بخش 1: ورباسکوزید از سلول های پانکراس در برابر استرس ER محافظت می کند

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

الساندرا گالی 1، پلاس، پائولا مارسیانی 1، الگرتا مارکو 1، سیلویا گیسلانزونی 1، فدریکو برتوزی 2، رافائلا روسی 3، آلسیا دی جیانکامیلو 3، میکلا کاستانیا 1 و کارلا پرگو 1،*

خلاصه:

شواهد اپیدمیولوژیک قابل توجهی نشان می دهد که رژیم غذایی غنی از پلی فنول ها از ابتلا به دیابت نوع 2 محافظت می کند. گلیکوزید فنیل اتانوئیدورباسکوزید/اکتئوزیدیک ترکیب گیاهی پلی فنولی گسترده، دارای چندین خواص بیولوژیکی از جمله فعالیت های آنتی اکسیدانی قوی، ضد التهابی و محافظت کننده عصبی است. هدف از این تحقیق بررسی اثرات احتمالیورباسکوزیدروی سلول های پانکراس، هدفی که قبلا هرگز آزمایش نشده بود. سلول های موش و انسان با انکوبه شدندورباسکوزید({0}}.8-16 uM) تا پنج روز و ترکیبی از تکنیک‌های بیوشیمیایی و تصویربرداری برای ارزیابی بقای سلولی و عملکرد تحت شرایط القاکننده استرس نرمال یا شبکه آندوپلاسمی (ER) استفاده شد. ما یک اثر محافظتی وابسته به دوز پیدا کردیمورباسکوزیددر برابر استرس اکسیداتیو در سلول های کلونال و انسان. مطالعات مکانیکی نشان داد که پلی‌فنل از سلول‌ها در برابر اختلالات ناشی از استرس ER محافظت می‌کند، فعال‌سازی شبکه آندوپلاسمی آندوپلاسمی کیناز (PERK) پروتئین کیناز را تعدیل می‌کند و باعث تقویت پویایی میتوکندری می‌شود. در نتیجه، افزایش زنده ماندن، عملکرد میتوکندری و محتوای انسولین در این سلول‌ها شناسایی شد. این مطالعات شواهدی را ارائه می دهد کهورباسکوزیدتوانایی سلول‌ها را برای مقابله با استرس ER، که یکی از عوامل مهم اختلال عملکرد و شکست سلولی در شرایط دیابتی است، تقویت می‌کند و از پتانسیل درمانی ورباسکوزید در دیابت پشتیبانی می‌کند.

کلید واژه ها:

ورباسکوزید پلی فنول ها؛ سلول های تولید کننده انسولین؛ دیابت؛ UPR; استرس اکسیداتیو؛ استرس ER; PERK ضد التهاب؛ میتوکندری

1. مقدمه

دیابت یک اختلال مزمن است که صدها میلیون نفر را تحت تاثیر قرار می دهد [1]. علل مختلف دیابت نوع 1 (T1D) و نوع 2 (T2D) را مشخص می کند که هر دو دارای کمبود انسولین هستند [2]. انسولین غلظت گلوکز پلاسما را تنظیم می کند و جذب گلوکز در سلول های ماهیچه ای و چربی را تحریک می کند و متابولیسم گلوکز کبد را تعدیل می کند. در دسترس بودن مواد مغذی، هورمون‌ها و ورودی‌های عصبی ترشح انسولین پانکراس را تنظیم می‌کنند و غلظت گلوکز خون را در محدوده فیزیولوژیکی حفظ می‌کنند [3-5]. بنابراین، اختلال عملکرد سلولی منجر به دیابت می شود که با هیپرگلیسمی ناشتا مشخص می شود.

T2D یک وضعیت پیشرونده است که در آن مقاومت به انسولین و عملکرد نادرست سلول‌ها با هم مرتبط هستند و شواهد اخیر علاقه را به نقش اصلی حیاتی سلول‌ها در وضعیت هیپرگلیسمی افزایش داده است [6،7]. در افراد چاق غیر دیابتی، سلول ها مقاومت به انسولین را با افزایش ترشح هورمون جبران می کنند. با این حال، در برخی از افراد، با بدتر شدن شرایط آنها، انسولینمی کاهش می یابد و سطح گلوکز به هیپرگلیسمی می رسد [8،9].

