قسمت 1: اثر Acteoside به عنوان یک محافظ سلولی برای تولید یک سگ شبیه سازی شده

Ji Hye Lee1☯، Ju Lan Chun1☯، Keun Jung Kim1، Eun Young Kim1، Dong-hee Kim1، Bo Myeong Lee1، Kil Woo Han1، Kang-Sun Park1، Kyung-Bon Lee2، Min Kyu Kim1*

1 بخش علوم دامی و لبنیات، کالج کشاورزی و علوم زیستی، دانشگاه ملی Chungnam، Daejeon، جمهوری کره،

2 گروه آموزش زیست شناسی، دانشکده آموزش،دانشگاه ملی چونام، گوانگجو، جمهوری کره

مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com

لطفا برای قسمت 2 اینجا را کلیک کنید

خلاصه

انتقال هسته سلول سوماتیک (SCNT) یک روش آزمایشگاهی شناخته شده است. اصل SCNT شامل برنامه ریزی مجدد یک هسته سوماتیک با تزریق یک سلول سوماتیک به تخمک گیرنده است که هسته آن برداشته شده است. بنابراین، سلول های دهنده هسته به عنوان یک فاکتور حیاتی در SCNT در نظر گرفته می شوند. همگام سازی چرخه سلولی سلول های دهنده هسته در مرحله G0/G1 را می توان با مهار تماس یا گرسنگی سرم القا کرد. در این مطالعه،اکتئوزیدیک ترکیب گلیکوزید فنیل پروپانوئید، برای تعیین اینکه آیا برای القای همگام سازی چرخه سلولی، محافظت سلولی، و بهبود کارایی SCNT در فیبروبلاست های جنین سگ قابل استفاده است، مورد بررسی قرار گرفت. فیبروبلاست های اولیه جنین سگ با درمان شدنداکتئوزید(10، 30، 50 میکرومولار) برای دوره های زمانی مختلف (24، 48 و 72 ساعت). همگام سازی چرخه سلولی در مرحله G0/G1 با روش القایی تفاوت معنی داری نداشت:اکتئوزیددرمان، مهار تماس یا گرسنگی سرم. با این حال، از این سه تیمار، گرسنگی سرم منجر به افزایش قابل توجهی سطح گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) (99.5 ± 0.3 درصد) و آپوپتوز شد. نتایج همچنین نشان داد کهاکتئوزیدکاهش ROS و فرآیندهای آپوپتوز از جمله نکروز در فیبروبلاست های جنین سگ، و بهبود بقای سلولی. فیبروبلاست های جنین سگ درمان شده بااکتئوزیددر مرحله G0/G1 با موفقیت دستگیر شدند. علاوه بر این، جنین‌های بازسازی‌شده با استفاده از سلول‌های اهداکننده هسته تیمار شده با آکتئوزید، یک سگ شبیه‌سازی شده سالم تولید کردند، اما جنین‌هایی که با استفاده از سلول‌های اهداکننده هسته در معرض مهار تماس بودند، تولید نشدند. در نتیجه،اکتئوزیدهمگام سازی چرخه سلولی القایی سلول های اهداکننده هسته یک روش جایگزین برای بهبود کارایی SCNT سگ به دلیل اثرات محافظت سلولی آن خواهد بود.

سیستانچ اکتئوزید می تواند ایمنی را تقویت کند

مقدمه

تکنیک SCNT برای تولید حیوانات برتر ژنتیکی یا دستکاری شده برای اهداف کشاورزی و به عنوان منابع زیست پزشکی استفاده شده است. با افزایش نیاز به مدل های حیوانی بیماری، نجات حیوانات در خطر انقراض، سلول های بنیادی برای پزشکی احیا کننده، پیوند اعضا و غیره، علاقه به شبیه سازی حیوانات با استفاده از SCNT در زمان های اخیر افزایش یافته است [1-5]. حتی با وجود اینکه تولید حیوانات شبیه سازی شده موفقیت آمیز بوده است، کارایی SCNT هنوز بسیار پایین است [6]. علل صلاحیت رشد جنین SCNT پایین شامل عوامل زیادی است که به کیفیت تخمک های گیرنده، کیفیت سلول های اهداکننده هسته و وضعیت مادر جایگزین مربوط می شود [7-10].

گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) و آپوپتوز شناخته شده‌اند که در فرآیندهای تولید مثل زنان از جمله رشد تخمک در داخل بدن و در شرایط آزمایشگاهی نقش دارند [11-14]. ROS رشد جنین را با القای تراکم سیتوپلاسمی، آسیب DNA و آپوپتوز در جنین متوقف می کند. مطالعات پشتیبان گزارش کرده اند که کاهش ROS صلاحیت رشد جنین SCNT را در طی کشت آزمایشگاهی بهبود می بخشد [15-17]. آپوپتوز یک فرآیند فیزیولوژیکی است که به طور خود به خود در طول رشد طبیعی جنین قبل از لانه گزینی برای حفظ هموستاز سلولی با حذف سلول های آسیب دیده/نادرست DNA رخ می دهد. ROS باعث تکه تکه شدن DNA و افزایش بلاستومرهای آپوپتوز می شود که رشد جنین را مختل می کند. رویداد ROS و آپوپتوز اغلب بعد از SCNT نسبت به لقاح آزمایشگاهی مشاهده می شود [18، 19]. بسیاری از مطالعات گزارش کردند که توانایی رشد جنین SCNT با کاهش سطوح ROS و آپوپتوز با استفاده از آنتی اکسیدان هایی مانند سلنیوم [20]، انسولین-ترانسفرین-سلنیوم [17، 21]، ملاتونین [22] و گلوتاتیون [23] نجات می یابد.

مطالعات قبلی گزارش کردند که استفاده از سلول‌های اهدایی که در مرحله G{{0}}/G1 متوقف شده‌اند، کارایی SCNT را بهبود می‌بخشد [7، 9، 24-28]. کروماتین موجود در سلول های دهنده در مرحله G0/G1 موثرترین برای صلاحیت رشد جنین SCNT در نظر گرفته شده است. برای همگام سازی چرخه سلولی دهنده، مهار تماس، گرسنگی سرم و درمان های شیمیایی به طور مکرر استفاده شده است [7، 25، 29، 30]. با این حال، گرسنگی سرم بقای سلول را کاهش داده و قطعه قطعه شدن DNA را افزایش می دهد که منجر به آپوپتوز می شود [31]. مهار شیمیایی استراتژی دیگری برای متوقف کردن چرخه سلولی در مرحله G0/G1 با استفاده از مهارکننده‌هایی مانند روسکوویتین [29، 32]، دی متیل سولفوکسید (DMSO) [33] و سیکلوهگزیماید (CHX) [34] است. کارایی روش مورد استفاده برای همگام سازی تحت تأثیر انواع و گونه های سلول های دهنده است. برای همگام سازی بهینه سلول های دهنده، جنبه های مختلف روش های مورد استفاده باید به دقت ارزیابی شوند.

اکتئوزید(همچنین به عنوان ورباسکوزید شناخته می شود) [{{0}}(3، 4-دی هیدروکسی فنیل اتیل)-1-OaL-rhamnopyranosyl-(1/3)-bD-({13} }O-caffeoyl)-glucopyranoside] از گل های بنفش Syringa vulgaris جدا شده است. گیاهان حاوی اکتئوزید دارای فعالیت های ضد میکروبی و ضد قارچی هستند [35-37] و از التهاب جلوگیری می کنند. در واقع، اکتئوزید فعالیت‌های بیولوژیکی مختلفی را در شرایط آزمایشگاهی و درون تنی از خود نشان می‌دهد، مانند فعالیت ضد اکسیداتیو، فعالیت ضد آپوپتوز، سمیت سلولی در برابر سلول‌های مختلف تومور، و هماهنگ‌سازی چرخه سلولی در مرحله G0/G1 به عنوان یک وابسته به سیکلین. مهارکننده کیناز (CDK) [38]. به عنوان مثال لی و همکاران.[38] گزارش شده است که درمان اکتئوزیدی می تواند از تکثیر سلول های لوسمی HL{27}} پرومیلوسیتیک انسانی با القای توقف چرخه سلولی در مرحله G0/G1 جلوگیری کند. با این حال، اثر سلول های اهدایی تحت درمان با آکتئوزید بر کارایی SCNT سگ هنوز مورد مطالعه قرار نگرفته است.

