بسیاری از املاح متصل به پروتئین توسط کلیه با کارایی بالا پاک می شوند

کلیه املاح متعدد را از پلاسما پاک می کند. با این حال، حفظ این املاح باعث بیماری اورمیک زمانی که کلیه ها از کار می افتند. ما می دانیم که کدام املاح باقی مانده سمی هستند و توانایی ما را برای بهبود درمان های دیالیز محدود می کند.

برای کشف این موضوع، ما از طیف‌سنجی جرمی بدون هدف برای شناسایی املاح پاک‌سازی شده توسط کلیه استفاده کردیم. طیف سنجی جرمی با وضوح بالا 1808 ویژگی را در ادرار و اولترافیلترات پلاسمایی 5 فرد با عملکرد کلیوی طبیعی شناسایی کرد. نرخ کلیرانس تخمینی 1082 پیک بیشتر از کلیرانس کراتینین بود که نشان دهنده ترشح لوله ای است.

تجزیه و تحلیل بیشتر 90 ویژگی را شناسایی کرد که نشان دهنده املاح با نرخ ترخیص کالا از گمرک تخمینی مهم تر از جریان پلاسمای کلیوی است. طیف سنجی جرمی کمی با رقت ایزوتوپی پایدار تأیید کرد که پاکسازی کارآمد این املاح با ترکیب اتصال به پروتئین های پلاسما و ترشح لوله ای امکان پذیر است. طیف سنجی جرمی پشت سر هم هویت شیمیایی 13 املاح از جمله اسید هیپوریک، ایندوکسیل سولفات و سولفات p-cresol را مشخص کرد. مشخص شد که این 13 املاح پاکسازی شده به طور موثر در پلاسمای بیماران همودیالیزی تجمع می‌یابند، و سطوح آزاد آن به بیش از 20-برابر طبیعی برای همه آنها به جز دو نفر افزایش می‌یابد. بنابراین، تجزیه و تحلیل بیشتر املاح به طور موثر پاکسازی شده توسط ترشح در کلیه بومی ممکن است یک مسیر بالقوه برای شناسایی سموم اورمیک فراهم کند.

برای دانستن cistanche wirkung کلیک کنید

کلید واژه ها

طیف سنجی جرمی، عملکرد کلیوی، سموم

کلیه مواد زائد متعددی را از پلاسمای خون دفع می کند. هنگامی که عملکرد کلیه از بین می رود، این املاح در بدن انباشته می شوند و باعث بیماری اورمیک می شوند که منجر به مرگ می شود، مگر اینکه عملکرد کلیوی تا حدی با دیالیز جایگزین شود.

در حال حاضر، ما به میزان قابل توجهی در مورد مواد سمی آموزش دیده ایم، و این کمبود دانش توانایی ما را برای بهبود درمان محدود می کند. 1،2 پیشرفت تا حدودی کند بوده است زیرا تعداد املاح باقی مانده در هنگام از کار افتادن کلیه ها بسیار زیاد است. 1.، 3.، 4.، 5.، 6. این مطالعه از طیف سنجی جرمی غیر هدفمند برای یافتن املاح به طور موثر از پلاسما توسط کلیه خارج می شود.

این نشان داد که املاح زائد زیادی وجود دارد که نرخ کلیرانس کلیوی آنها معمولاً از جریان پلاسمای کلیوی بیشتر است. چنین اتصالات با شفافیت بالا به پروتئین های پلاسما و ترشح لوله ای فعال نیاز دارند. هنگامی که عملکرد کلیه با همودیالیز جایگزین می شود که املاح را تنها با انتشار پاک می کند، غلظت چنین املاح می تواند به سطوح بالایی افزایش یابد. با توجه به اینکه تکامل برای کلیه ها فراهم کرده است تا مواد سمی را به طور موثر حذف کند، شناسایی املاح با نرخ کلیرانس کلیوی بالا می تواند راهی برای شناسایی سموم اورمیک فراهم کند.

نتایج

اندازه گیری ها در چهار مرد و یک زن با عملکرد کلیوی طبیعی انجام شد که با میانگین کلیرانس کراتینین 22±142 میلی لیتر در دقیقه در هر 1.73 متر مربع منعکس شد. در مجموع 1808 ویژگی در ادرار و اولترافیلترات پلاسما توسط طیف‌سنجی جرمی با وضوح بالا شناسایی شد. نرخ پاکسازی برای این ویژگی ها به عنوان نرخ دفع ادرار تقسیم بر غلظت در اولترافیلترات پلاسما برآورد شد. بنابراین مقادیر پاکسازی به جای غلظت کل املاح، بر حسب غلظت املاح بدون پیوند "آزاد" در پلاسما بیان می شود.

توزیع نرخ کلیرانس تخمینی نسبت به کلیرانس کراتینین در شکل 1 نشان داده شده است. برای 1082 ویژگی، نرخ کلیرانس تخمینی بیشتر از ترخیص کالا از گمرک کراتینین با نرخ کشف نادرست q بود.<0.05. Because the creatinine clearance is slightly higher than the glomerular filtration rate (GFR), these features were considered likely to represent solutes secreted by the renal tubules. There were, in contrast, only 290 features with estimated clearance rates less than the creatinine clearance with a false discovery rate of q<0.05.

شکل 1. خط آبی نشان دهنده توزیع نرخ کلیرانس تخمینی نسبت به کلیرانس کراتینین برای ویژگی های 1808 موجود در اولترافیلترات پلاسما و ادرار افراد عادی است. مثلث های قرمز نشان دهنده 13 ویژگی است که هویت آنها با تجزیه و تحلیل استانداردهای معرف تایید شد.

برای 163 ویژگی، نرخ ترخیص کالا از گمرک تخمین زده شده بیش از هفت برابر کلیرانس کراتینین بود. این نشان داد که ترخیص کالا از گمرک آنها از جریان پلاسمای کلیوی، که تقریباً چهار برابر ترخیص کالا از گمرک کراتینین است، بیشتر است.

