل از انکوباسیون روی شیکر در دمای 37 درجه سانتیگراد به نمونه های تومور اضافه شدند. 30 دقیقه. واکنش های هضم با گرداب (30 ثانیه) و افزودن 5 میلی لیتر محیط کشت R10 خاموش شد. هضم های تومور از طریق فیلترهای 70 میکرومتری (Miltenyi؛ Bergisch Gladbach، GE) فیلتر و پلت شدند. نمونه‌های خون با دو انکوباسیون دقیقه‌ای متوالی در ۲ میلی‌لیتر ACK (کیفیت بیولوژیکی؛ Gaithersburg، MD) لیز شدند و قبل از گلوله‌سازی در R10 خاموش شدند. غدد لنفاوی به طور فیزیکی با یک پیستون سرنگ 1 میلی لیتری در 48-صفحه چاه جدا شدند، سپس سوسپانسیون ها از طریق فیلترهای 40- um فیلتر شدند. همه نمونه‌ها برای رنگ‌آمیزی در صفحات U-bottom 96- قرار گرفتند.

فلوسیتومتری. نمونه ها با PBS شسته شدند. سلول‌های مرده با سوسپانسیون مجدد در 100 میکرولیتر PBS به‌علاوه رنگ آبی ثابت/مرده (1:500؛ Invitrogen؛ Waltham, MA) رنگ‌آمیزی شدند. این و تمام مراحل رنگ‌آمیزی یا تثبیت بعدی به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق روی یک تکان دهنده صفحه، محافظت شده از نور انجام شد. نمونه ها 2 بار با PBS شسته شدند، سپس در FACS (PBS به اضافه 3 درصد FBS به اضافه 1 میلی مولار EDTA به اضافه 10 میلی مولار HEPES) همراه با TruStain FcX (1:50؛ BioLegend؛ سن دیگو، کالیفرنیا) و TruStain Monocyte Blocker (1:20). BioLegend؛ سن دیگو، کالیفرنیا) و روی یخ قرار داده شد.

آنتی‌بادی‌های سطحی در رقت‌های بهینه (به جدول تکمیلی S1 مراجعه کنید) در FACS تکمیل‌شده با بافر Brilliant Stain Plus (BD؛ Franklin Lakes, NJ) آماده شدند، سپس به نمونه‌ها در محلول مسدودکننده اضافه شدند. پس از رنگ‌آمیزی، نمونه‌ها 2 بار با بافر FACS شسته شدند و در 100 میکرولیتر بافر کیت تثبیت/نفوذ FoxP3 (eBioscience؛ San Diego, CA) ثابت شدند. نمونه ها دو بار با بافر نفوذپذیر 1X (1X PW) شسته و سپس در 1X PW به اضافه آنتی بادی های داخل سلولی رنگ آمیزی شدند. نمونه ها سپس دو بار در 1X PW شسته شدند سپس در 100 ul بافر FluoroFix (BioLegend: San Diego, CA) ثابت شدند، دو بار با FACS شسته شدند، سپس مجدداً در 200 ul FACS معلق شدند و در صفحات 96 چاهی مهر و موم شدند تا در روز بعد در روز بعد تهیه شوند. سیتومتر لیزری Cytek Aurora 5-.

نمونه‌های اسپلنوسیت رنگ‌آمیزی همزمان برای کنترل‌های تک رنگ مورد استفاده قرار گرفتند. تجزیه و تحلیل و آمار. آزمایش های پروفایل طولی هر یک یک بار برای مدل های MC38 و NPK-C1 انجام شد. در مجموع n=10-25 موش در هر نقطه زمانی مورد ارزیابی قرار گرفت. داده‌های فلوسیتومتری در FlowJo نسخه 10.8.1 (BD؛ Franklin Lakes، NJ) تجزیه و تحلیل شد و الگوریتم‌های پلاگین با ابعاد بالا UMAP و FlowSOM از FlowJo Exchange دانلود شدند. تا 30 هزار سلول CD45 زنده به علاوه سلول های نفوذ کننده تومور و تا 15 هزار سلول CD45 زنده به علاوه خون یا سلول های مشتق از LN در هر نمونه برای تجزیه و تحلیل ابعادی بالا به هم متصل شدند.

تمام کاهش ابعاد و خوشه بندی در FlowJo انجام شد. تجزیه و تحلیل های آماری در GraphPad Prism v9.3.1 انجام شد. برای تولید ضرایب همبستگی از همبستگی پیرسون و برای مقایسه فراوانی‌های خوشه‌ای بین گروه‌ها از آزمون‌های تی استودنت جفت نشده با تصحیح ولش استفاده شد. روشهای تحلیلی تک سلولی قبلاً شرح داده شده است (10،11).

رگولون KLRG1 از رگولون متاVIPER KLRG1 از Obradovic و همکاران (11) استخراج شد. برای محاسبه امضای رگولون KLRG1، ما یک مدل رگرسیون جنگل تصادفی را با ژن‌های رگولون به‌عنوان ویژگی و KLRG1 به‌عنوان هدف برازش کردیم، سپس امتیازهای اهمیت جینی ژن‌های رگولون را برای تعیین تأثیر آن‌ها بر بیان KLRG1 محاسبه کردیم. امتیاز تنظیم KLRG1 هر سلول با مجموع وزنی معیارهای بیان همه ژن‌های رگولون در سلول با امتیازهای اهمیت به عنوان وزن داده شد.

For more information:1950477648nn@gmail.com