در این مطالعه اثراتاکتئوزیدروی همگام سازی چرخه سلولی، ROS، وآپوپتوزبر روی فیبروبلاست های جنین سگ مورد بررسی قرار گرفت. تجزیه و تحلیل هماهنگ سازی چرخه سلولی، ROS و آپوپتوز با استفاده از مرتب سازی سلولی فعال شده با فلورسانس (FACS) انجام شد. برای نشان دادن کارایی سلول های دهنده تیمار شده با اکتئوزید، جنین های SCNT کشت داده شدند و به یک سگ گیرنده منتقل شدند و با موفقیت یک سگ شبیه سازی شده سالم تولید کردند.

سیستانچمی تواند درمان کندکلیهبیماری بهبود یابدکلیهعملکرد

مواد و روش ها

بیانیه اخلاق

در این مطالعه، از 44 سگ مونگرل ماده (1 تا 6 ساله) به عنوان اهداکننده تخمک و جانشین انتقال جنین و یک بیگل ماده (2 ساله) برای ایجاد رده های سلولی فیبروبلاست جنین استفاده شد. همه آزمایش‌های حیوانی توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات سازمانی (IACUC) دانشگاه ملی چونگنام (شماره تأیید: CNU-00487) تأیید شد و مطابق «راهنمای مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی» منتشر شده توسط IACUC انجام شد. دانشگاه ملی چونگنام سگ ها در داخل خانه در قفس های جداگانه با سیستم کنترل دما و تهویه بزرگ شدند. سگ ها یک بار در روز با یک رژیم غذایی تجاری تغذیه می شدند و به طور آزاد به آنها آب می دادند. در تمام آزمایشات حیوانی، سگها ابتدا با mg/kg 6 کتامین و زایلازین بیهوش شدند و در شرایط بیهوش با ایزوفلوران 2 درصد نگهداری شدند. در پایان جراحی، آنتی بیوتیک ها (پروکائین پنی سیلین G، بنزاتین پنی سیلین G و دی هیدروسترپتومایسین سولفات) برای جلوگیری از هرگونه عفونت تجویز شد. پس از جراحی، سگ ها به قفس های جداگانه با آب شیرین منتقل شدند، تحت نظارت قرار گرفتند و مراقبت های ویژه دامپزشک مسئول انجام شد تا در صورت نیاز حیوانات، درمان های لازم انجام شود.

مواد شیمیایی

تمام مواد شیمیایی از Sigma-Aldrich Chemical Co. (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد، مگر اینکه خلاف آن ذکر شده باشد. Acteoside از Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd. در چین به دست آمد.