از میان این 163 ویژگی، 90 مورد به عنوان نشان دهنده ترکیبات شیمیایی منحصر به فرد پس از حذف موارد تکراری در نظر گرفته شد، و ویژگی هایی به عنوان نشان دهنده دایمرها، ترکیبات افزودنی، ایزوتوپ ها یا مصنوعات در بررسی دستی کروماتوگرام ها در نظر گرفته شد (جدول تکمیلی S2 آنلاین). ترکیبات با مقادیر جرمی منطبق در پایگاه‌های داده استاندارد جستجو شدند، و هویت شیمیایی 13 مورد از این 90 ویژگی با مقایسه زمان‌های ماند کروماتوگرافی و طیف‌سنجی جرمی پشت سر هم (MS/MS) با استانداردهای معرف تعیین شد (جدول 1 و مکمل‌ها). جدول S2 آنلاین). با این حال، برای 40 مورد از 90 ویژگی مورد علاقه، هیچ ترکیب کاندیدایی در میان متابولیت‌های شناخته‌شده انسانی با جرم 3 قسمت در میلیون (ppm) یافت نشد (جدول تکمیلی S2 آنلاین). ممکن است زیرا غلظت "آزاد" این املاح در اولترافیلترات پلاسما کمتر از غلظت کل پلاسما آنها بود که احتمالاً منعکس کننده اتصال به پروتئین های پلاسما است.

اگرچه همه املاح پاکسازی شده به طور موثر به پروتئین متصل بودند، میزان اتصال به طور گسترده ای متفاوت بود، با کسر آزاد از 2 تا 52 درصد از غلظت کل پلاسما. محاسبه بر حسب غلظت کل پلاسما مقادیر کلیرانس بسیار کمتری را برای املاح متصل به دست آورد (جدول تکمیلی S2 آنلاین).

جدول 1. املاح به طور موثر توسط کلیه مادری و تجمع آنها در بیماران همودیالیزی پاکسازی می شوند.

مقادیر میانگین ± sd Clearance/Clearancecre میانگین نسبت کلیرانس املاح به کلیرانس کراتینین است. کسر آزاد سطح اولترافیلترات پلاسما به عنوان درصدی از سطح کل پلاسما است. همودیالیز/نرمال نسبت میانگین غلظت قبل از درمان در بیماران همودیالیزی به میانگین غلظت در افراد عادی است.

a

q را نشان می دهد<0.05 for the elevation of the solute concentration in hemodialysis patients above the level in normal subjects.

b

نشان می‌دهد که کسر آزاد فورویل گلیسین تنها در یک موضوع محاسبه شده است، زیرا پیک‌ها در نمونه‌های پلاسما از افراد دیگر برای تعیین کمیت بسیار کوچک بودند.

اندازه گیری با استفاده از کروماتوگرافی مایع / طیف سنجی جرمی پشت سر هم (LC / MS / MS) با استانداردهای نشاندار ایزوتوپی، یافتن نرخ ترخیص کالا از گمرک بسیار بالا برای املاح محدود هیپورات، ایندوکسیل سولفات، و سولفات p-cresol را تایید کرد. مقادیر پاکسازی این املاح به همراه اوره و کراتینین در جدول 2 خلاصه شده است.

برای مقایسه، مقادیر کلیرانس برای فنیل استیل گلوتامین نیز اندازه‌گیری شد که مطالعات قبلی نشان داده بود که توسط لوله‌های کلیوی ترشح می‌شود اما تا حد زیادی محدود نشده است. ترخیص کالا از گمرک فنیل استیل گلوتامین در مقابل به طور متوسط ​​62±455 میلی لیتر در دقیقه در هر 1.73 متر مربع یا تقریباً سه چهارم سرعت تخمینی جریان پلاسمای کلیوی بود. مقادیر پاکسازی هیپورات، ایندوکسیل سولفات، و سولفات p-cresol بسیار بالاتر بود. مقادیر به‌دست‌آمده با روش کمی با استانداردهای نشان‌دار کمی پایین‌تر از مقادیر تخمین زده‌شده از مناطق اوج ارزیابی‌شده توسط طیف‌سنجی جرمی غیرهدف‌شده بود، اما همچنان بسیار بالاتر از جریان پلاسمای کلیوی تخمین زده‌شده بود. مقادیر پاکسازی برای این املاح که بر حسب غلظت کل پلاسما بیان می شود بسیار کمتر از مقادیر بیان شده بر حسب غلظت آزاد بود و از جریان پلاسمای کلیوی تجاوز نمی کرد.

جدول 2. مقادیر پاکسازی به دست آمده با استفاده از روش LC/MS/MS

مخفف:

LC/MS/MS، کروماتوگرافی مایع/طیف سنجی جرمی پشت سر هم.

مقادیر میانگین ± sd Clearance/Clearancecre میانگین نسبت کلیرانس املاح به کلیرانس کراتینین است. کسر آزاد سطح اولترافیلترات پلاسما به عنوان درصدی از سطح کل پلاسما است. Clearancetotal مقداری است که اگر کلیرانس با استفاده از غلظت کل پلاسما به جای غلظت بدون پلاسما محاسبه شود، بدست می آید.

مطالعات اضافی تجمع املاح را در بیماران مبتلا به نارسایی کلیوی مورد بررسی قرار دادند که به طور موثر توسط کلیه مادری پاک می شوند. همانطور که در جدول 1 خلاصه شده است، سطوح رایگان تمام 13 املاح شیمیایی شناسایی شده با نرخ کلیرانس طبیعی بالا در بیماران همودیالیزی افزایش یافته است. نکته قابل توجه، برای همه به جز دو مورد از این املاح، میانگین غلظت آزاد در نمونه های قبل از درمان بیماران همودیالیزی بیش از 20- برابر نرمال بود و غلظت املاح آزاد بیشتر از غلظت کل املاح افزایش یافت. اکثریت املاح که فقط با مقادیر جرمی دقیق مشخص می‌شوند که دارای کلیرانس کلیوی بومی بالایی هستند نیز در بیماران همودیالیزی تجمع می‌یابند، همانطور که در جدول تکمیلی S2 آنلاین خلاصه شده است.

