بخش 1: اکیناکوزید با هدف قرار دادن گیرنده آندروژن هیپوتالاموس، مقدار اسپرم را در موش ها افزایش می دهد.

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 & Xiaoying Zhang1,2

لطفا برای قسمت 2 اینجا را کلیک کنید

ناباروری مردان یک مشکل عمده بهداشتی است که شیوع تخمینی آن 4.2 درصد از ناباروری مردان در سراسر جهان است. کار اولیه ما این را نشان دادعصاره سیستانچمحافظت در برابر آسیب اسپرم در موش و ایناکیناکوزید(ECH) یکی از اجزای اصلی فعال است. در اینجا ما نقش اساسی ECH را گزارش می‌کنیم، یک محصول طبیعی که الیگوآستنواسپرمی را در موش‌ها معکوس می‌کند یا از آن محافظت می‌کند. ECH توسط HPLC اندازه‌گیری شد، کمیت و کیفیت اسپرم بررسی شد و سطح هورمون‌ها با استفاده از روش رادیو ایمونوسوربنت تعیین شد. ECH سطوح گیرنده آندروژن (AR) و ژن‌های کلیدی مرتبط با استروئید را که توسط وسترن بلات و تجزیه و تحلیل qPCR تعیین شد، کاهش داد. تعامل بین ECH و AR توسط ELISA غیرمستقیم و داکینگ مولکولی ارزیابی شد. نتایج نشان می‌دهد که ECH با AR هیپوتالاموس در پاکت Met-894 و Val{3}} ترکیب می‌شود تا از انتقال AR از سیتوپلاسم به هسته‌های هیپوتالاموس جلوگیری کند. در حالی که بازخورد منفی تنظیم هورمون جنسی مهار شد، بازخورد مثبت برای افزایش ترشح هورمون لوتئینیزه کننده و تستوسترون تحریک شد و متعاقباً مقدار اسپرم را افزایش داد. روی هم رفته، این داده‌ها نشان می‌دهند که ECH فعالیت AR در هیپوتالاموس را برای افزایش مقدار اسپرم و محافظت در برابر الیگوآستنواسپرمی در موش‌ها مسدود می‌کند.

سیستانچ

تولید تستوسترون در سلول های بیضه به شدت توسط محور هیپوتالاموس-هیپوفیز-گناد (HPG) با تشکیل یک حلقه بازخورد هموستاتیک تنظیم می شود. هورمون آزاد کننده گنادوتروپین (GnRH) که توسط هیپوتالاموس ترشح می شود، می تواند ترشح هورمون لوتئینیزه کننده (LH) را از غده هیپوفیز تحریک کند که باعث تحریک بیشتر تولید تستوسترون در سلول های لیدیگ بیضه می شود. تستوسترون توسط یک سری آنزیم های استروئیدی بیوسنتز می شود. به‌عنوان یکی از مسیرهای اصلی، پروتئین تنظیم‌کننده حاد استروئیدی (StAR) می‌تواند کلسترول را از منابع داخل سلولی به داخل میتوکندری منتقل کند، جایی که در معرض آنزیم برش زنجیره جانبی کلسترول (CYP11A1)، 3 -هیدروکسی استروئید دهیدروژناز (HSD3) قرار می‌گیرد. {10}}هیدروکسیلاز (CYP17A1) و 17 -هیدروکسی استروئید دهیدروژناز (HSD 17) که تبدیل کلسترول به تستوسترون را کاتالیز می‌کنند. سپس تستوسترون به طور منفی به عنصر HPG بازخورد می کند تا ترشح LH بیشتر را به روشی وابسته به دوز کاهش دهد.