جداسازی فیبروبلاست های جنینی سگ

فیبروبلاست های جنینی سگ از جنین های یک روزه به دست آمد. به طور خلاصه، یک بیگل ماده به طور مصنوعی با اسپرم یک بیگل نر لقاح داده شد. پس از 28 روز، بارداری در بیگل ماده تایید شد و 5 جنین با سلیو هیسترکتومی به دست آمد. جنین ها سه بار در سالین بافر فسفات شسته شدند (PBS؛ Gibco، Thermo Fisher Scientific Inc.، Waltham، Massachusetts، ایالات متحده). سر، اندام‌های داخلی و اندام‌های جنین با تیغه جراحی برداشته شد و قسمت‌های باقی‌مانده بدن در PBS خرد شد. تکه های جنین دو بار با سانتریفیوژ در 400 × به مدت 5 دقیقه شسته شدند و در محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM; Gibco) همراه با 1 درصد پنی سیلین-استرپتومایسین (محصول شماره P4458) و 20 درصد سرم جنین گاوی (FBS) کشت داده شدند. در دمای 39 درجه در جو مرطوب 5 درصد CO2 و 95 درصد هوا. هنگامی که سلول‌ها پس از 5 تا 7 روز به محل اتصال رسیدند، با 25/0 درصد تریپسین-EDTA (Gibco) به مدت 2 دقیقه تیمار و برداشت شدند. دو رده سلولی فیبروبلاست جنین سگ از دو جنین منفرد ایجاد شد. سلول ها در 10 درصد DMSO در FBS منجمد شدند و تا زمان استفاده در نیتروژن مایع در درجه {22}} نگهداری شدند.

درمان سلولی

فیبروبلاست‌های سگ منجمد ذوب شده و تا 8{10}} درصد تلاقی کشت داده شدند. سلول ها برای آزمایش های بعدی 4 تا 7 بار برداشت و پاساژ شدند. سلول ها با غلظت 106 در میلی لیتر در ظروف کشت 60 میلی متری کشت شدند. سلول ها در (1) DMEM مکمل با 10 درصد FBS و 1 درصد پنی سیلین-استرپتومایسین به مدت پنج روز (ممانعت از تماس)، (2) DMEM مکمل با 0.5 درصد FBS و 1 درصد پنی سیلین- استرپتومایسین به مدت پنج روز (گرسنگی سرم) کشت داده شدند. ، یا (3) DMEM با 10 درصد FBS و 1 درصد پنی سیلین-استرپتومایسین حاوی اکتئوزید در 10 میکرومولار، 30 میکرومولار یا 50 میکرومولار به مدت 24 ساعت، 48 ساعت و 72 ساعت (درمان اکتئوزید) تکمیل شده است.

تجزیه و تحلیل چرخه سلولی توسط فلوسیتومتری

برای تجزیه و تحلیل مراحل چرخه سلولی، سلول ها با استفاده از {{0}}.25 درصد تریپسین-EDTA برداشت و 3 بار با PBS توسط سانتریفیوژ شسته شدند. پس از آخرین شستشو، مواد رویی دور ریخته شد و سلول ها در 0.3 میلی لیتر PBS مجدداً معلق شدند. برای تثبیت، {{10}}.7 میلی‌لیتر اتانول مطلق سرد به صورت قطره‌ای به سوسپانسیون سلولی اضافه شد، با گرداب ملایم مخلوط شد و یک شب در دمای 4 درجه نگهداری شد. سلول های ثابت سانتریفیوژ شده و دو بار با PBS سرد شسته شدند. سلول ها در 25/0 میلی لیتر PBS با 5 میکرولیتر 10 میلی گرم بر میلی لیتر RNase معلق شدند و به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه شدند. سپس 10 میکرولیتر پروپیدیوم یدید (PI) 1 میلی گرم بر میلی لیتر اضافه شد. چرخه سلولی با کمی سازی محتوای DNA در جمعیت های سلولی در فازهای G0/G1 (2n)، S (بین 2n و 4n) و G2/M (4n) با استفاده از فلوسایتومتر FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) تجزیه و تحلیل شد. ، ایالات متحده آمریکا).