گلوکز مهمترین تعدیل کننده عملکرد سلول است. تحریک گلوکز بر تنظیم ژن ها و بیان پروتئین های دخیل در بسیاری از عملکردهای سلولی مانند گلیکولیز، سنتز و ترشح انسولین تأثیر می گذارد [10]. ترشح انسولین ناشی از گلوکز به متابولیسم اکسیداتیو برای تولید آدنوزین تری فسفات (ATP) متکی است و سطح پایین گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) از نظر فیزیولوژیکی تولید می‌شود. با این حال، سلول‌ها به خوبی به آنزیم‌های جابجایی مجهز نیستند و این ضعف آن‌ها را در برابر استرس اکسیداتیو بسیار مستعد می‌کند [11،12]. با بالا رفتن استرس اکسیداتیو، تولید انسولین در سلول‌ها کاهش می‌یابد، و سلول‌ها سیتوکین‌هایی تولید می‌کنند که آسیب سلولی را از طریق التهاب و آپوپتوز مشتعل می‌کنند [13]. جالب توجه است، اگرچه کاهش توده سلولی قبلاً به مرگ سلولی نسبت داده شده است، مطالعات اخیر نقش عمده ای را در تمایز زدایی سلولی نشان می دهد [14،15]. مشخص شده است که چندین مرحله به سمت T2D حرکت می کند. توهین‌های متابولیکی و اکسیداتیو باعث استرس شبکه آندوپلاسمی (ER) می‌شوند که منجر به کاهش سنتز و ترشح انسولین می‌شود، فرآیندهای التهابی به دنبال آزادسازی سیتوکین‌ها و از دست دادن سلول‌ها ممکن است از طریق آپوپتوز و تغییر تمایز رخ دهد. این دانش برای ایجاد استراتژی‌های درمانی مناسب اساسی است، زیرا استرس اکسیداتیو و التهاب را می‌توان خنثی کرد، و انعطاف‌پذیری سلول‌های پانکراس امکان بازگرداندن سلول‌های بنیادی به سلول‌ها را فراهم می‌کند، همانطور که در موش ثابت شد [16].

اخیراً، آسیب پذیری سلول ها در برابر استرس اکسیداتیو با موفقیت استفاده از آنتی اکسیدان های غذایی را برای جلوگیری از دیابت تحریک کرده است [17]. در میان جالب ترین مواد غذایی آنتی اکسیدانی، روغن زیتون به دلیل خواص مفید آن از زمان یونان باستان شناخته شده است. روغن زیتون حاوی مقدار زیادی اسیدهای چرب تک غیراشباع (MUFA) و چندین پلی فنل مانند تیروزول، هیدروکسی تیروزول، اولئوروپئین و ورباسکوزید است.

ورباسکوزیدکه به عنوان اکتئوزید نیز شناخته می شود، یک گلیکوزید فنیل اتانوئیدی است که از Olea europea، گیاهان گونه Verbascum و 23 خانواده گیاهی دیگر استخراج می شود [18-20]. همچنین می‌توان آن را از محصولات فرعی روغن زیتون به‌دست آورد (در فاضلاب کارخانه زیتون که از فرآوری میوه زیتون به دست می‌آید غنی شده است) یا با روش‌های مهندسی متابولیک و زیست‌شناسی مصنوعی تولید شود [21].

هنوز هیچ اطلاعاتی در مورد فراهمی زیستی ورباسکوزید در انسان گزارش نشده است. مطالعات انجام‌شده روی موش‌ها، سلول‌های SKBR3 و Caco{1} نشان می‌دهد که ممکن است ورباسکوزید متابولیزه نشده از سد روده عبور کند، در پلاسمای خون گردش کند و اثرات آنتی‌اکسیدانی داشته باشد [20،22،23]. بر خلاف بسیاری از پلی فنل‌های گیاهی، ورباسکوزید عمدتاً از طریق تعدیل رونویسی ژنی انواع آنزیم‌ها و عوامل تنظیم‌کننده، با اثرات آنتی‌اکسیدانی و ضد التهابی روی سلول‌ها عمل می‌کند [24-30].