بحث

مطالعات متابولومیک نشان داده است که ادرار حاوی صدها املاح است که اکثریت آنها هنوز از نظر شیمیایی شناسایی می شوند. به عنوان املاح اورمیک ممکن است در هنگام کاهش عملکرد کلیه به بیماری کمک کنند. با این حال، در حال حاضر، ما دانش کمی در مورد اینکه کدام یک از این املاح از نظر بالینی مهم هستند، داریم.3،13.

این مطالعه برای شناسایی املاحی طراحی شد که میزان کلیرانس کلیوی آنها معمولاً بسیار بالا است. برای هر میزان تولید املاح، پاکسازی بالا باعث پایین نگه داشتن سطح املاح در بدن می شود. بنابراین ما می‌توانیم انتظار داشته باشیم که ترکیبات زاید سمی را در میان آن املاح با نرخ پاکسازی بالا پیدا کنیم. تجزیه و تحلیل نمونه‌های اولترافیلترات ادرار و پلاسما با استفاده از طیف‌سنجی جرمی بدون هدف، حضور 90 ویژگی را نشان داد که احتمالاً مربوط به املاح با نرخ کلیرانس کلیوی بیشتر از جریان پلاسمای کلیوی است.

شایان ذکر است، ترکیباتی با مقادیر جرمی متناظر برای بسیاری از این ویژگی‌ها در فهرست‌های استاندارد متابولیت‌های انسانی یافت نمی‌شوند. ترکیباتی که ما قادر به شناسایی آنها بودیم شامل ایندوکسیل سولفات و سولفات p-cresol بود. این ترکیبات از عملکرد باکتری های روده به دست می آیند و شناخته شده اند که توسط لوله های کلیوی ترشح می شوند. هنگامی که کلیه ها از کار می افتند، آنها در پلاسما تجمع می یابند و اخیراً به عنوان سموم اورمیک مورد توجه قرار گرفته اند.

همه این مواد قبلاً در ادرار انسان یافت شده بود و هیپورات، آدیپیک اسید و سیناموئیل گلیسین نیز در پلاسمای بیماران مبتلا به نارسایی کلیوی تجمع یافته بودند (http://www.hmdb.ca).5., 13. 18. هیپورات و {4}هیدروکسی هیپورات مانند ایندوکسیل سولفات و سولفات p-cresol توسط لوله‌های کلیوی ترشح می‌شوند. برای هیچ یک از این املاح در نظر گرفته نشده است.

همانطور که در اینجا توضیح داده شد، کلیه می‌تواند از طریق ترکیبی از ترشح لوله‌ای و اتصال املاح برگشت‌پذیر به پروتئین‌های پلاسما، به نرخ‌های پاکسازی در جریان پلاسمای کلیوی دست یابد. برای املاح که محدود به پلاسما هستند و به پروتئین متصل نیستند، حداکثر کلیرانس برابر با سرعت جریان پلاسمای کلیوی است. اما برای املاح متصل، ترشح فعال غلظت املاح پلاسمای آزاد را در خونی که از مویرگ های اطراف لوله ای عبور می کند پس از خروج از گلومرول ها کاهش می دهد، به طوری که بخش متصل شده املاح تمایل به جدا شدن از پروتئین های اتصال پیدا می کند و برای ترشح در دسترس می شود.

اگر هوس انتقال ترشحی به مجرای لوله ای کافی باشد، مقدار املاح ترشح شده بیشتر از جریان پلاسمای کلیوی ضربدر غلظت آزاد در پلاسمای ورودی به مویرگ های اطراف لوله است و کلیرانس از سرعت جریان پلاسما بالاتر می رود. اثر خالص این است که غلظت املاح غیر متصل در گردش خون سیستمیک را به سطحی پایین‌تر از سطحی می‌رساند که اگر املاح به طور کامل از پلاسمای عبوری از کلیه‌ها حذف شود اما به پروتئین متصل نباشد، حاصل می‌شود.

از آنجایی که این غلظت آزاد و غیرپیوندی از املاح است که بافت‌های سراسر بدن در معرض آن قرار می‌گیرند، ترکیب اتصال پروتئین و ترشح لوله‌ای می‌تواند یک مزیت تطبیقی ​​در حذف ترکیبات زائد سمی ایجاد کند. در اصل، افزودن اتصال پروتئین برگشت پذیر به ترشح اجازه می دهد تا سطح آزاد یک املاح بدون افزایش جریان خون و اندازه کلیه کاهش یابد.

توانایی کلیه برای کاهش غلظت پلاسمای آزاد املاح متصل به سطوح بسیار پایین توسط مارشال 20 شناسایی شد که اولین تظاهرات صریح ترشح املاح توسط لوله های کلیوی را ارائه کرد. مارشال هیچ املاح طبیعی را اندازه گیری نکرد، اما بر اساس مشاهده عملکرد کلیوی فنل قرمز، یک رنگ متصل به پروتئین، فرضیه پاکسازی بالقوه بالای آنها را مطرح کرد.

