تقلای فرکانس اپتوژنتیکی نوسانات تتا هیپوکامپ بازیابی حافظه کاری از کدهای فضایی و زمانی هیپوکامپ قسمت 3 را جدا می کند

ضربان‌سازی اپتوژنتیک نورون‌های ام‌اس منجر به همزمانی تتا غیرفیزیولوژیکی می‌شود

با کمال تعجب، تحریکات اپتوژنتیک 8 هرتزی که با سرعت نوسانات تتا مرتبط هستند، منجر به کاهش عملکرد در هنگام کدگذاری یا بازیابی حافظه اپیزودیک در کار theNPOR، و همچنین بازیابی حافظه کاری فضایی در DNMTStask شد. برای درک بیشتر اثرات ضربان تتا بر فیزیولوژی هیپوکامپ، ما قفل شدن فاز نوسان تتا را قبل و در طی تحریکات اپتوژنتیکی 8 هرتز (شکل 7 الف تکمیلی) تجزیه و تحلیل کردیم و دریافتیم که چنین تحریکی منجر به افزایش همزمانی فاز در دوره‌های تحریک می‌شود (شکل تکمیلی 7b). علاوه بر این، ما همبستگی متقاطع نوسانات تتا را در سراسر CA1 پشتی (فاصله 1 میلی متری بین الکترودها در امتداد محور سپتوتمپورال (تصویر تکمیلی 7c) تجزیه و تحلیل کردیم و دریافتیم که حرکت ریتم تتا در 8 هرتز باعث افزایش همبستگی متقاطع بین این دو الکترود می شود. شکل تکمیلی 7d).

ژنتیک علمی است که به مطالعه وراثت و تنوع ژنتیکی می پردازد و حافظه جنبه ای بسیار نگران کننده است. بنابراین، ژنتیک چه ربطی به حافظه دارد؟ این مقاله به بررسی مسائل مربوط به حافظه از دیدگاه ژنتیکی می پردازد.

اول از همه می دانیم که ژن های ژنتیکی زمینه ساز رشد جسمی و فکری انسان هستند و برتری این ژن ها بر حافظه افراد تاثیر می گذارد. آخرین تحقیقات نشان می دهد که ضریب هوشی و حافظه افراد تحت تاثیر عوامل ژنتیکی است. تحقیقات نشان می دهد که ژن های ژنتیکی نقش مهمی در هوش و حافظه دارند. بنابراین، برخی از افراد با حافظه قوی تری متولد می شوند، در حالی که برخی دیگر باید سخت کار کنند و برای بهبود حافظه خود تمرین کنند.

ثانیاً عوامل محیطی نیز از عوامل مهم در رشد حافظه هستند. ما نه تنها به حمایت از ژن های ژنتیکی نیاز داریم، بلکه باید حافظه خود را از طریق آموزش های علمی و عادات خوب زندگی بهبود ببخشیم. به عنوان مثال، ما می‌توانیم هر روز ورزش کنیم، خواب کافی داشته باشیم، اصول تطبیق غذا و غیره را رعایت کنیم که می‌تواند به بهبود عملکرد مغز و حافظه ما کمک کند.

در نهایت، مردم عادی، بیش از حد بر تأثیر عوامل ژنتیکی بر رشد حافظه تأکید نمی کنند. از آنجایی که عوامل ژنتیکی مطلق نیستند، حافظه و هوش افراد همچنان می تواند با بهبود تلاش و آموزش، خود را بهبود بخشد. ما باید همیشه یک نگرش مثبت و مستمر یادگیری داشته باشیم و دائما پتانسیل حافظه خود را کشف و توسعه دهیم. من معتقدم که تنها از این طریق می توانیم باهوش تر شویم و احساس موفقیت بیشتری داشته باشیم. به طور خلاصه، رابطه بین ژنتیک و حافظه بسیار نزدیک است، اما نباید به عوامل ژنتیکی بیش از حد تأکید کرد، بلکه باید دائماً حافظه و هوش خود را از طریق خودسازی و آموزش تقویت کنیم.

مشاهده می شود که باید حافظه خود را تقویت کنیم. Cistanche deserticola می تواند به طور قابل توجهی حافظه را بهبود بخشد زیرا Cistanche deserticola یک ماده دارویی سنتی چینی با اثرات منحصر به فرد بسیاری است که یکی از آنها بهبود حافظه است. اثربخشی گوشت چرخ کرده از مواد فعال مختلفی که شامل اسید، پلی ساکاریدها، فلاونوئیدها و غیره است، ناشی می شود. این مواد می توانند به طرق مختلف سلامت مغز را ارتقا دهند.

روی 10 روش برای بهبود حافظه کلیک کنید

بحث

Within the septohippocampal system, the exact causal relationships between (1) MS activity, (2) hippocampal oscillations, (3) hippocampal neuron activity, and (4) behavior, including memory, remain an active area of research. In particular, whether and how the MS supports encoding of place and time in the hippocampus, as well as its specific contribution to memory function, remain unclear. Here, we leveraged more recent techniques that allowed us to record >1000 نورون در حین انجام تحریک اپتوژنتیکی نورون‌های ام‌اس با رزولوشن فرعی برای کنترل ریتم‌های تتا و ارزیابی نقش آنها در فیزیولوژی و حافظه هیپوکامپ. نکته مهم این است که با استفاده از یک تحریک اپسین و تحریکات درهم یا 8 هرتز، ما توانستیم به ترتیب تتا هیپوکامپ را به طور مداوم و قوی لغو یا سرعت دهیم.