اگرچه بسیاری از اثرات مفید ورباسکوزید برای سلامت انسان شناخته شده است، اما هیچ اطلاعاتی در مورد اثر آن بر سلول های پانکراس وجود ندارد. از آنجایی که استرس اکسیداتیو و التهاب اساس پاتوژنز T2D هستند، ما بررسی کردیم که آیا درمان ورباسکوزید ممکن است زنده ماندن سلول ها و

عملکرد در شرایط القای استرس ER و ما مکانیسم‌های مولکولی عمل آن را مشخص کردیم. داده‌های ما نشان می‌دهد که ورباسکوزید از استرس اکسیداتیو سلول‌ها و التهاب جلوگیری می‌کند و فعال‌سازی پاسخ پروتئین بازشده را تعدیل می‌کند و پویایی میتوکندری را تقویت می‌کند، بنابراین منجر به افزایش زنده‌مانی سلول و محتوای انسولین می‌شود.

2. مواد و روشها

2.1. کشت سلولی و مواد

سلول‌های tc3 موش (با مهربانی توسط پروفسور Hanahan-Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco, CA [31] ارائه شده است) در محیط RPMI 164{18}} (Euroclone SpA, ECB9{28}} کشت داده شدند. 0، Pero MI، ایتالیا) با 10 درصد (v/v) سرم جنین گوساله غیرفعال شده با حرارت (Euroclone SpA، ECS0180L، Pero MI، ایتالیا)، 1 درصد (v/v) پنی سیلین-استرپتومایسین (EuroClone SpA، ECB3001D، Pero MI، ایتالیا) و 1 درصد (v/v) L-گلوتامین (EuroClone SpA، ECB300D، Pero MI، ایتالیا). جزایر انسانی لانگرهانس در میلان (Niguarda Ca' Granda) از اهداکنندگان چند اندام جسد طبق روشی که توسط Ricordi و همکارانش توضیح داده شد، جدا شدند. [32]؛ آنها در محیط کشت RPMI حاوی 5.5 میلی مول در لیتر گلوکز، 10 درصد سرم جنین گاوی غیرفعال شده با حرارت، 0.7 میلی مولار گلوتامین، 50 واحد در میلی لیتر پنی سیلین و 50 میکروگرم در میلی لیتر استرپتومایسین (EuroClone، SpA، Pero MI، ایتالیا) کشت داده شدند. از 4 آماده سازی مختلف جزایر با خلوص جزایر 10 ± 80 درصد استفاده شد. جداسازی جزایر و مطالعات جزایر توسط کمیته اخلاق بیمارستان Niguarda Ca' Granda در میلان تایید شد (11.12.2009). سلول های tc3 با 0.8، 1.6 و 16 میکرومولار ورباسکوزید (Carbosynth، OV08034، Compton، UK)، اسید کافئیک و هیدروکسی تیروزول (هدیه مهربان پروفسور Dell'Agli، گروه علوم دارویی و زیست مولکولی، Universita degli Studi، Universita degli Studi) تیمار شدند. میلان، ایتالیا) در محیط RPMI کامل به مدت 5 روز، در حالی که جزایر انسانی با 16 میکرومولار ورباسکوزید. سلول های تیمار شده با متانول/اتانول به عنوان شاهد مورد استفاده قرار گرفتند. به منظور القای استرس اکسیداتیو، سلول ها با H2O2 (Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, USA) 500 میکرومولار در محیط کامل RPMI به مدت 20 دقیقه قبل از تجزیه و تحلیل تیمار شدند، در حالی که تیمار با تونیکامایسین 2 ug/mL (T7765, Sigma Aldrich) ) به مدت 7 ساعت برای القای استرس ER انجام شد.