با این حال، از آن زمان به بعد، مزیت بالقوه اتصال پروتئین به طور عمده در پزشکی کلیه نادیده گرفته شده است، و مقادیر ترخیص کالا از گمرک برای املاح زائد متصل و غیر متصل بر حسب کل به جای غلظت پلاسمای آزاد مرتبط تر بیان شده است. با این حال، رویه استاندارد در ادبیات فارماکولوژی متفاوت بوده است. در مورد عوامل دارویی مانند سایر ترکیبات، تنها بخش آزاد یک املاح محدود شده از نظر بیولوژیکی فعال است و بنابراین نرخ ترخیص کالا از گمرک برای داروها به طور معمول بر حسب پلاسمای آزاد آنها بیان می شود. غلظت ها محاسبه بر حسب غلظت کل، مقادیر کمتری را به دست می‌دهد و توانایی بدن برای محدود کردن سطح املاح مؤثر و آزاد همانطور که در جدول 2 و جدول تکمیلی S2 به صورت آنلاین نشان داده شده است را دست کم می‌گیرد.

یک سوال واضح برای پزشکی کلیه این است که آیا ترشح می تواند در زمانی که فیلتراسیون گلومرولی کاهش می یابد ادامه یابد؟ امید بر اساس مشاهدات مورفولوژیک اولیه مبنی بر اینکه تعداد قابل توجهی از "توبول های گلومرولی" در بیماران مبتلا به بیماری گلومرولی به کار خود ادامه می دهند، با تجزیه و تحلیل های بعدی تا حد زیادی ناامید کننده بود. مهمتر از آن، مطالعات عملکردی به طور مکرر نشان داده اند که پاکسازی ترشحی با GFR کاهش می یابد. شواهد گسترده‌تر برای پاکسازی پارا آمینو هیپورات است که مدت‌ها به عنوان معیاری برای اندازه‌گیری جریان پلاسمای کلیوی استفاده می‌شد.

به طور متوسط، کلیرانس پارا آمینو هیپورات فقط اندکی کمتر از GFR کاهش می یابد، با تنوع در بین بیماران فردی و بیماری های خاص. {3}}هیدروکسی اندولاستات و بسیاری از داروها از جمله ترکیبات متصل به پروتئین مانند فوروزماید. 26.، 27.، 28. کاهش مشابهی در میانگین کلیرانس ترشحی املاح درون زا ایندوکسیل سولفات و p-cresol سولفات به موازات تخمینی GFR همچنین اخیراً به شکل انتزاعی توصیف شده است. افزایش غلظت پلاسمایی با پیشرفت بیماری مزمن کلیوی، بنابراین برای تشخیص ترکیباتی که با ترشح پاک می شوند از ترکیباتی که عمدتاً با فیلتراسیون پاک می شوند، عمل نمی کند. سؤالات ظریف تر، مانند میزان تأثیر سطوح املاح ترشح شده توسط رقابت برای مولکول های حمل و نقل و مولکول های انتقال بیان تغییر یافته در طول پیشرفت بیماری کلیوی، کمتر مورد مطالعه قرار گرفته اند.

نقطه ضعف طیف سنجی جرمی بدون هدف این است که اندازه گیری دقیقی را ارائه نمی دهد. اثرات ماتریس قدرت سیگنال های یونی از نمونه های جداگانه، به ویژه از نمونه های مایعات مختلف را تغییر می دهد. بنابراین، مقادیر کلیرانس در جدول 1، که بر اساس نواحی پیک نسبی در کروماتوگرام ادرار و اولترافیلترات پلاسما است، باید فقط تقریبی در نظر گرفته شوند. سنجش‌های کمی دقیق‌تر LC/MS/MS برای اندازه‌گیری غلظت املاح انتخابی که برای آن‌ها توانستیم استانداردهای برچسب‌دار نشده و ایزوتوپی را به دست آوریم، توسعه داده شد.

این اندازه‌گیری‌ها تایید کرد که فاصله هیپورات، سولفات p-cresol و indoxyl sulfate بسیار بیشتر از جریان پلاسمای کلیوی تخمین زده شده بود. ترخیص کالا از گمرک آنها را می توان با فنیل استیل گلوتامین، یک ماده حل شده که به طور فعال ترشح می شود، اما تا حد زیادی غیر متصل است، به طوری که کلیرانس آن تنها می تواند به جریان پلاسمای کلیوی نزدیک شود، مقایسه کرد. ایندوکسیل سولفات، سولفات p-cresol، 3-هیدروکسی هیپورات، 1،3،7-تری متیل اوریک اسید، و 1،7-دی متیل اوریک اسید توسط ناقل آنیون آلی استفاده می شود. 1 و/یا 3 در لوله پروگزیمال کلیه، و ساختارهای املاح دیگر که ما آنها را به طور مؤثری پاکسازی کرده ایم تا آنها را به احتمال زیاد با مکانیسم های مشابهی برای انتقال انتخاب کنیم. 30.، 31.، 32.، 33.، 34. با این حال، شناسایی ناقلین که کدام املاح را کنترل می‌کنند، نیازمند مطالعات در سلول‌های کشت‌شده یا حیواناتی است که در آن‌ها فعالیت انتقال‌دهنده به طور ژنتیکی دستکاری شده است.

تایید این که املاح منفرد توسط کلیه پاک می شوند با یافتن سطوح بالا در بیماران مبتلا به نارسایی کلیوی ارائه می شود. در میان ترکیباتی که ما شناسایی کردیم که دارای کلیرانس طبیعی کلیوی بیشتر از جریان پلاسمای کلیوی هستند، قبلاً گزارش شده بود که غلظت کل پلاسمایی هیپورات، p-cresol سولفات، ایندوکسیل سولفات، اسید آدیپیک و سیناموئیل گلیسین در بیماران مبتلا به نارسایی کلیوی افزایش یافته است. .5.، 13., 18. این مطالعه بیشتر نشان می دهد که سطوح آزاد املاح محدود شده که به طور موثر توسط کلیه مادری پاک می شوند، می توانند در بیماران تحت همودیالیز که پاکسازی را با انتشار غیرفعال فراهم می کند، به سطوح بالایی افزایش یابد.