اثر تستوسترون بر حلقه بازخورد محور HPG با اتصال به گیرنده آندروژن (AR)، که هم در هیپوتالاموس و هم در غده هیپوفیز یافت می شود، رخ می دهد. در موش‌ها، فرسایش AR و حداقل تولید تستوسترون باعث افزایش سطح LH و هورمون محرک فولیکول (FSH) می‌شود که نشان می‌دهد AR در تنظیم حلقه خوراک منفی شرکت می‌کند. مکانیسم ژنومی کلاسیک سیگنال دهی تستوسترون زمانی اتفاق می افتد که تستوسترون به داخل سلول منتشر می شود و به AR متصل می شود. این مجموعه گیرنده لیگاند سپس به هسته منتقل می شود و در آنجا به عناصر پاسخ آندروژن (AREs) در نواحی تنظیمی ژن های پاسخگو به تستوسترون متصل می شود تا جابجایی آنها را تغییر دهد. تستوسترون همچنین مسیر غیرکلاسیک عملکرد هورمون استروئیدی را القا می کند که با رویدادهای سریع مشخص می شود که منجر به فعال شدن آبشارهای سیگنالینگ سیتوزولی می شود که معمولاً توسط فاکتورهای رشد تحریک می شوند. مسیرهای تستوسترون کلاسیک و غیر کلاسیک هر دو به حفظ اسپرم زایی و باروری کمک می کنند. با این حال، عملکرد AR در مسیر کلاسیک مهم تر است زیرا تستوسترون برای افزایش کیفیت اسپرم عمل می کند.

اکیناکوزید(ECH) یکی از اجزای زیست فعال مشتق شده از گونه های گیاهی دارویی اکیناسه است.سیستانچ10. با طیف گسترده ای از فعالیت های دارویی، عصاره های اکیناسه عبارتند از 1 مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی مدرن، دانشکده بیوتکنولوژی و مهندسی مواد غذایی، موسسه فناوری آنیانگ، آنیانگ، هنان، 455000، چین. 2 کالج دامپزشکی، دانشگاه A & F شمال غربی، یانگلینگ، شانشی، 712100، چین. 3بخش علوم زیست پزشکی، کالج دامپزشکی انتاریو، دانشگاه گوئلف، گوئلف، انتاریو، N1G 2W1، کانادا. مکاتبات و درخواست مواد باید به XZ ارسال شود

یکی از محبوب‌ترین مکمل‌های گیاهی در اروپا و آمریکا است که عمدتاً به دلیل خواص آنتی‌اکسیدانی و توانایی آن در پیشگیری از سرماخوردگی است. جالب اینکه،عصاره سیستانچ و ECH به طور سنتی به عنوان یک عامل مقوی برای درمان اختلالات تولید مثل و برای تقویت فعالیت جنسی مردان در طب سنتی چینی استفاده می شود. برخی از محصولات فرابورس ازسیستانچ استخراج به عنوان مکمل های مغذی توسعه یافته است و در بازارهای مواد غذایی بهداشتی چین و برخی دیگر از کشورهای آسیایی (سازمان غذا و داروی چین) محبوبیت پیدا می کند. با این حال، مکانیسم های اساسی عمل ECH نامشخص است.

ناباروری مردان با شیوع 4.2 درصدی ناباروری مردان در سراسر جهان یک مشکل عمده سلامت است. تشخیص ناباروری مردان در حال حاضر بر اساس مطالعه کیفیت اسپرم از جمله تجزیه و تحلیل پارامترهای منی مانند غلظت، تحرک و مورفولوژی اسپرم است. بیسفنول A تقلیدی استروژن (BPA) یک آلاینده محیطی گسترده است که به دلیل تأثیر آن بر باروری مردان در چندین گونه از حیوانات و انسان مورد مطالعه قرار گرفته است. BPA محور هیپوتالاموس-هیپوفیز-گناد را مختل می کند، بیان آنزیم های استروئیدوژن بیضه و سنتز تستوسترون را در نوزادان نر مهار می کند و باعث ایجاد حالت هیپوگنادیسم هیپوگنادوتروپ می شود. در این مطالعه به بررسی اثرات ECH بر کیفیت اسپرم و سطح هورمون می پردازیم. علاوه بر این، BPA به عنوان یک عامل مدل آسیب اسپرم برای مطالعه بیشتر اثر محافظتی ECH در برابر کیفیت ضعیف اسپرم انتخاب شد.