2.2. تشخیص زنده ماندن سلول با تست MTT

سلول ها در 96 پلیت چند چاهی قرار گرفتند و 5 روز پس از تیمار ورباسکوزید با 0.5 میلی گرم در میلی لیتر MTT (3-(4،5-دی متیل تیازول{{7} انکوبه شدند. }yl)-2،5-دی فنیل تترازولیوم بروماید) (Sigma-Aldrich, M5655, St. Louis, MO, USA) به مدت 4 ساعت در اتمسفر مرطوب حاوی 5 درصد CO2 در دمای 37 درجه سانتیگراد. پس از انکوباسیون، سلول ها به آرامی در 100 uL DMSO (Euro-Clone SpA، BK12611S، Pero MI، ایتالیا) معلق شدند و جذب در طول موج 540 نانومتر با دستگاه میکروپلیت خوان (Benchmark, microplate reader, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Bio-Rad, Hercules Laboratories, ایالات متحده آمریکا) [33]. آزمایش ها در سه تکرار انجام شد و داده ها به صورت افزایش برابری نسبت به نمونه های شاهد بیان شد.

2.3. تشخیص مرگ سلولی با فلوسایتومتری

پنج روز پس از انکوباسیون با 16 میکرومولار ورباسکوزید، سلول‌ها با 7 دقیقه انکوباسیون با تریپسین/EDTA جدا شدند، جمع‌آوری و سانتریفیوژ شدند. پلت به آرامی در نمک های کم نمک بافر فسفات معلق شد. سلول ها با تعداد MuseTM و معرف زنده ماندن (Millipore, MCH100102, Burlington MA, USA) طبق پروتکل سازنده رنگ آمیزی شدند و از طریق فلوسیتومتری آنالیز شدند. آزمایش ها در سه تکرار انجام شد و داده ها به عنوان درصد سلول های مرده نسبت به کل بیان شد.

2.4. نسل ROS

ROS داخل سلولی با DCFDA (2/,7/-دی کلروفورسئین دی استات) (Sigma Aldrich, D6883, St. Louis, MO, USA) ارزیابی شد، یک پروب نفوذپذیر غشایی که با اتصال به ROS فلورسنت می شود [34]. سلول‌های tc3 از قبل با 15 میکرومولار DCFDA در بافر کربس-رینگر (125 میلی‌مولار NaCl، 5 میلی‌مولار KCl، 1.2 میلی‌مولار MgSO4، 1.2 میلی‌مولار KH2PO4، 25 میلی‌مولار HEPES-NaOH pH 7.4 و 2 میلی‌مولار CaCl2) بارگذاری شدند.

با 11 میلی مولار گلوکز به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد تکمیل شد. محتوای ROS به مدت 30 دقیقه در شرایط پایه و تنش با یک میکروپلیت خوان (485/528 نانومتر Ex/Em) شناسایی شد (TECAN Infinite⑧ F500، Tecan Group Ltd. Männedorf، سوئیس). مقادیر میانگین و انحراف معیار بر اساس سه آزمایش مستقل انجام شد.