در میان 13 ترکیبی که ما شناسایی کردیم که دارای کلیرانس کلیه بومی بالا هستند، سطوح آزاد برای همه به جز دو مورد در بیماران همودیالیزی بیش از 20- برابر نرمال بود. استثناها، 1،3،7-تری متیل اسید اوریک، و 1،7-دی متیل اوریک اسید متابولیت های کافئین هستند. محدود به یک فنجان چای در روز در یک فرد. علاوه بر تفاوت در تولید، کلیرانس غیرکلیوی و حجم توزیع املاح منفرد می تواند بر میزان افزایش سطح آنها در بیماران دیالیزی تأثیر بگذارد.

چندین محدودیت را باید پذیرفت. اول، لیست ما از ویژگی های مربوط به املاح با نرخ کلیرانس کلیوی بالا بدون شک ناقص است. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که تعداد ویژگی‌های شناسایی‌شده توسط طیف‌سنجی جرمی زمانی که نمونه‌ها با استفاده از روش‌های کروماتوگرافی و یونیزاسیون چندگانه مورد سنجش قرار می‌گیرند، افزایش می‌یابد. 11., 12., 36., 37. از پلاسما، اما سپس یا در کلیه تجزیه می شوند یا قبل از دفع در ادرار تغییر می کنند. در نهایت، ممکن است مقادیر کلیرانس کاذب بالایی را برای موادی که پس از تولید در کلیه از طریق ادرار دفع می‌شوند، محاسبه کرده باشیم.

به طور خلاصه، این مطالعه نشان می‌دهد که ترکیب اتصال پروتئین با ترشح لوله‌ای به کلیه اجازه می‌دهد تا املاح زائد را با سرعت‌هایی بیش از جریان پلاسمای کلیوی پاک کند. و این نشان می‌دهد که چنین نرخ‌های پاکسازی بالایی برای تعداد زیادی از املاح طبیعی به دست می‌آید، که بسیاری از آنها هنوز به‌صورت شیمیایی شناسایی می‌شوند. تجزیه و تحلیل بیشتر از گروهی از املاح که به طور موثر توسط کلیه پاک می شود می تواند مسیری را برای شناسایی این سموم اورمیک ارائه دهد.

مواد و روش ها

نمونه‌های خون در نقطه میانی جمع‌آوری ادرار زمان‌بندی‌شده پس از ناشتا بودن یک شبه در پنج فرد با عملکرد کلیوی طبیعی که ویژگی‌های آنها در جدول تکمیلی S1 آنلاین ذکر شده است، گرفته شد. مطالعات توسط اعلامیه اصول هلسینکی انجام شد. پلاسما با متانول (1:3 جلد: حجم) پروتئین زدایی شد، خشک شد و در 90:10 حجم: حجم آب/استونیتریل تا نصف غلظت اولیه بازسازی شد. اولترافیلترات با استفاده از جداکننده های Nanosep 30K Omega (Pall, Ann Arbor, MI) به دست آمد، خشک شد و در 90:10 آب/استونیتریل تا پنج برابر غلظت اولیه بازسازی شد. ادرار با آب رقیق شد تا غلظت املاح را فراهم کند که در جریان ادرار 100 میلی لیتر در دقیقه یافت می شود، خشک می شود و در 90:10 آب / استونیتریل تا دو برابر غلظت نمونه رقیق شده بازسازی می شود.

جدول تکمیلی 1.

کروماتوگرافی بر روی سیستم ACQUITY UPLC (Waters, Milford, MA) انجام شد. از هر نمونه، 1{8} ul در یک ستون Kinetex XB-C18 150 × 2.1 mm، 1.7 میکرومتر اندازه ذرات بارگذاری شد (Phenomenex, Torrance, CA) در 4{{1{12} }}} درجه . جریان فاز متحرک 0.4 میلی لیتر در دقیقه با استفاده از 0.1 درصد اسید فرمیک در آب (A) و 0.1 درصد اسید فرمیک در استونیتریل (B) با گرادیان از 3 درصد B تا 25 درصد B در طول 9 دقیقه، از 25 درصد B تا 100 درصد بود. B تا 15 دقیقه، باقی مانده در 100 درصد B تا 19 دقیقه و بازگشت به 3 درصد B تا 21 دقیقه. MS روی یک طیف‌سنج جرمی Orbitrap Exactive (Thermo Fisher, San Jose, CA) با داده‌های جمع‌آوری‌شده در محدوده m/z 70 تا 800 در 50،{27}} عرض کامل در نصف حداکثر وضوح با استفاده از یونیزاسیون الکترواسپری (ESI) انجام شد. ) با پروب گرم شده (400 درجه). MS در حالت مثبت با استفاده از محلول کالیبراسیون یون مثبت ESI استاندارد LTQ (چهار قطبی تله خطی) (Pierce، Rockford، IL) در محدوده جرمی 138-1922 m/z کالیبره شد. کالیبراسیون یون منفی به m/z 97 از محدوده جرمی m/z 265-1980 یک محلول استاندارد کالیبراسیون یون منفی ESI LTQ با اسپک کردن آن با سولفات p-cresol و indoxyl sulfate در 3.3 ug/ml افزایش یافت. یون های کالیبراسیون اضافی m/z 96.9601 (قطعه سولفات)، m/z 187.0070 (سولفات p-cresol)، و m/z 212.0023 (ایندوکسیل سولفات) تولید کرد.

اصلاح مخلوط کالیبراسیون برای اجازه دادن دقت کمتر از 1 ppm در محدوده جرمی اکثر املاح دفع شده در ادرار و در نتیجه کاهش تعداد ترکیبات عنصری ممکن در نظر گرفته شده است. برای به حداقل رساندن اثرات رانش ابزار، نمونه‌های هر آزمودنی با هم در سه تکرار اجرا شدند و نمونه‌ها از همه افراد ابتدا در حالت منفی و سپس در حالت مثبت اجرا شدند.