عصاره سیستانچ

نتایج

ECH باعث افزایش مقدار اسپرم می شود. تعداد اسپرم در اپیدیدیم دم، زنده ماندن اسپرم و تحرک اسپرم در جدول 1 ارائه شده است. درمان با 80 میلی گرم بر کیلوگرم ECH و 15 میلی گرم بر کیلوگرم تستوسترون پروپیونات (TP) به طور قابل توجهی تعداد اسپرم اپیدیدیم را افزایش داد. با این حال، تفاوت معنی داری در زنده ماندن و تحرک اسپرم وجود نداشت.

ECH باعث افزایش سطح تستوسترون و LH در سرم، انسفالون به علاوه هیپوفیز و بیضه می شود. درمان ECH به طور مشخص سطوح LH را در سرم، انسفالون به علاوه هیپوفیز و بیضه افزایش داد (شکل 1A). در گروه ECH(H)، سطح LH به طور قابل توجهی 1.{2}}برابر در سرم، 1.4-برابر در انسفالون به علاوه هیپوفیز، و 1.{6}}برابر در بیضه افزایش یافت. تستوسترون به ترتیب 1.5 و 1 برابر در انسفالون به علاوه هیپوفیز و بیضه به ترتیب افزایش یافت، اما در سرم پس از درمان ECH(H) افزایش یافت. پس از درمان TP، سطح تستوسترون به طور قابل توجهی 1.6، 1.8 و 1.{16} برابر در سرم، انسفالون به علاوه هیپوفیز و بیضه افزایش یافت.

ECH بیان ژن آنزیم استروئیدی را افزایش داد. ECH به طور قابل توجهی بیان آنزیم های استروئیدی کلیدی را در بیضه افزایش داد (شکل 1B). سطوح mRNA CYP11A1، CYP17A1، HSD3 1/2 و HSD17 در گروه ECH(H) بیش از 3- برابر افزایش یافت، در حالی که سطوح mRNA ستاره ستاره تفاوت معنی‌داری با تمام تیمارهای ECH نشان نداد. (p > 0.05). TP به طور قابل توجهی بیان CYP11A1، CYP17A1، HSD{15}}/2 و HSD17 را تغییر نداد. این در یک تجزیه و تحلیل نقشه حرارتی جامع از اثر ECH بر بیان آنزیم استروئیدوژن منعکس شده است که نشان می دهد ECH به طور قابل توجهی سطوح mRNA CYP11A1، CYP17A1، HSD3 1/2، و HSD17، و به ویژه HSD{25}}/ را افزایش داد. 2 (شکل 1C).

ECH می تواند از سد خونی مغزی و به میزان کمتری از سد خونی بیضه عبور کند. برای ارزیابی حلقه بازخورد آندروژن در محور HPG، توانایی ECH برای ورود به هیپوتالاموس در یک سری از مطالعات PK مورد ارزیابی قرار گرفت. غلظت ECH در هیپوتالاموس پس از 12 ساعت یکبار مصرف خوراکی 30 mg/kg ECH شناسایی شد و ECH نفوذ قابل توجهی در هیپوتالاموس با میانگین نسبت هیپوتالاموس به پلاسما 33.92 درصد نشان داد (شکل 2A). مقادیر T1/2 به ترتیب 2.61 ± 0.42 ساعت و 1.88 ± 0.22 ساعت در پلاسما و هیپوتالاموس بود (شکل 2B). با این حال، دسترسی بسیار محدود ECH به بیضه با استفاده از HPLC شناسایی شد. غلظت ECH در بیضه 0 بود.083 ug/mL، 0.0.043 ug/mL و 0.028 ug/mL به ترتیب در 0.5 ساعت، 1 ساعت و 1.5 ساعت بعد از رفتار.