در مقایسه با مهار MS با استفاده از یک اپسین یا ترکیبات دارویی بازدارنده (مثلاً موسیمول)، رویکرد ما امکان مقایسه بین موضوعی دو حالت متضاد (گام در مقابل لغو تتا) را در عین حفظ سطح فعالیت در سلول‌های MS-PV فراهم می‌کند. ما تکلیف مسیر خطی مبتنی بر تئوری را ترکیب کردیم که همراه با رویکردهای نظری اطلاعاتی، به ما امکان داد کدهای هیپوکامپ مکانی و زمانی را از هم جدا کنیم. این روش نیاز به آستانه های دلخواه را کاهش می دهد و یک رویکرد استاندارد برای آنالیز تصویربرداری کلسیم را امکان پذیر می کند. در حالی که بخش بزرگی از نورون‌های هرمی CA1 ترکیبی از کدهای مکانی-زمانی را بیان می‌کردند، ما تجزیه و تحلیل‌های خود را بر روی نورون‌هایی متمرکز کردیم که به طور خاص در مکان، زمان یا مسافت پیموده شده بودند.

در حالی که کدگذاری فضایی به طور گسترده در CA1 بررسی شده است، کدهای زمانی و فاصله اخیراً توجه بیشتری به دست آورده اند. کدهای Temporal28،35-37 و distance37 توسط نشانه های بصری-فضایی گیره استخراج شده اند یا به صورت تحلیلی با استفاده از مدل های خطی تعمیم یافته در پارادایم های واقعیت مجازی استخراج شده اند. در اینجا، ما رویکردی را برای تفکیک کدهای مکانی، زمانی و فاصله با استفاده از رویکرد نظری اطلاعاتی پیشنهاد می‌کنیم که همراه با تکلیف cuedalternation ما، تجزیه و تحلیل کدهای چندگانه فضایی و زمانی و فضایی دنیای واقعی را در حیواناتی که آزادانه در حال حرکت هستند را امکان‌پذیر می‌سازد. مقدار زیادی از نورون‌های هرمی CA1 اطلاعات مضاعف مکان، فاصله و زمان را همانطور که قبلاً گزارش شده بود، علاوه بر سیگنال‌های خود حرکتی مانند شتاب، سرعت و جهت‌گیری، کد می‌کنند.

ما دریافتیم که درهم‌زدایی فرکانس و تحریکات اپتوژنتیک 8 هرتز به ترتیب ریتم‌های تتا را به شدت لغو یا سرعت می‌دهند و منجر به کاهش فعالیت کلی در زیرجمعیت سلول‌های هرمی CA1 می‌شود در حالی که تغییرات قابل‌توجهی در فعالیت سلول‌های مکان ایجاد نمی‌کند، مشابه گزارش‌های قبلی با استفاده از مهار دارویی36. 46،47 یا اپتوژنتیک 9،48 ضربان MS یا ورودی های سپتوم به هیپوکامپ. از آنجایی که نورون‌های MS به عنوان محرک اصلی نوسانات هیپوکامپ شناخته می‌شوند، انتظار داشتیم که تحریک MS با اختلال در فعالیت سلولی در زمان یا فاصله در شرایط کاهش ریتم تتا مرتبط باشد، اما با از بین رفتن یا سرعت تتا هیچ تغییری رخ نداد. علاوه بر این، سرعت نوسانات هیپوکامپ تا 8 هرتز منجر به تغییراتی در کیفیت کدهای فضایی گزارش شده قبلی نشد و کدهای زمانی را همانطور که در الگوی رفتاری ما مشاهده شد تغییر نداد.

اگرچه گزارش شده است که سلول‌های زمان (اما نه مکان) می‌توانند مستقیماً به ورودی‌های قشر داخلی داخلی (MEC) وابسته باشند، شواهد تجربی اخیر نشان می‌دهد که ضایعات MEC منجر به هیچ تغییری در فیزیولوژی سلولی زمان هیپوکامپ نمی‌شود. به طور قابل توجهی، تحقیقات جدیدتر نشان داد که قدم زدن اپتوژنتیک MSdid کدهای فضایی سلول‌های شبکه را در قشر انتروینال 63 مختل نمی‌کند، و بیشتر نشان می‌دهد که فعالیت MS مستقیماً در کدهای فضایی در ساختار هیپوکامپ دخالت ندارد. همراه با نتایج ما، این نشان می‌دهد که کدهای زمانی می‌توانند ناشی از محاسبات وابسته به MS در داخل قشر درونی 63 (1) باشند یا به طور ذاتی در خود هیپوکامپ ایجاد شوند (2).

در حالی که مطالعات اولیه نشان داد که ام اس نقش اساسی در حفظ سلول های زمانی و حمایت از حافظه فعال ایفا می کند، شواهد تجربی اخیر نشان می دهد که سهم دقیق سلول های زمانی در عملکرد حافظه کاری می تواند کمتر از آنچه قبلا تصور می شد باشد. از آنجایی که نورون‌های MS-PV احتمالاً در طول تحریک اپتوژنتیکی درهم‌کوبی فرکانس، سطوح فعالیت قابل‌توجهی را حفظ می‌کنند (برخلاف رویکردهای بازداری)، نتایج ما به شدت از نقش فعالیت سپتوم زمان‌بندی‌شده دقیق در حمایت از حافظه کاری، که قبلاً فرضیه‌ای برای آن وجود داشت، حمایت می‌کند. اگرچه هنگام استفاده از تحریک اپتوژنتیک در طول بازیابی، کاهش عملکرد حافظه را مشاهده کردیم، تحریک در مرحله رمزگذاری وظایف DNMTS با کاهش حافظه در کار DNMTS مرتبط نبود. سرعت دادن به نوسانات تتا در 8 هرتز در طول مرحله رمزگذاری یا بازیابی وظیفه theNOPR منجر به اختلال در بازیابی حافظه شد. تحلیل‌های الکتروفیزیولوژیک ما بیشتر نشان می‌دهد که چنین تحریکی باعث می‌شود که مناطق دور CA1 پشتی در همان فاز با قفل شدن فاز غیرفیزیولوژیکی حباب شوند. در حالی که ما مستقیماً رابطه علی بین تغییرات فاز و عملکرد حافظه را بررسی نکردیم، زمان سنبله و تقدم فاز نیز علیرغم ترک محل کدینگ64 با تغییر عملکرد حافظه کاری مرتبط بود. علاوه بر این، قبلاً نشان داده شده بود که قفل شدن فاز نورون‌های هرمی به تتانوسان‌ها پیش‌بینی‌کننده عملکرد حافظه است.