نرم افزار MZmine نسخه 2.2 (موسسه علم و فناوری اوکیناوا، اوکیناوا، ژاپن) برای شناسایی ویژگی های مشخص شده با زمان ماند و m/z از هر اجرای LC/MS و اختصاص دامنه به این ویژگی ها بر اساس ادغام یون استفاده شد. از آنجایی که هدف ما شناسایی املاح پاکسازی شده توسط کلیه بود، تجزیه و تحلیل بیشتر به 754 یون منفی و 1054 ویژگی یون مثبت با میانگین سطح پیک بیش از 4000 در سه تکرار در اولترافیلترات پلاسمایی حداقل سه مورد محدود شد. از پنج نفر و همچنین در ادرار حداقل سه نفر از پنج نفر. نرخ پاکسازی برای این 1808 ویژگی با مقایسه غلظت در ادرار و اولترافیلترات پلاسما با غلظت کراتینین برآورد شد.

برای 1082 ویژگی از 1808، نرخ های کلیرانس تخمینی بیشتر از کلیرانس کراتینین با نرخ کشف کاذب q بود.<0.05. This was considered evidence of tubular secretion. Chromatograms for 163 of the 1082 secreted features with clearance values more than sevenfold the creatinine clearance were examined manually. The cutoff of sevenfold was chosen to be well above the renal plasma flow, which is approximately fourfold the creatinine clearance and to include the feature identified as p-cresol sulfate for which a deuterated standard was available, allowing its high renal clearance to be confirmed by a more quantitative assay (below). Elimination of duplicates when features appeared in both positive and negative mode and of features considered to represent dimers, adducts, isotopes, or artifacts on manual review reduced the total number of features with estimated clearance rates greater than sevenfold the creatinine clearance to 90 as summarized in Supplementary Table S2 online. Compounds with m/z values corresponding to these features were identified using the Human Metabolome and Metlin Databases (http://www.hmdb.ca and http://metlin.scripps.edu/) and chemical standards were obtained as further summarized in Supplementary Table S2 online. 

برای تایید هویت‌های شیمیایی، نمونه‌های ادرار و استانداردهای شیمیایی منتخب با استفاده از همان روش LC همراه با LTQ Orbitrap Velos (Thermo Fisher) برای ویژگی‌هایی که با حالت منفی ظاهر می‌شوند و به یک تله یونی LTQ XL (Thermo Fisher) برای ویژگی‌هایی که با مثبت ظاهر می‌شوند، اجرا شدند. حالت شناسایی شیمیایی با تطبیق زمان ماند، جرم اصلی یون و طیف MS/MS ایجاد شد (جدول تکمیلی S3 آنلاین). در میان 13 ویژگی شیمیایی شناسایی شده، میانگین بزرگی خطای جرم اختصاص داده شده به پیک های استخراج شده توسط MZmine 5.5±0.5 ppm 0}. فهرست شده در جدول تکمیلی S2 به صورت آنلاین.

جدول تکمیلی 3.

پلاسمای پیش درمانی از شش بیمار همودیالیزی و از شش فرد عادی که خصوصیات آنها در جدول تکمیلی S1 آنلاین خلاصه شده است نیز با طیف سنجی جرمی با وضوح بالا همانطور که در بالا توضیح داده شد، تجزیه و تحلیل شد. پلاسما پروتئین زدایی شد، خشک شد و در حجم 90:10: حجم آب/استونیتریل به یک چهارم غلظت اولیه برای بیماران دیالیزی و به غلظت اولیه برای افراد عادی بازسازی شد. اولترافیلترات در 90:10 آب/استونیتریل به غلظت اولیه برای بیماران دیالیزی و ده برابر غلظت اولیه برای افراد عادی بازسازی شد. نواحی پیک پلاسما و اولترافیلترات به‌دست‌آمده با نرم‌افزار MZmine بدون احتساب مقادیر میانگین‌گیری شد.<4000 in duplicate runs of each sample. Peaks corresponding to solutes previously identified as having very high renal clearance values were identified by matching retention time and mass. Peaks corresponding to the 13 chemically identified features were reintegrated manually using Xcalibur Software (Thermo Fisher).

غلظت p-cresol sulfate، indoxyl sulfate، hippurate و phenylacetylglutamine در نمونه‌های معمولی با رقت پایدار ایزوتوپی LC/MC/MS با استفاده از p-cresol-d{3}} سولفات (سنتز شده از p-cresol d8) مورد سنجش قرار گرفت. 39 ایزوتوپ کمبریج)، ایندوکسیل-2، 4،5،6،7-d5-سولفات (Isosciences) و N-benzoyl-d5-گلیسین و N -( فنیل-d5-استیل)-L-گلوتامین (هر دو از ایزوتوپ های C/D/N، پوینت-کلر، کبک، کانادا) به عنوان استانداردهای داخلی. آماده‌سازی یکسان بود با این تفاوت که نمونه‌های خشک شده در آب تا دو برابر غلظت مورد استفاده برای آنالیز بدون هدف بازسازی شدند.