ECH انتقال AR هیپوتالاموس به هسته را کاهش می دهد. برای آزمایش اثر ECH بر جابجایی AR، بیان AR در سیتوپلاسم و هسته بیضه و هیپوتالاموس با استفاده از آنالیز وسترن بلات تعیین شد. همانطور که در شکل 3A نشان داده شده است، ECH پروتئین AR را در هسته هیپوتالاموس در مقایسه با گروه کنترل کاهش داد. درمان با انزالوتامید، یک مهارکننده AR، سطوح پروتئین AR را در هسته هیپوتالاموس تا 4 برابر کاهش داد. قابل‌توجه، AR سیتوپلاسمی با تیمار ECH و درمان انزالوتامید نسبت به گروه کنترل بالاتر بود، که نشان می‌دهد ECH انتقال AR را از سیتوپلاسم به هسته در هیپوتالاموس مسدود می‌کند. همانطور که انتظار می رود، ECH انتقال AR را از سیتوپلاسم به هسته در بیضه مهار نمی کند (شکل 3B).

ECH بیان ژن های مرتبط با محور HPG را افزایش داد. ECH به طور قابل توجهی بیان LH، LHR، GnRH 1 و Gnrhr را در استخرهای مخلوط انسفالون به همراه هیپوفیز افزایش داد، با این حال، تفاوت معنی داری در سطوح GnRH 1 پس از درمان TP وجود نداشت. تجزیه و تحلیل نقشه حرارتی نشان می دهد که بیان GnRH 1 و LH در میان ژن های مرتبط با محور HPG بالاترین بود.

شکل 1. اثر ECH بر سطوح LH، تستوسترون و آنزیم های اصلی استروئیدوژن. توجه: (الف) سطح LH در سرم، انسفالون به علاوه هیپوفیز و بیضه (mIU/mL، میانگین ± SD).

سطح T در سرم، انسفالون به علاوه هیپوفیز و بیضه (ng/ml، میانگین ± SD). (ب) بیان آنزیم های استروئیدی اصلی.

(C) خوشه بندی سلسله مراتبی بیان mRNA آنزیم های مختلف استروئیدوژن در بیضه. رنگ های سبز، سبز-قرمز و قرمز نشان دهنده کم،

فراوانی متوسط ​​و زیاد به ترتیب n=7. a,b,c حروف مختلف نشان‌دهنده گروه‌های آماری متفاوت است (p <>

شکل 2. توزیع و پارامترهای فارماکوکینتیک ECH در هیپوتالاموس. نکات: (الف) نسبت هیپوتالاموس به پلاسما (درصد) بر اساس مواجهه پلاسما و هیپوتالاموس با ECH (غلظت) در 0.5 ساعت، 1.{4}} ساعت، 1.5 ساعت، 2 محاسبه شد. {8}} ساعت، 2.5 ساعت، 3.0 ساعت، 6.{14}} ساعت، 9.{16}} ساعت و 12.{18}} ساعت پس از مصرف خوراکی. (B) پارامترهای فارماکوکینتیک (PK) ECH در پلاسما و هیپوتالاموس. T1/2، نیمه عمر. Cmax، اوج غلظت. Vz/F، حجم ظاهری توزیع؛ MRT، میانگین زمان ماند. AUC، ناحیه زیر منحنی غلظت-زمان.

AR هدف ECH است. برای تایید روابط بین ECH و AR، ECH-Ovalbumin (ECH-OVA) با موفقیت سنتز شد (شکل 5A,B). وزن مولکولی ECH-OVA بزرگتر از OVA است، بنابراین نرخ های حرکتی متفاوتی دارند (شکل 5A) و پیک جذب ECH-OVA بین ECH و OVA است (شکل 5B).

عصاره سیستانچ

شکل 3. تأثیر ECH بر انتقال AR در بیضه و هیپوتالاموس. یادداشت: (A) اثر ECH بر انتقال AR در هیپوتالاموس. سطح پروتئین AR با تجزیه و تحلیل وسترن بلات تعیین شد و میله ها نشان دهنده کمیت سنجی AR هسته ای نرمال شده به Lamin B و AR سیتوپلاسمی نرمال شده به GAPDH است. هر مقدار نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار شش آزمایش مستقل است. a,b,c حروف مختلف بالای میله ها نشان دهنده گروه های آماری متفاوت است (p < 0.05);="">B) تاثیر ECH بر انتقال AR در بیضه.