نکته قابل توجه، یکی از محدودیت‌های رویکرد ما برای ایجاد ویژگی‌های تنظیم فاصله زمانی زمین این است که به نمونه‌برداری چهار برابر بیشتر از یک مسیر خطی معمولی نیاز دارد که در هنگام افزودن شرایط تحریک به جدول زمانی آزمایشی، شانس فتوبلیچینگ را افزایش می‌دهد. در حالی که متوجه شدیم که کدهای فضایی تحت تأثیر تحریکات اپتوژنتیک در همان جلسه قرار نمی گیرند، سخت افزار تصویربرداری جدیدتر که شامل حسگرهایی با حساسیت افزایش یافته است می تواند به جلوگیری از سفید شدن نور کمک کند و امکان ضبط طولانی تر جلسات را فراهم کند، بنابراین نمونه برداری از سلول های زمانی و فاصله ای همراه با تحریکات. ما همچنین دریافتیم که مجموعه نورون هایی که به طور قابل توجهی و به طور خاص تنها یک متغیر را رمزگذاری می کنند در مقایسه با تعداد نورون های پیوندی کوچک است و نیازهای نمونه برداری را برای این نورون های بسیار خاص بسیار بالاتر می کند.

ما شواهد تجربی ارائه می دهیم که دستکاری MS سرعت حرکتی را تغییر نمی دهد و برعکس، سرعت حرکتی فرکانس تتا را دیکته می کند. حتی اگر کدهای مکان و زمان در طول تحریکات ام اس حفظ شد، بخشی (~6٪) از سلول ها به طور مستقیم تعدیل شده بودند و می توانستند اختلالات حافظه مشاهده شده در سنجش رفتاری ما را ایجاد کنند. قبلاً گزارش شده بود که نورون‌های PV در هیپوکامپ بخشی از یک ریزمدار در تنظیم تثبیت حافظه هستند و دستکاری‌های اپتوژنتیک ما می‌تواند با خاموش کردن بخشی از این سلول‌ها مرتبط باشد. علاوه بر این، اگرچه ما تغییراتی را در باندهای فرکانسی به غیر از تتا مشاهده نکردیم، نمی‌توانیم رد کنیم که زمان سنبله نورون هرمی CA1 می‌تواند به شدت در هنگام درهم‌کوبی نوسانات تتا تغییر کند، در حالی که نشان داده شد تحریک 8 هرتز منجر به افزایش فعالیت هیپوکامپ نمی‌شود. آن الگوهای تحریک بر عملکرد حافظه کاری اختلالات حافظه که مشاهده کردیم احتمالاً غیر کولینرژیک بودند: اولاً، در آزمایش‌های ایمونوهیستولوژیک ما، عملاً هیچ بیانی از ChrimsonR در نورون‌های Chat MS پیدا نکردیم. نورون‌های چت با کاهش فرکانس موجی مرتبط هستند45،57. ترانسفکشن ChrimsonR نورون های MS VGLUT2 نیز بعید است زیرا فعال شدن این نورون ها با افزایش مستقیم فعالیت حرکتی 68 همراه است که ما مشاهده نکردیم.

اگرچه آرایش زمانی دقیق سنبله های هرمی CA1 می تواند حداقل تا حدی اثرات تحریک MS بر حافظه را توضیح دهد، مکانیسم های جایگزین باید در نظر گرفته شود. به طور قابل‌توجه، علاوه بر هیپوکامپ و قشر آنتورینال، نورون‌های MS PV به قشر رتروسپلنیال 3 می‌رسند و می‌توانند مسئول برخی از اختلالات حافظه مشاهده‌شده در اینجا باشند.

به طور خلاصه، با استفاده از تصویربرداری کلسیم، اپتوژنتیک و الکتروفیزیولوژی، دریافتیم که ریتم‌های تتا را می‌توان با تحریک MS تنظیم کرد یا لغو کرد. چنین تحریکی باعث اختلال در بازیابی اپیزودیک و همچنین حافظه کاری می شود. این اثرات غیر کولینرژیک بودند و فعالیت ریپل هیپوکامپ را مختل نکردند. در نهایت، در حالی که بخش کوچکی از نورون های هیپوکامپ به طور مستقیم به تحریک اپتوژنتیک MS پاسخ دادند، سلول های مکان، زمان و فاصله با دستکاری نوسانات تتا مختل نشدند. این نتایج با هم نشان می دهد که در حالی که ورودی MS به هیپوکامپ نقش اساسی در حافظه ایفا می کند، کدهای چندگانه در نورون های هرمی CA1 ممکن است بستر مستقیمی برای چنین عملکردهایی نباشد.

مواد و روش ها

حیوانات

تمام مراحل توسط کمیته مراقبت از حیوانات دانشگاه مک گیل و شورای مراقبت از حیوانات کانادا (پروتکل 2015-7650) تأیید شد. در مجموع n=41 نر (n=20) و ماده (n=21) 8 تا 16 هفته، B6;129P2 PV-Cre موش (آزمایشگاه جکسون، RRID: IMSR{{ 10}}JAX:017320) در این مطالعه استفاده شد. n=5 موش برای ترکیب اپتوژنتیک با تصویربرداری کلسیم استفاده شد. n=3 موش برای کلسیم‌برداری، اپتوژنتیک و کنترل‌های الکتروفیزیولوژیک کاشته شدند. n=4 موش مورد استفاده در مطالعات الکتروفیزیولوژیک. n=29 موش ترانسفکت شده و برای سنجش رفتاری کاشته شدند. موش‌ها به‌صورت جداگانه در 12-ساعت چرخه نور/تاریکی در دمای 22 درجه و رطوبت 40 درصد همراه با غذا و آب آزاد نگهداری شدند. تمام آزمایش ها در طول بخش نور از چرخه نور/تاریکی انجام شد.