از هر نمونه، 1{7}} ul از یک ستون اندازه ذرات Kinetex C18 150 × 2.1 میلی‌متر، 1.7 میکرومتر و در 30 درجه نگهداری شد. جریان بافر با استفاده از 10 میلی مول در لیتر فرمت آمونیوم در آب (A) و 10 میلی مول در لیتر فرمت آمونیوم در متانول (B) با 0}.35 میلی لیتر در دقیقه تنظیم شد. 5 درصد B برای 1 دقیقه، از 5 درصد B به 30 درصد B تا 6 دقیقه، به سرعت به 90 درصد B تا 8.5 دقیقه، و سپس به 5 درصد B تا 13.5 دقیقه کاهش می یابد. MS بر روی یک طیف‌سنج جرمی چهار قطبی سه‌گانه Agilent 6430 با ESI در حالت منفی (Agilent Technologies، سانتا کلارا، کالیفرنیا) انجام شد. غلظت املاح با استفاده از نرم افزار سازنده (MassHunter Quant، Agilent Technologies) محاسبه شد. انتقال های یونی مورد استفاده برای کمی سازی m/z 187.0 → 107.0 برای p-cresol سولفات، m/z 212.0 → 80.0 برای ایندوکسیل سولفات، m/z 178.1 → 134.2 برای هیپورات، و m/z 263.2 → ترانسیون → 145.1minacet برای p-hlutahensyl بود. استانداردهای داخلی تضعیف شده بازیابی برای سولفات p-cresol، ایندوکسیل سولفات، هیپورات و فنیل استیل گلوتامین 4±100، 6±114، 3±93 و 3±105 درصد برای معرف‌های اضافه شده به اولترافیلترات پلاسما، 7±93، 25±108±25، 108 بود. و 4±95 درصد برای معرفهای اضافه شده به پلاسما، و 17±91، 12±105، 15±95 و 14±102 درصد برای معرفهای اضافه شده به ادرار برای دستیابی به غلظتهایی مشابه آنچه در افراد تجربی یافت شد. کراتینین و اوره در آزمایشگاه بالینی مورد سنجش قرار گرفتند.

آمار

نرخ ترخیص کالا از گمرک برای 1808 ویژگی شناسایی شده در ادرار و اولترافیلترات پلاسما با میزان کلیرانس کراتینین در هر آزمودنی با آزمون رتبه بندی علامت دار Wilcoxon با استفاده از SAS Enterprise Guide 4.3 مقایسه شد و مقایسه های جفت نشده بین مقادیر برای بیماران همودیالیزی و افراد عادی با استفاده از Mann انجام شد. – آزمون U ویتنی با استفاده از SPSS V20. سپس نرخ کشف نادرست با استفاده از Q-VALUE محاسبه شد.

قدردانی

ما از دکتر آندرس مارتینز از دانشگاه ایالتی پلی تکنیک کالیفرنیا، سان لوئیس اوبیسپو، کالیفرنیا، ایالات متحده، برای سنتز سولفات p-cresol deuterated، کارکنان آزمایشگاه طیف‌سنجی جرمی بنیاد وینسنت کوتس در دانشگاه استنفورد برای کمک به تجزیه و تحلیل، و دکتر جنی شن از دانشگاه استنفورد برای کمک به آمار. TLS توسط Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation NKF Fellowship برای مطالعه اورمی حمایت شد. پشتیبانی دیگری توسط NIH (R21DK84439 و RO1 DK80123 به TWM و RO1 DK80123 به THH) ارائه شد.

مواد تکمیلی

جدول S1. ویژگی های افراد عادی و بیماران همودیالیزی.

جدول S2. ویژگی های طیف سنجی جرمی به طور بالقوه نشان دهنده املاح پاکسازی موثر توسط کلیه و تجمع آنها در بیماران همودیالیزی است.

جدول S3. طیف سنجی جرمی پشت سر هم (MS/MS) از ویژگی هایی که از نظر شیمیایی به عنوان املاح به طور موثری توسط کلیه پاک می شوند شناسایی شده اند.

منابع

1. Vanholder R, Abou-Deif O, Argiles A, et al. نقش EUTox در اورمیکتحقیقات سموم Semin Dial 2009; 22: 323-328.

2. Meyer TW، Sirich TL، Hostetter TH. دیالیز را نمی توان دوز کرد. سمین دیال2011; 24: 471–479.

3. Meyer TW، Hostetter TH. اورمی. N Engl J Med 2007; 357: 1316-1325.

4. نیوا تی. به روز رسانی تحقیقات سم اورمیک توسط طیف سنجی جرمی. Mass Spectrom Rev 2011; 30: 510-521.

5. Rhee EP, Souza A, Farrell L, et al. پروفایل متابولیت نشانگرهای اورمی را شناسایی می کند. J Am Soc Nephrol 2010; 21: 1041-1051.

6. ساتو ای، کوهنو ام، یاماموتو ام و همکاران. تجزیه و تحلیل متابولیک پلاسمای انسانی از بیماران همودیالیزی. Eur J Clin Invest 2011; 41: 241-255.

7. Wishart DS، Knox C، Guo AC، و همکاران. HMDB: یک پایگاه دانش برای متابولوم انسان Nucleic Acids Res 2009; 37: D603–D610.

8. Smith CA، O'Maille G، Want EJ و همکاران. METLIN: یک پایگاه داده طیفی جرمی متابولیت. The Drug Monit 2005; 27: 747-751.

9. Zimmerman L, Jornvall H, Bergstrom J. Phenylacetylglutamine and hippuric acid در افراد اورمیک و سالم. نفرون 1990; 55: 265-271.

10. Guo K, Peng J, Zhou R et al. شکنش کروماتوگرافی مایع فاز معکوس جفت یونی در ترکیب با کروماتوگرافی مایع فاز معکوس-طیف سنجی جرمی برچسب گذاری ایزوتوپی برای پروفایل متابولوم جامع. J Chromatogr A 2011; 1218: 3689-3694.

11. Roux A, Xu Y, Heilier JF, et al. حاشیه نویسی متابولوم ادراری انسان بالغ و شناسایی متابولیت با استفاده از کروماتوگرافی مایع با عملکرد فوق العاده بالا همراه با طیف سنج جرمی تله یون چهارقطبی خطی-Orbitrap. Anal Chem 2012; 84: 6429-6437.

12. Zhang T، Creek DJ، Barrett MP، و همکاران. ارزیابی کوپلینگ فاز معکوس، فاز نرمال آبی و کروماتوگرافی مایع برهمکنش آبدوست با طیف‌سنجی جرمی Orbitrap برای مطالعات متابولومیک ادرار انسان. Anal Chem 2012; 84: 1994-2001.