تشخیص ROS با فلوسیتومتری

ROS در سلول‌های زنده با استفاده از کیت تشخیص گونه‌های اکسیژن واکنش‌گر سبز زنده Image-iT (پروب‌های مولکولی، یوجین، OR، ایالات متحده آمریکا) ارزیابی شد. به طور خلاصه، سلول ها پس از حذف محیط کشت در PBS شسته شدند و 2 میلی لیتر از محلول کاری 100 میکرومولار ترت بوتیل هیدروپراکسید (TBHP) اضافه شد. پس از انکوباسیون در دمای 37 درجه به مدت 1 ساعت، محلول کار TBHP برداشته شد و سلول ها به آرامی 3 بار در سالین گرم بافر فسفات Dulbecco (DPBS؛ Gibco) شسته شدند. سپس سلول‌ها در محلول کاری 25 میکرومولار 5-(و{10}})-کربوکسی-2، 7-دی کلرودی هیدروفلورسین دی استات (کربوکسی-H2DCFDA) در دمای 37 درجه به مدت 30 دقیقه در تاریکی انکوبه شدند. . هنگامی که اکسید می شود، کربوکسی-H2DCFDA فلورسانس سبز منتشر می کند، که ارزیابی ROS را با فلوسیتومتری تسهیل می کند. TBHP، که یک القاء کننده تولید ROS است، به عنوان یک کنترل مثبت استفاده شد. هسته سلول‌ها با Hoechst 33342 رنگ‌آمیزی شدند. پس از 3 بار شستشو با PBS، سلول‌ها با تریپسینیزاسیون جمع‌آوری شدند، در PBS تعلیق شدند و با استفاده از فلوسایتومتر FACS Calibur برای تشخیص ROS (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) استفاده شدند. ). سرعت تشکیل ROS با تقسیم تعداد سلول های ROS مثبت بر تعداد کل سلول و تبدیل مقادیر به درصد محاسبه شد.

تجزیه و تحلیل آپوپتوز توسط فلوسیتومتری

تجزیه و تحلیل آپوپتوز با استفاده از کیت سنجش آپوپتوز Vybran1 شماره 2 (پروب مولکولی، یوجین، OR، ایالات متحده آمریکا) انجام شد. به طور خلاصه، سلول ها به روش تریپسینیزه کردن برداشت و 2 بار با PBS سرد شسته شدند. پس از آن، 100 میکرولیتر از بافر اتصال انکسین 1×، 5 میکرولیتر Alexa Fluor 488 annexin V و 1 میکرولیتر PI به سلول ها اضافه شد. پس از انکوباسیون به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق، 400 میکرولیتر از بافر اتصال انکسین 1× اضافه شد و سوسپانسیون سلولی به آرامی مخلوط شد. Annexin V که یک پروتئین متصل به فسفولیپید وابسته به Ca2 به علاوه میل ترکیبی بالایی برای فسفاتیدیل سرین (PS) است. در سلول های زنده، PS روی غشای سیتوپلاسمی داخلی قرار دارد و در سلول های آپوپتوز به غشای سیتوپلاسمی خارجی منتقل می شود. سلول های آپوپتوز توسط Annexin V نشاندار شده با Alexa Fluor 488 متصل به PS در غشای خارجی مشخص می شوند. علاوه بر این، PI، که یک رنگ اتصال به اسید نوکلئیک است، سلول های نکروزه را با فلورسانس قرمز رنگ می کند. بنابراین، سلول‌های آپوپتوز با فلورسانس سبز، سلول‌های نکروزه با فلورسانس قرمز، و سلول‌های زنده با فلورسانس کم یا بدون فلورسانس در سلول‌ها با استفاده از فلوسایتومتر FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) آنالیز شدند. نرخ‌ها با تقسیم تعداد سلول‌های زنده، نکروزه یا آپوپتوز بر تعداد کل سلول و تبدیل مقادیر محاسبه‌شده به درصد محاسبه شد.