ناقلان ویروسی مرتبط با آدنو

ویروس مرتبط با آدنو AAV5.CamKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 (Addgene# 100834، به‌دست‌آمده از دانشگاه پنسیلوانیا وکتور هسته) در تمام آزمایش‌های تصویربرداری کلسیم استفاده شد. ویروس مرتبط با آدنو (AAV) سروتیپ dj (کپسید هیبریدی ایجاد شده از هشت سروتیپ AAV مختلف) AAVdj-hSyn-ChrimsonR-tdTomato از مرکز هسته Vector در دانشگاه بهداشت و علوم اورگان در پورتلند، اورگان به دست آمد. اگرچه او یک ژن خانه داری است، ما ترانسفکشن را در سلول های کولینرژیک مشاهده نکردیم (به "نتایج" و شکل 2b-e مراجعه کنید). یک ساختار eYFP بدون توالی ChrimsonR به عنوان کنترل (که در این دستنوشته به آن کنترل YFP گفته می شود) استفاده شد.

روش های جراحی

موش‌ها با ایزوفلوران (5% القا، 0.5-1% نگهداری) بیهوش شدند و در یک قاب استریوتاکسی (David Kopf Instruments) قرار گرفتند. دمای بدن با یک پد حرارتی حفظ شد، چشم‌ها با ژل (Optixcare) هیدراته شدند. و کارپروفن (10 ml/kg) به صورت زیر جلدی تجویز شد. جمجمه به طور کامل از تمام بافت همبند پاک شد و کرانیوتومی های کوچک با استفاده از یک مته دندان برای تزریق یا ایمپلنت بعدی انجام شد.

تزریقات ویروسی تمام تزریقات ویروسی با استفاده از پیپت شیشه ای متصل به انژکتور Nanoject III (Drummond) انجام شد. 500 nl از AAVdjhSyn-ChrimsonR-tdTomato (یا کنترل eYFP) با سرعت 1 nL/s در مختصات زیر بر اساس اطلس استریوتاکسی موش مرجع (فاصله از Bregma در میلی متر: قدامی خلفی (AP) 0.85، مدیولترال (ML) 0، پشتی وانتریک (DV) 4.50- با استفاده از زاویه 5 درجه در صفحه ML. پس از جراحی، حیوانات تا زمان بهبودی تحت نظر قرار گرفتند.

ایمپلنت فیبر نوری دو هفته پس از تزریق، موش ها برای کاشت به دنبال همان روش جراحی بیهوش شدند. فیبر نوری A200 میکرومتر با فرول سرامیکی (Thorlabs) در همان مختصات کاشته شد. ایمپلنت ها در محل با استفاده از C&B-Metabond® (دندانپزشکی پترسون) سیمان شدند. برای جلوگیری از انتشار نور در طول تحریک اپتوژنتیک، لاک سیاه روی سیمان دندانی اعمال شد.

کاشت الکترود. آرایه ای از 7 میکروالکترود تنگستن (~1 MΩImpedance) در CA1 پشتی پوشا از طریق stratumpyramidale (pyr)، لایه radiatum (rad)، و لایه lacunosummoleculare (lm) کاهش یافت. پیچ‌هایی که در استخوان بالای قشر پیشانی و مخچه قرار می‌گیرند به ترتیب به عنوان زمین و مرجع عمل می‌کنند. پس از قرار دادن الکترود، زمین و محل مرجع، سیمان دندانی برای محکم کردن دائمی ایمپلنت روی جمجمه اعمال شد.

ایمپلنت برای تصویربرداری از کلسیم ما ویروس AAV5.CamKII.GCaMP6f (200 nL در 1 nl s-1) را در CA1 هیپوکامپ با استفاده از مختصات زیر تزریق کردیم: قدامی خلفی (AP) - 1.{7}} میلی‌متر از برگما، مدیولترال (ML) 1.5 میلی‌متر، خلفی وسطی (DV) 1.5 میلی متر. دو هفته پس از تزریق، موش ها با ایزوفلوران بیهوش شدند و جمجمه پاک شد. آ<2 mm diameter craniotomy was performed in the skull above the injection site. An anchor screw was placed on the posterior plate above the cerebellum. The dura was removed, and the portion of the cortex above the injection site was aspirated using a vacuum pump until the corpus callosum was visible. These fiber bundles were then gently aspirated without applying pressure on the underlying hippocampus, and a 1.8 mm diameter gradient index (GRIN; Edmund Optics) lens was lowered at the following coordinates: AP − 1.86 mm from bregma, ML 1.5 mm, DV 1.2 mm. The GRIN lens was permanently attached to the skull using C&B-Metabond (Patterson Dental), and Kwik-Sil (World Precision Instruments) silicone adhesive was placed on the GRIN to protect it. Four weeks later, the silicone cap was removed and CA1 was imaged using a miniscope mounted with an aluminum base plate while mice were under light anesthesia (<0.5% isoflurane) to allow the visualization of cell activity. When a satisfying field of view was found (large neuronal assembly, visible landmarks), the base plate was cemented above the GRIN lens, the mini scope was removed, and a plastic cap was placed on the base plate to protect the GRIN lens.

تصویربرداری همزمان از کلسیم و ضبط الکتروفیزیولوژیک. برای کنترل اثرات ایمپلنت های GRIN بر روی تتا هیپوکامپ و همچنین گفتگوی متقابل بین مینی اسکوپ و لامپ های تحریک اپتوژنتیک، میکرو الکترودهای تنگستن را به لنزهای GRIN متصل کردیم. برای این منظور، لنزهای GRIN را به صورت افقی در زیر یک میکروسکوپ با بزرگنمایی کم در محیطی عاری از گرد و غبار قرار دادیم. یک میکروالکترود تنگستن با استفاده از یک میکرومانیپولاتور به آرامی روی لبه بالایی لنز GRIN قرار داده شد. ما از قطر شناخته شده لنز GRIN به عنوان واحد مرجع برای تخمین برآمدگی مورد نظر الکترود (~50 میکرومتر، که بعد از گرفتن میکروعکس از آماده سازی به صورت دیجیتالی ارزیابی می شود) توسط مختصات کاشت برنامه ریزی شده خود استفاده کردیم. مقدار کمی (~50 میکرولیتر) سوپرچسب در لبه بالایی لنز GRIN با الکترود در جای خود قرار داده شد و قبل از اعمال لایه بعدی چسب به مدت 10 دقیقه خشک شد. پنج لایه نازک برای حفظ الکترود متصل به لنز GRIN استفاده شد. پس از کاشت این مجموعه های الکترود GRIN با استفاده از پروتکل شرح داده شده در بالا، سیم های بیرون زده به آرامی خم شده و در زیر یک کلاه محافظ (ارتفاع 1-1.5 سانتی متر) که از گلابی پیپت مکش دستی به عنوان جایگزینی برای Kwik-Sil استخراج شده بود، پنهان شدند.