نشان می دهد که ECH با موفقیت به OVA کونژوگه شد. نتایج غیرمستقیم ELISA (شکل 5C)، نشان می‌دهد که آنتی‌بادی ضد AR قادر به تشخیص پروتئین AR موجود در چاهک‌های حاوی ECH-OVA (که با آنتی‌بادی ضد OVA مشخص می‌شود) است که نشان می‌دهد ECH می‌تواند به پروتئین AR متصل شود.

ECH با جیب AR Met-894 و Val-713 ترکیب می‌شود. ترکیب ECH به محل AF2 روی سطح AR انسانی متصل شد و حالت اتصال نظری ECH و AR در شکل 5D نشان داده شده است. ترکیب ECH یک اتصال ترکیبی فشرده را در جیب AR انسانی اتخاذ کرد. دو گروه فنیل ECH در حوزه آبگریز جیب AR متصل می شوند و تماس های نزدیک آبگریز را با باقی مانده های Leu-712، Val{5}}، Met-734، Ile-737 حفظ می کنند. ، Met-894 و Ile-898، در حالی که دو طرف دیگر ECH در ورودی جیب قرار داشتند و فقط چند تماس برقرار می کردند. تجزیه و تحلیل دقیق نشان داد که هر دو Met{10}} (طول پیوند: 2.4 Å) و Val{13}} (طول پیوند: 2.7 Å) پیوندهای هیدروژنی با گروه های هیدروکسی 1 ECH تشکیل دادند که برهمکنش اصلی بین ECH بود. و AR انسانی

ECH آسیب باروری ناشی از BPA را کاهش می دهد. برای بررسی اثر ECH بر آسیب تولید مثل، کیفیت اسپرم و سطح هورمون‌های جنسی و آنزیم‌های استروئیدوژن در موش‌های القا شده با BPA مورد بررسی قرار گرفت. همانطور که در شکل 6 نشان داده شده است، تیمار BPA به طور قابل توجهی تعداد و تحرک اسپرم را به ترتیب 26.5 و 39.2 درصد کاهش داد. تجویز ECH از کاهش تعداد و تحرک اسپرم به ترتیب 35.5 و 30.1 درصد جلوگیری کرد. تجویز BPA همچنین منجر به کاهش قابل توجهی در ترشح LH و T شد و ECH به طور قابل توجهی سطوح LH و T را به ترتیب 24.1 درصد و 18.3 درصد نسبت به درمان BPA به تنهایی افزایش داد (شکل 6A,B). سطوح mRNA ستاره، CYP17A1، 3 -HSD، و 17 -HSD در تیمار BPA-ECH به طور قابل توجهی در مقایسه با تیمار BPA افزایش یافت (شکل 6C،D).

شکل 4. تغییرات در بیان ژن مرتبط با HPA پس از درمان ECH. نکات: نوارهای (A-D) نشان دهنده سطوح mRNA LH، LHr، Gnrh 1 و Gnrhr در انسفالون به علاوه هیپوفیز هستند. a,b,c حروف مختلف بالای نوارها گروه‌های آماری متفاوتی را نشان می‌دهند (p < 0.05).="" (e)="" خوشه="" بندی="" سلسله="" مراتبی="" بیان="" mrna="" آنزیم="" های="" مختلف="" استروئیدوژن.="" رنگ="" های="" سبز،="" سبز-قرمز="" و="" قرمز="" به="" ترتیب="" نشان="" دهنده="" فراوانی="" کم،="" متوسط="" ​​و="" زیاد="" n="7" هستند.="" گروه="" شاهد="" (درمان="" شده="" با="" نرمال="" سالین="" 10="" میلی‌لیتر="" بر="" کیلوگرم)،="" ech(l)="" (درمان="" با="" ech="" 5="" میلی‌گرم="" بر="" کیلوگرم)،="" گروه="" ech(m)="" (تحت="" تیمار="" با="" ech="" 20="" میلی‌گرم="" بر="" کیلوگرم)،="" ech(h)="" (درمان="" شده="" با="" ech="" 80="" mg/kg)،="" tp="" (درمان="" با="" tp="" 15="">