2.5. وسترن بلاتینگ

سلول‌های tc3 جمع‌آوری و در بافر RIPA (15{8}} میلی‌مولار NaCl، 50 میلی‌مولار Tris HCl pH 7.6، 1 میلی‌مولار EDTA، 1 درصد TERGITOLw NP40، 0.5 درصد دئوکسی کولات) اضافه شده با آپروتینین (Sigma Aldrich, A4529, St. Louis, MO, USA)، PMSF (Sigma Aldrich, 10837091001, St. Louis, MO, USA) و مهارکننده های Roche (Sigma Aldrich, 5892953001, St. Louis, MO, USA) به مدت 40 دقیقه در دمای 4 oC. غلظت پروتئین با استفاده از روش برادفورد [35] با استفاده از معرف برادفورد (Sigma Aldrich, B6916, St. Louis, MO, USA) تعیین شد، 30 میکروگرم پروتئین با 10 درصد SDS-PAGE تجزیه و بر روی غشاهای نیتروسلولزی (میلیپور، برلینگتون) منتقل شد. MA، ایالات متحده). آنتی بادی های اولیه به مدت 2 ساعت در بافر مسدود کننده با 5 درصد شیر بدون چربی یا محلول های 5 درصد BSA استفاده شد. آنتی‌بادی‌های اولیه زیر مورد استفاده قرار گرفت: ضد اکتین موش (Novus International Inc., NB600501, St. Louis, MO, USA), ضد آکرولئین موش (Abcam, ab48501, Cambridge, UK), موش anti-BIP (هدیه مهربان پروفسور Borgese Nica، موسسه علوم اعصاب، CNR، میلان، ایتالیا)، ضد HNE خرگوش (-diagnostic International Inc., HNE11S, San Antonio, TX, USA)، موش anti-HSP70 (Enzo Life Sciences Inc. ., C92F3A-5, Farmingdale, NY, USA), rabbit anti-phospho-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), موس ضد IKB (Cell Signaling Technology Inc. ., 4814, Danvers, MA, USA), خرگوش ضد فسفو-NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), خرگوش anti-NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc., 8242, Danvers MA, USA, sheep anti-SOD1 (Merck, KGaA, Darmstadt, Germania), rabbit anti-PERK (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, USA), خرگوش anti-eIF2 (Cell Signaling Technology) Inc., 5324, Danvers, MA, USA) و ضد P-eIF2 خرگوش (Ser) 51) (Cell Signaling Technology Inc., 3597, Danvers, MA, USA). آنتی بادی های ثانویه HRP کونژوگه (Dako Agilent، Santa Clara، CA، USA) در رقت 1:5000 استفاده شد. پروتئین ها با استفاده از سیستم تشخیص ECL (Euro-Clone SpA، Pero MI، ایتالیا) با استفاده از سیستم تصویر Odyssey Fc (LI-COR Biotechnology GmbH، Bad Homburg، آلمان) شناسایی شدند و چگالی باند توسط نرم افزار Image Studiow Lite (LI) اندازه گیری شد. -COR Biosciences، لینکلن، NE، ایالات متحده آمریکا) [36]. آزمایش ها در سه تکرار انجام شد و داده ها به صورت افزایش برابری نسبت به نمونه های شاهد بیان شد.

2.6. پتانسیل غشای میتوکندری

سلول‌های tc3 و جزایر انسانی لانگرهانس با 100 نانومولار MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milan, Italy) یا 100 uM MitoSpyw Green FM (BioLegend, 424805, Italy, 424805) انکوبه شدند. oC; شدت فلورسانس با میکروپلیت خوان TECAN Infinite⑧ F500 شناسایی شد (551/576 نانومتر Ex/Em برای MitoSpyw Orange CMTMRos؛ 490/516 نانومتر Ex/Em برای MitoSpyw Greenland,50wän,TeCAN,TeCAN,TeCAN,TeCAN,TeCAN,TeCAN,TeCAN,TeCAN,TeCAN,TeCAN,TeCAN,TeCAN,TeCAN,TeCAN,TeCan,TeCan,TeCAN,Ex/Em برای MitoSpyw Orange CMTMRos. سلول ها با 500 میکرومولار H2O2 به مدت 20 دقیقه انکوبه شدند و شدت فلورسانس همانطور که قبلا توضیح داده شد شناسایی شد. مقادیر میانگین و انحراف معیار بر اساس سه آزمایش مختلف انجام شد.

2.7. مورفولوژی و دینامیک میتوکندری

سلول های tc3 با 100 نانومولار MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milan, Italy) در بافر گلوکز 11 میلی مولار کربس-رینگر در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه از قبل بارگذاری شدند. نمونه ها در یک محفظه تصویربرداری قرار گرفتند و میدان های تصادفی با استفاده از فیلتر رودان میکروسکوپ Axio Observer Z1 (Zeiss، Oberkochen آلمان) تصویربرداری شدند. برای ارزیابی مورفولوژی میتوکندری، پارامترهای زیر با استفاده از نرم افزار تحلیلگر ذرات ImageJ مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت: مساحت (um2)، دایره (4mArea2/Perimeter2) و حداکثر قطر Feret (um) [37].