رویه های رفتاری in vivo

عادت. موش‌ها به آرامی به مدت 5 دقیقه در طول یک هفته، با عادت کردن تدریجی به روش اتصال (فیبر نوری، مینی‌سکوپ، و تترهای پیش تقویت‌شده الکتروفیزیولوژیک) مورد استفاده قرار گرفتند. حیوانات سپس با آب برنامه ریزی شدند (2 ساعت دسترسی در روز).

ضبط های مینیسکوپی مینیسکوپ ها (V3) با استفاده از دستورالعمل های منبع باز (miniscope.org) مونتاژ شدند. داده های تصویربرداری با استفاده از حسگر تصویربرداری CMOS (Aptina، MT9V032) به دست آمد و از طریق کابل کواکسیال سبک وزن مالتی پلکس شد. داده‌ها با استفاده از یک جعبه جمع‌آوری داده (DAQ) متصل شده از طریق یک کنترل‌کننده میزبان USB (Cypress، CYUSB3013) به دست آمد. رفتار حیوانات با استفاده از یک وب‌کم درجه مصرف‌کننده (Logitech) که در بالای محیط نصب شده بود، ثبت شد. کلسیم و داده‌های رفتاری با استفاده از miniscope.org، منبع DAQ نرم‌افزار اکتسابی سفارشی ثبت شد. DAQ به طور همزمان جریان‌های تصویربرداری رفتاری و سلولی را با فرکانس 30 هرتز به‌عنوان فایل‌های فشرده‌نشده.avi با 1000 فریم برای جلسات ضبط 15- دقیقه‌ای، همراه با مهرهای زمانی متناظر برای فعال کردن تراز زمانی دقیق داده‌های تصویربرداری رفتاری و کلسیمی دریافت کرد.

ضبط های الکتروفیزیولوژیکی در داخل بدن پس از 1 هفته بهبودی پس از جراحی و یک هفته عادت کردن به تنظیمات اتصال، LFP از موش های کاشته شده ثبت شد. تمام سیگنال‌های ضبط‌شده از الکترودهای کاشته‌شده، قبل از دیجیتالی شدن در فرکانس ۲۲ کیلوهرتز با استفاده از یک سیستم ضبط دیجیتال (Neuralynx، ایالات متحده آمریکا) توسط پیش تقویت‌کننده تتر تقویت شدند. ضبط هر سیگنال کانال همراه با ضبط ویدئویی و سیگنال های TTL از دیود لیزر برای تجزیه و تحلیل بعدی ذخیره شد.

تحریک اپتوژنتیک تحریک لیزر از طریق طناب فیبر نوری (قطر 200 میکرومتر) با استفاده از منبع نور فیبر دیود لیزر (عدسی‌های دوریک) انجام شد. شدت نور کالیبره شد و طول موج با استفاده از دسته Power Meter با کنسول PM100D و S130C Slim Photodiode Sensorlight (Thorlabs) کالیبره شد. هر تحریک ضربان (شامل 8 هرتز) با استفاده از پالس‌های مربعی 5 میلی‌ثانیه انجام شد. برای اعمال تحریک نور درهم، از یک میکروکنترلر آردوینو برای تولید یک سیگنال نوسان نویز سفید استفاده کردیم که مستقیماً به ورودی آنالوگ درایور دیود لیزر وارد می‌شود. برای انجام تحریک فرکانس انتخابی تصادفی، از پروتکل استاندارد 5 ثانیه ON، 5 ثانیه خاموش استفاده کردیم، اما برای هر دوره تحریک، از یک میکروکنترلر آردوینو به صورت تصادفی فرکانس تحریک را در باند تتا انتخاب کردیم. هنگام اعمال تحریک اپتوژنتیک در حین رفتار، یک قطعه شل از لوله انقباض حرارتی در اطراف محل اتصال بین پچ کورد و ایمپلنت فرول موش نصب شد تا انتشار نور مرئی را محدود کند. شدت نور به صورت توان اسمی بیان می شود، همانطور که در نوک مجموعه ایمپلنت-بند فیبر نوری اندازه گیری می شود (قبل از قرار دادن جراحی)، و برای طول موج مناسب تصحیح می شود.

سنجش های رفتاری

آهنگ خطی تون متوالی. موش‌ها بر اساس آب برنامه‌ریزی شده بودند و می‌توانستند فقط ۲ ساعت در روز از ساعت ۶ تا ۸ بعد از ظهر به آب دسترسی داشته باشند تا کدهای مکانی، زمانی و فاصله‌ای را تفکیک کنیم، ما یک مسیر خطی به طول ۱۳۴ سانتی‌متر با استفاده از آجرهای لگو® خاکستری متوسط ​​می‌سازیم که امکان تغییرات و اجرای آسان بدون نیاز به تغییر دائمی ساختار ماز. سنسورهای پیروالکتریک در هر انتهای مسیر خطی قرار گرفتند و به یک میکروکنترلر آردوینو متصل شدند. هر ردیابی آهنگ جدیدی را به ترتیب ایجاد می کند که نشان دهنده پیشرفت به سمت تحویل است. صداهای زیر با استفاده از بلندگوی apiezo استفاده و ارائه شدند: بوق 1 ثانیه در 2000 هرتز، بوق 250 میلی ثانیه در 3000 هرتز و تون پیوسته در 4000 هرتز. هنگامی که آخرین صدای پیوسته شروع شد، یک جایزه (10٪ ساکارز در آب) در انتهای مسیر خطی در درپوش یک لوله فالکون 15 میلی لیتری تحویل داده شد. تغییر جهت در حال اجرا قبل از شروع صدای بعدی به عنوان خطا در نظر گرفته شد و باعث تحویل پاداش نشد. عملکرد بر اساس تعداد آزمایش‌های صحیح (بدون خطا) تقسیم بر تعداد کل آزمایش‌ها اندازه‌گیری شد.