مجموعه ای از تخمک های بالغ در داخل بدن

برای تشخیص تخمک گذاری در هر سگ، غلظت سرمی پروژسترون (P4) با استفاده از کیت رادیوایمونواسی با لوله پروژسترون فعال DSL اندازه‌گیری شد (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., TX, USA). همانطور که قبلاً توضیح داده شد [39، 40]، روزی که غلظت P4 از 4 نانوگرم در میلی لیتر فراتر رفت، به عنوان روز تخمک گذاری در نظر گرفته شد. در 72 ساعت پس از تخمک گذاری، تخمک ها با لاپاراتومی با استفاده از روش های جراحی آسپتیک بازیابی شدند. فیمبریای مجرای تخمک از طریق شکاف بورس نزدیک شده و با استفاده از یک سوزن فولادی فلنج دار معکوس (گیج 18، 7.5 سانتی متر) کانوله شد. یک کاتتر 24 گیج داخل وریدی (IV) (Angiocath™ Plus, Becton Dickison Korea Inc., Seoul, Korea) در تنگه لوله رحمی در نزدیکی محل اتصال رحمی قرار داده شد و 199 متوسط ​​(Gibco) با 1 درصد پنی سیلین و استرپتو سین تکمیل شد. 5 درصد FBS از طریق کاتتر IV به داخل لوله رحمی وارد شد. اووسیت ها بلافاصله به آزمایشگاه منتقل شدند. در مجموع 316 تخمک از 31 سگ جمع آوری شد.

انتقال هسته سلول سوماتیک و SCNT انتقال جنین همانطور که قبلاً توضیح داده شد [39] انجام شد. به طور خلاصه، برای حذف سلول‌های کومولوس از تخمک‌های بالغ شده در داخل بدن، کمپلکس‌های کومولوس-اووسیت (COC) به طور مکرر در هیالورونیداز 0.1 درصد پیپت شدند. اولین جسم قطبی و کروموزوم های متافاز II با آسپیراسیون حذف شدند. خروج هسته با رنگ آمیزی با Hoechst 33342 (بیسبنزیمید) تایید شد. فیبروبلاست‌های جنین سگ با 3{9}} میکرومولار آکتئوزید به مدت 48 ساعت تیمار شدند و سپس با 25/25 درصد تریپسین- EDTA برداشت شدند. یک سلول منفرد، که دارای غشای سلولی صاف است، به فضای پری‌ویتلین هر تخمک خارج شده منتقل شد. دوبیتی ها محیط انفوزیون متعادلی بودند که محیط مانیتول 0.26 مولار حاوی 0}.1 میلی مولار HEPES، 0.5 میلی مولار MgSO4 و 0.05 درصد BSA است و توسط دو پالس ذوب شده است. جریان مستقیم (69-75 ولت برای 15 میکروثانیه) از یک دستگاه Electro-Cell Fusion (شرکت ژن NEPA، چیبا، ژاپن). این دوبیتی ها در محیط 199 حاوی 10 درصد FBS به مدت 1 ساعت و 30 دقیقه انکوبه شدند. جنین های SCNT ذوب شده بررسی شدند و با انکوبه کردن آنها در یونوفور کلسیم 10 میکرومولار (محصول شماره C7522، سیگما) به مدت 4 دقیقه، فعال سازی شیمیایی القا شد. جنین های SCNT شسته شدند و سپس در یک محیط مایع لوله رحمی مصنوعی اصلاح شده (mSOF) [41] حاوی 1.9 میلی مولار 6-دی متیل آمینوپورین (6-DMAP) به مدت 3 ساعت و 30 دقیقه قرار گرفتند. جنین های مهندسی شده طی 4 ساعت پس از SCNT به لوله رحمی جانشین های همگام شده با فحلی منتقل شدند. بارداری با سونوگرافی در 26 روز (در اولین زمان) پس از انتقال جنین تایید شد.

ماده فعالاکتئوزیدکه درسیستانچ

کشت آزمایشگاهی جنین های شبیه سازی شده

پس از SCNT، جنین‌های شبیه‌سازی‌شده در 40 میکرولیتر میکرولیتر یک محیط مایع لوله‌ای مصنوعی اصلاح‌شده (mSOF) (10 جنین شبیه‌سازی‌شده در هر میکرو قطره) با روغن معدنی در دمای 38.5 درجه در 5 درصد CO2 و 95 درصد هوا، کشت داده شدند. رشد جنین SCNT از روز 2 تا روز 8 مشاهده شد.