13. دورانتون اف، کوهن جی، دی اسمت آر و همکاران. غلظت طبیعی و پاتولوژیک سموم اورمیک. J Am Soc Nephrol 2012; 23: 1258-1270.

14. Wikoff WR، Anfora AT، Liu J و همکاران. تجزیه و تحلیل متابولومیک اثرات بزرگ میکرو فلور روده را بر متابولیت های خون پستانداران نشان می دهد. Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106: 3698-3703.

15. Evenepoel P، Meijers BK، Bammens BR و همکاران. سموم اورمیک ناشی از متابولیسم میکروبی کولون. Kidney Int Suppl 2009; 76:S12–S19.

16. Schepers E، Glorieux G، Vanholder R. روده: اندام فراموش شده در اورمی؟ Blood Purif 2010; 29: 130-136.

17. Meyer TW، Hostetter TH. املاح اورمیک از میکروب های روده بزرگ. Kidney Int 2012; 81: 949-954.

18. Aronov PA، Luo FJ، Plummer NS و همکاران. کمک کولون به املاح اورمیک. J Am Soc Nephrol 2011; 22: 1769-1776.

19. اسمیت HW، Finkelstein N، Aliminosa L و همکاران. پاکسازی کلیوی مشتقات اسید هیپوریک جایگزین و سایر اسیدهای معطر در سگ و انسان. J Clin Invest 1945; 24: 388-404.

20. Marshall EK Jr. دو سخنرانی در مورد فیزیولوژی کلیه. فیزیولوژیست 1966; 9:367-384.

21. Benet LZ، Hoener BA. تغییرات در اتصال پروتئین پلاسما ارتباط بالینی کمی دارد. Clin Pharmacol Ther 2002; 71: 115-121.

22. الیور جی. معماری کلیه در بیماری مزمن بریت پل بی هوبر: نیویورک، 1939.

23. Meyer TW. آسیب لوله ای در بیماری گلومرولی کلیه Int 2003; 63:774-787.

24. Bradley SE، Bradley GP، Tyson CJ و همکاران. عملکرد کلیه در بیماری های کلیوی Am J Med 1950; 9: 766-798.

25. Bricker NS، Klahr S، Lubowitz H و همکاران. عملکرد کلیه در بیماری مزمن کلیه پزشکی (بالتیمور) 1965; 44: 263-288.

26. Igarashi P، Gulyassy P، Stanfel L، و همکاران. هیپورات پلاسما در نارسایی کلیه: روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا و کاربرد بالینی نفرون 1987; 47: 290-294.

27. Hannedouche T, Laude D, Dechaux M et al. پلاسما 5-هیدروکسی ایندول استیک اسید به عنوان یک شاخص درون زا از جریان پلاسمای کلیوی. Kidney Int 1989; 35: 95-98.

28. Voelker JR, Cartwright-Brown D, Anderson S, et al. مقایسه حلقه

دیورتیک ها در بیماران مبتلا به نارسایی مزمن کلیه. Kidney Int 1987; 32: 572-578.

29. Meijers B, Viaene L, Poesen R. نرخ فیلتراسیون گلومرولی تخمینی نشانگر خوبی برای کلیرانس کلیوی برای ایندوکسیل سولفات و p-cresyl sulfate PO384 ASN Kidney Week 2012 است.

30. Enomoto A, Takeda M, Taki K, et al. برهمکنش های آنیون آلی انسانی و همچنین ناقلان کاتیونی با ایندوکسیل سولفات. Eur J Pharmacol 2003; 466: 13-20.

31. Sugawara M، Mochizuki T، Takekuma Y و همکاران. رابطه ساختار - تمایل در تعاملات ناقل آنیون آلی انسانی 1 با کافئین، تئوفیلین، تئوبرومین و متابولیت های آنها. Biochim Biophys Acta 2005; 1714: 85-92.

32. Anzai N، Kanai Y، Endou H. خانواده ناقل آنیون آلی: دانش فعلی. J Pharmacol Sci 2006; 100: 411-426.

33. Miyamoto Y، Watanabe H، Noguchi T و همکاران. انتقال دهنده های آنیون آلی نقش مهمی در جذب p-cresyl sulfate، یک سم اورمیک، در کلیه ایفا می کنند. Nephrol Dial Transplant 2011; 26 (): 2498-2502.

34. Wikoff WR، Nagle MA، Kouznetsova VL و همکاران. متابولومیک غیرهدفمند متابولیت های انتروبیوم و سموم اورمیک احتمالی را به عنوان بسترهای انتقال دهنده آنیون آلی 1 (Oat1) شناسایی می کند. J Proteome Res 2011; 10: 2842-2851.

35. Tang-Liu DD, Williams RL, Riegelman S. Disposition of کافئین و متابولیت های آن در انسان. J Pharmacol Exp Ther 1983; 224: 180-185.

36. Psychogios N، Hau DD، Peng J و همکاران. متابولوم سرم انسان PLoS One 2011; 6: e16957.

37. Nordstrom A, Want E, Northen T et al. استراتژی طیف‌سنجی جرمی یونیزاسیون چندگانه برای آشکار کردن پیچیدگی متابولومیک استفاده می‌شود. Anal Chem 2008; 80: 421-429.

38. Pluskal T، Castillo S، Villar-Briones A و همکاران. MZmine 2: یک چارچوب مدولار برای پردازش، تجسم، و تجزیه و تحلیل داده های پروفایل مولکولی مبتنی بر طیف سنجی جرمی. BMC Bioinformatics 2010; 11: 395.

39. Feigenbaum J, Neuberg C. روش ساده شده برای تهیه استرهای اسید سولفوریک معطر. J Am Chem Soc 1941; 63: 3529-3530. 590 Kidney International (2013) 84, 585-590 cl I n I cal I nvest I gat I on TL Sirich و همکاران: املاح پاکسازی شده با راندمان بالا

For more information:1950477648@gmail.com