تشخیص مکان شی جدید. در روز اول، به موش‌ها اجازه داده شد تا به مدت 10 دقیقه در یک میدان باز خاکستری تیره به ابعاد 45 × 45 سانتی‌متر که حاوی تصاویر بصری (شبکه‌های بزرگ سفید افقی و عمودی) روی دیواره‌های آن بود، کاوش کنند. در روز دوم، دو شیء یکسان (پایه دست کمکی) به مدت 10 دقیقه ارائه شد. در روز سوم، موش‌ها اجازه یافتند در همان میدان باز کاوش کنند در حالی که مکان یکی از دو شی جابجا شده بود. برای کنترل ترجیحات فضایی بالقوه، هم موقعیت اولیه و هم موقعیت جابجا شده اشیا، تصادفی شدند. موش‌ها ترتیب آزمایش تصادفی را نسبت داده‌اند که در طول سه روز آزمایش یکسان بود. رفتار با دوربین فیلمبرداری (Logitech) ضبط و به صورت آفلاین تجزیه و تحلیل شد. تجزیه و تحلیل رفتاری کور به ژنوتیپ و درمان انجام شد. کاوش‌های شی به عنوان دوره‌هایی تعریف شدند که موش‌ها بینی خود را در فاصله 1 سانتی‌متری از یک شیء دارند. RI به صورت زیر محاسبه شد:

عدم تطابق با کار نمونه با تأخیر خودکار. موش‌ها در یک ماز ​​T پیوسته برنامه‌ریزی و آموزش داده شدند تا یک کار نمونه با تأخیر غیر همسان. به طور خلاصه، هر کارآزمایی به دو مرحله نمونه و آزمایش تقسیم شد. در مرحله نمونه، یک بازو مسدود شد و موش‌ها مجبور شدند بازوی مقابل را کاوش کنند، جایی که 50 میکرولیتر پاداش آب ساکارز 10% دریافت کردند. پس از تکمیل فاز نمونه، موش ها با تاخیر (10 ثانیه) در محفظه شروع قرار گرفتند. سپس، در طول مرحله آزمایش، هر دو بازو را می‌توان کاوش کرد، اما فقط بازوی مخالف (کاوش‌نشده) طعمه شد تا موش‌ها مجبور شوند مکان‌های متناوب بین فاز نمونه و آزمایش را تغییر دهند. موش ها به مدت 10 روز متوالی تحت 10 کارآزمایی (نمونه + آزمون) در روز قرار گرفتند و موفقیت روزانه به عنوان تعداد آزمایش های صحیح تقسیم بر تعداد کل آزمایش ها محاسبه شد.

تجزیه و تحلیل بافت شناسی پس از مرگ

پس از تکمیل آزمایش رفتاری، موش‌ها با مخلوطی از کتامین/گزیلازین/اسپرومازین (به ترتیب 100، 16، 3 میلی‌گرم/کیلوگرم، تزریق داخل صفاقی) عمیقاً بیهوش شدند و با 4% پارافورمالدئید (PFA) در PBS از طریق قلب پرفیوژن شدند. مغزها استخراج و پس از تثبیت یک شبه در PFA در دمای 4 درجه و متعاقباً در PBS به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه شسته شدند. مغزها و مقاطع در محلول 30٪ اتیلن گلیکول، 30٪ گلیسرول، و 40٪ PBS تا زمان استفاده از سرما محافظت شدند. سپس هر مغز با استفاده از یک ویبراتوم در 50 میکرومتر برش داده شد: هر بخش به طور متوالی در 4 لوله مختلف 1.5 میلی لیتری جمع آوری شد تا امکان تجزیه و تحلیل های مختلف فراهم شود. (محل الکترود، ایمونوهیستوشیمی).

ایمونوهیستولوژی. با استفاده از یک لوله از مقاطع مغزی جمع‌آوری‌شده (نمونه‌گیری 25 درصد) برای هر آنالیز، بخش‌ها به مدت 3 × 5 دقیقه در PBS شسته شدند تا محلول محافظ انجماد خارج شود. برش ها یک شبه با PGT (0.45% ژلاتین و 0.25% تریتون در PBS) در دمای 4 درجه انکوبه شدند. سپس برش ها با آنتی بادی های اولیه: یا 1:200 بز-کولین-استیل انکوبه شدند. -ترانسفراز از Millipore یا IgG1 ضد PV مونوکلونال موش 1:500 از سیگما آلدریچ در PGT در دمای اتاق به ترتیب برای 48 ساعت یا 2 ساعت. پس از شستشوی 10، 20، و 30 دقیقه‌ای، بخش‌ها با آنتی‌بادی‌های ثانویه [1:2000 ضد بز همراه با الکسا 488 یا 1:500 بز ضد موش IgG1 همراه با الکسا 488 (تکنولوژی‌های زندگی)] در PGT انکوبه شدند. 45 دقیقه پس از شستشوهای 10،20 و 30 دقیقه‌ای در PBS، بخش‌ها بر روی اسلایدهای شیشه‌ای نصب شدند و به طور دائم با محیط نصب Fluoromount که حاوی DAPI بود، پوشانده شدند. فقط موش‌هایی که قرار دادن ایمپلنت‌ها از نظر بافت‌شناسی تایید شده بود در این مطالعه وارد شدند. برای لنزهای GRIN، سطح لنز باید باشد<100 µm above stratum pyramidale, and GCaMP6f expression was validated using fluorescence microscopy. Electrophysiological implants had to include at least one microelectrode in CA1 stratum radiatum or stratum pyramidale. Finally, the tips of fiber optics had to be within 100 µm of the MS region, and proper construct expression was assessed using fluorescence microscopy.