تجزیه و تحلیل ریزماهواره و DNA میتوکندری یک سگ شبیه سازی شده

DNA کل از سلول‌های اهداکننده هسته‌ای، و پوست سگ‌های اهداکننده تخمک، سگ‌های جایگزین و سگ شبیه‌سازی شده توسط کیت استخراج DNA ژنومیک G-spin™ (iNtRON BIOTECHNOLOGY، Seongnam، کره) مطابق دستورالعمل‌های سازنده استخراج شد. و سپس در 1{6}} 0 میکرولیتر بافر TE (10 میلی‌مولار Tris-HCl، 1 میلی‌مولار EDTA، pH 8.0) شسته شد. مقدار DNA توسط طیف سنج BioSpec-nano (Shimadzu Corp.، ژاپن) اندازه گیری شد.

برای تعیین ژنوتیپ ریزماهواره ای، 7 ژن خاص زیر انتخاب شدند: PEZ1، PEZ3، PEZ8، PEZ12، FH2010، FH2054 و FH2079. PCR با دناتوراسیون اولیه به مدت 10 دقیقه در 95 درجه، 20 سیکل شامل دناتوراسیون به مدت 30 ثانیه در 95 درجه، 30 ثانیه بازپخت در 58 درجه ({15}}.1 درجه / چرخه)، 1 دقیقه گسترش در 72 درجه و 15 چرخه دیگر شامل دناتوراسیون به مدت 30 ثانیه در 95 درجه، 30 ثانیه بازپخت در 56 درجه، 1 دقیقه گسترش در 72 درجه و گسترش نهایی در 72 درجه به مدت 10 دقیقه است.

برای تعیین توالی DNA میتوکندری، با استفاده از توالی های نوکلئوتیدی کامل mtDNA سگ (GenBank شماره پیوست: U96639)، آغازگرهای الیگونوکلئوتیدی زیر سنتز شدند: ناحیه سیتوکروم b (L14,252 -L14,631) F: ACTCTCGATTAGTAGTTG; سیتوکروم c اکسیداز زیرواحد II (L7,{41}}54-L7,465) F: ATGGCGTACCCATTTCAACT,R: GGATGGTTTATTTTATTGG; 16S rRNA (L2,033 -L2,472) F: GCAAAGGTAGCATAATCAT,R: AGGACTTTAATCGTTGAAC; منطقه حلقه D (L15,622 - L16,030) F: CATAGGACATATTAACTCAATC,R: AAGTCCAGCTACAAGTTATTTG [42]. چرخه های PCR برای این تجزیه و تحلیل شامل: 95 درجه دناتوراسیون اولیه برای 5 دقیقه، 5 چرخه دناتوراسیون برای 30 ثانیه در 95 درجه، 40 ثانیه بازپخت در 60 درجه ({27}} درجه / چرخه)، 1 دقیقه گسترش در 72 درجه، و 30 چرخه بعدی دناتوراسیون به مدت 30 ثانیه در 95 درجه، 40 ثانیه بازپخت در 55 درجه، 1 دقیقه گسترش در 72 درجه، و گسترش نهایی در 72 درجه به مدت 10 دقیقه. قطعات PCR از آزمایش‌های مختلف با استفاده از آنالیز ژنتیکی ABI Prism 3100 (Applied Biosystems Inc., USA) آنالیز شدند. مونتاژ توالی، ترازهای چندگانه و ترمیم تراز برای مناطق کنترل با نرم افزار BioEdit (v.7.0.5.3) انجام شد.

اکتئوزیدکه درسیستانچمی تواند سیستم ایمنی بدن را تقویت کند