تحلیل داده ها

Except for analyses of SWRs and the explicit impact of locomotion on physiological recordings, electrophysiological and calcium imaging analyses were performed only on periods of locomotion (>2 cm s−1 in the open field; >5 cm s-1 در مسیر خطی).

ردیابی خودکار رفتار برای استخراج اطلاعات در مورد موقعیت، سرعت و جهت سر موش ها، از DeepLabCut70،71 استفاده کردیم. به طور خلاصه، ما مدلی را برای تشخیص گوش، بینی، بدن و پایه دم موش آموزش دادیم. جهت سر با استفاده از زاویه بین هر گوش یا بینی و بدن، بسته به در دسترس بودن اندازه گیری، تخمین زده شد. داده های مکان به فرکانس نمونه برداری تصویربرداری کلسیم با استفاده از درون یابی خطی درون یابی شد. سرعت با محاسبه Δd/Δt که d فاصله و زمان t است استخراج شد و متعاقباً با اعمال یک فیلتر گاوسی با سیگما=33 ms برای حذف مصنوعات تشخیص، نتیجه را هموار کرد. سیگنال های سرعت برای شناسایی دوره های فعالیت حرکتی و محاسبه مکان، زمان و مدولاسیون فاصله فعالیت به طور خاص برای آن دوره ها استفاده شد.

تجزیه و تحلیل تصویربرداری کلسیم تجزیه و تحلیل داده های تصویربرداری کلسیم با استفاده از MATLAB 2020a و Python 3.8.4 انجام شد. ضبط‌های ویدئویی با استفاده از خط لوله تحلیل Miniscope (https://github.com/etterguillaume/MiniscopeAnalysis) تجزیه و تحلیل شدند. به طور خلاصه، تصحیح حرکت صلب (چرخش و ترجمه) با استفاده از NoRMCorre72 اعمال شد و ویدیوها قبل از الحاق به صورت فضایی (3×) نمونه‌برداری شدند. ردپای کلسیم با استفاده از CNMFe51 با استفاده از پارامترهای زیر استخراج شد: gSig=3 پیکسل (عرض هسته گاوسی)، gSiz=20 پیکسل (قطر تقریبی نورون)، پس زمینه_مدل=حلقه }} (حداقل آستانه نسبت پیک به نویز).

ردپای کلسیم خام برای حذف نوسانات با فرکانس بالا فیلتر شد و باینریزه شد: به طور خلاصه، زمانی که دامنه سیگنال کلسیم نرمال شده از دو انحراف استاندارد فراتر رفت، نورون‌ها فعال در نظر گرفته شدند و مشتق مرتبه اول بالاتر از 0 بود (برای جزئیات بیشتر به رجوع به 52 مراجعه کنید. در روش شناسی52). برای استخراج نورون‌هایی که روی متغیرهای خاص تنظیم می‌شوند، مکان، زمان و فاصله در آن قرار گرفتند (مکان: سطل‌های 3 سانتی‌متری؛ زمان: سطل‌های 1 ثانیه؛ فاصله: سطل‌های 3 سانتی‌متری). از سیگنال‌های باینریزه شده، احتمال نهایی سلول‌هایی را که P Að Þ فعال هستند محاسبه کردیم که به عنوان یک پروکسی برای فعالیت عصبی استفاده می‌شود. مهمتر از آن، احتمال اشتقاق یا «احتمال فعال بودن با توجه به وضعیت موجود» PA j Si با استفاده از متغیرهای binned:

که در آن M تعداد کل حالت های رفتاری ممکن است، و P(Si∩Aj) احتمال مشترک بودن حیوان در bin I همزمان با سطح فعالیت j (0 یا 1) است. برای ارزیابی اهمیت MIvalue به‌دست‌آمده، 1000 جانشین مخلوط شده با استفاده از جایگشت‌های دایره‌ای تصادفی تولید کردیم. ما جایگشت‌های دایره‌ای را انتخاب کردیم زیرا آنها رابطه زمانی بین فعالیت عصبی و رفتار را حذف می‌کنند، در حالی که همچنان ساختار زمانی عوامل گذرای کلسیم را حفظ می‌کنند و بنابراین منجر به نتایج محافظه‌کارانه‌تر می‌شوند (بر خلاف تصادفی‌سازی کامل هر نقطه داده، که ارزش معنی‌داری نتایج را افزایش می‌دهد). از آنجایی که جانشین های مخلوط شده به طور سیستماتیک به طور معمول توزیع نمی شدند، ما از یک رویکرد ناپارامتریک استفاده کردیم که در آن p-value (pN) مربوط به تعداد نقاط داده از توزیع مخلوط شده است که بیشتر از داده های واقعی برای هر سطل است، تقسیم بر تعداد جایگشت ها52. 73.

برای تعیین مدولاسیون سلول‌ها توسط تحریکات اپتوژنتیک، ما از یک رویکرد مشابه استفاده کردیم اما MI بین فعالیت عصبی و سیگنال‌های تحریک دوتایی را محاسبه کردیم. سپس از همان روش مخلوط کردن دایره‌ای برای استخراج معنی‌داری آماری استفاده شد.

where P(S|A) is the posterior probability distribution of states given neuronal activity. Using only epochs with velocity >5 سانتی‌متر بر ثانیه، یک مجموعه داده آموزشی با استفاده از 90 درصد داده‌ها ایجاد شد. 10 درصد باقی مانده از داده ها برای آزمایش استفاده شد. یک خطای رمزگشایی با استفاده از 50 جایگزین بوت استرپ و مجموعه ای از 160 سلول با استفاده از نقاط داده به طور تصادفی انتخاب شده با جایگزینی محاسبه شد. فرض می شود که هر نورون مستقل از یکدیگر است، که در عمل اینطور نیست و منجر به خطاهای بازسازی بیشتر می شود، اما زمان محاسباتی را کاهش می دهد. احتمال پسین جمعیت از معادله زیر به دست آمد:

ردیابی سلول ها در چند روز نورون‌ها طی چند روز با استفاده از CellReg74 ردیابی شدند: https://github.com/zivlab/CellReg (v1.5.3). به طور خلاصه، ردپای فضایی با استفاده از تراز صلب برای تصحیح چرخش‌ها و ترجمه‌ها تراز شد. پس از تراز کردن، مجموعه‌های نامزد سلول‌ها را در صورتی که حداکثر فاصله آنها بود، همان نورون در نظر گرفتیم<12 µm, and used the modeled spatial correlation threshold (usually in the range 0.6–0.8) to determine the identity of cell pairs across days. Finally, we assessed the stability of the spatial representation using pairwise field correlation (Pearson correlation of tuning curves).

تجزیه و تحلیل الکتروفیزیولوژیک تجزیه و تحلیل داده های الکتروفیزیولوژیکی با استفاده از MATLAB 2020a با استفاده از پردازش سیگنال و جعبه ابزار موجک انجام شد. پیچیدگی موجک برای سیگنال‌های LFP با استفاده از موجک‌های پیچیده مورلت ('cmor1-1.5' در MATLAB) در زمانی که دقت دامنه زمان و فرکانس مورد نیاز بود، اعمال شد. پیچیدگی پنجره متحرک فوریه (پنجره 2 ثانیه در باند تتا، پنجره 5 ثانیه در باند گاما، گام های متحرک 10 میلی ثانیه) زمانی استفاده شد که دقت حوزه فرکانس نسبت به دقت دامنه زمان برتری داشت (به عنوان مثال، فرکانس غالب در هنگام قدم زدن با استفاده از اپتوژنتیک). تجزیه و تحلیل چگالی های طیفی قدرت زمانی انجام شد که موش ها در 5 سانتی متر بر ثانیه یا بالاتر کار می کردند، مگر اینکه توضیح دیگری داده شود.

قدرت نوسان. سیستم عامل به عنوان نسبت چگالی طیفی توان تجمعی در اطراف فرکانس نوسان اوج ± 1 هرتز به توان باند تجمعی در باند تتا (12-4 هرتز) محاسبه شد. این متریک زمانی به عدد 1 تبدیل می شود که تمام چگالی طیفی توان در فرکانس اوج نوسان قرار گیرد (مثلاً 8 هرتز اگر در آن فرکانس تحریک شود).

تشخیص و تجزیه و تحلیل SWRs برای نظارت بر SWR ها، موش ها اجازه داشتند در حین ضبط، آزادانه یک میدان باز را به مدت 10 دقیقه کاوش کنند. تحریکات (درهم یا 8 هرتز) با پارادایم 5 ثانیه روشن، 5 ثانیه خاموش انجام شد. فقط دوره های آرامش آرام برای تجزیه و تحلیل در نظر گرفته شد. برای این منظور، نسبت z-score توان تتا/مثلث را پس از فیلتر کردن برای هر باند فرکانس محاسبه کردیم، تبدیل هیلبرت را انجام دادیم و فقط دوره‌هایی را در نظر گرفتیم که مقدار حاصل زیر 0 بود. برای شناسایی SWR، سیگنال‌های LFP را در 150-250 فیلتر کردیم. باند فرکانسی هرتز و متعاقباً امتیاز z. امواج با استفاده از تابع findpeaks در MATLAB با پارامترهای زیر شناسایی شدند: آستانه=4 sd، minpeakwidth=0 s، minpeakdistance=0.03 ثانیه.

منابع

1. Colgin، LL ریتم های شبکه هیپوکامپ. نات. کشیش نوروسی. 17، 239–249 (2016).

2. Tóth، K.، Freund، TF & Miles، R. مهار سلول های هیپوکامپالپیرامیدال موش صحرایی توسط آوران های GABAergic از سپتوم. J. Physiol.500, 463-474 (1997).

3. Unal, G., Joshi, A., Viney, TJ, Kis, V. & Somogyi, P. اهداف سیناپسی برآمدگی های سپتوم داخلی در هیپوکامپ و قشر خارج هیپوکامپ موش. J. Neurosci. 35,15812–15826 (2015).

4. Simon، AP، Poindessous-Jazat، F.، Dutar، P.، Epelbaum، J. & Bassant، M.-H. خواص شلیک نورون های شناسایی شده از نظر تشریحی در سپتوم داخلی موش های مهار شده بیهوش و بیهوش شده J. Neurosci. 26, 9038–9046 (2006).

5. اسکاتی، اف و همکاران. ویژگی‌های الکتروفیزیولوژیکی متمایز نورون‌های سپتوهیپوکامپ موش‌های صحرایی گلوتاماترژیک، کولینرژیک و گابا: پیامدهای جدید برای ریتمیک هیپوکامپ. جی. فیزیول. 551,927-943 (2003).

6. Manseau, F., Danik, M. & Williams, S. یک شبکه گلوتاماترژیک نورون عملکردی در سپتوم داخلی و ناحیه نوار مورب. جی. فیزیول. 566، 865-884 (2005).

7. آمیلهون، بی و همکاران. نورون‌های بین‌المللی پاروالبومین فعالیت‌های جمعیتی تنظیم هیپوکامپ در فرکانس تتا. نورون 86، 1277-1289 (2015).

8. Etter، G. و همکاران. تحریک گامای اپتوژنتیک اختلالات حافظه را در مدل موش مبتلا به آلزایمر نجات می دهد. نات. اشتراک. 10، 1–11 (2019).

9. زوتشی، آی و همکاران. مدارهای عصبی هیپوکامپ با تولید فرکانس‌های نوسانی شتاب‌دار به سرعت نوری ژنتیکی فرکانس‌های تتا پاسخ می‌دهند. Curr. Biol. 28, 1179–1188.e3 (2018).

10. Bender, F. et al. نوسانات تتا سرعت حرکت را از طریق یک مسیر هیپوکامپ به سپتوم جانبی تنظیم می کند. نات. اشتراک. 6,8521 (2015).

For more information:1950477648nn@gmail.com