برای آزمایش های تایم لپس، تصویربرداری تک سلولی با سرعت 1 فریم در ثانیه به مدت 30 ثانیه تحت شرایط کنترل یا استرس اکسیداتیو انجام شد. برای اندازه گیری فاصله تجمعی میتوکندری (um2)، ابتدا تصاویر برای سفید شدن عکس تصحیح شدند، سپس فیلم ها با استفاده از یک افزونه Image-Pro Plus موجود (ردیابی اشیا) (Media Cybernetics، Rockville، MD، ایالات متحده آمریکا) آنالیز شدند. تا دوازده

سلول ها در سه آزمایش مستقل تصویربرداری شدند و داده ها به عنوان مقادیر میانگین و انحراف معیار ارائه شد.

2.8. ترشح انسولین

جزایر لانگرهانس جدا شده انسانی در 96-صفحه چاهک با تراکم 20 جزیره در هر چاهک کاشته شدند و پس از 5 روز درمان، میزان و ترشح انسولین در پایه (3.3 میلی مولار گلوکز) اندازه‌گیری شد و (16.7 میلی‌مولار گلوکز) تحریک شد. ) شرایط با استفاده از روش ایمونواسی ELISA (Mercodia، 10-1113-01، Uppsala، سوئد).

2.9. تحلیل های آماری

تمام آنالیزهای آماری با GraphPad Prism 8.{1}} روی تکرارهای بیولوژیکی مستقل انجام شد. میانگین بین دو گروه با استفاده از آزمون t-test Student دو طرفه ارزیابی شد و p-value <{5}}.05 به="" عنوان="" شواهدی="" از="" معنادار="" بودن="" آماری="" در="" نظر="" گرفته="" شد.="" میانگین="" بین="" سه="" یا="" چند="" گروه="" با="" استفاده="" از="" آنالیز="" واریانس="" (anova)="" و="" به="" دنبال="" آن="" آزمون="" مقایسه="" چندگانه="" تعقیبی="" (tukey)="" مقایسه="" شد.="" آزمون="" آماری="" مورد="" استفاده،="" مقادیر="" دقیق="" p="" و="" تعداد="" کپی="" (n)="" در="" افسانه="" های="" شکل="" جداگانه="" نشان="" داده="" شده="" است.="" نوارهای="" خطا="" در="" شکل="" ها="" میانگین="" ±="" sd="" یا="" میانگین="" ±="" se="" را="" همانطور="" که="" نشان="" داده="" شده="" است="" نشان="" می="">

3. نتایج

3.1. ورباسکوزید زنده ماندن سلول ها را بهبود می بخشد

از آنجایی که هیچ داده ای در مورد اثر ورباسکوزید بر روی سلول ها وجود نداشت، آزمایش MTT را برای ارزیابی زنده ماندن سلول انجام دادیم و همانطور که در شکل 1A نشان داده شده است، یک روند وابسته به دوز مثبت مشاهده شد. از این رو، برای مطالعات بیشتر، غلظت 16 میکرومولار را انتخاب کردیم که از نظر آماری برای افزایش زنده‌مانی سلول‌ها مؤثر بود. با فلوسیتومتری تأثیر 5 روز انکوباسیون ورباسکوزید بر بقای سلول در شرایط پایه و بعد از 2 مورد مطالعه قرار گرفتیم{21} } دقیقه پیش تیمار با 500 میکرومولار H2O2. در شرایط پایه، ورباسکوزید بر بقای سلول تأثیری نداشت، نشان می دهد که افزایش زنده ماندن سلولی مشاهده شده در سنجش MTT ممکن است به دلیل بهبود فعالیت میتوکندری باشد. در حالی که، پس از قرار گرفتن در معرض H2O2، 16 میکرومولار پیش تیمار ورباسکوزید به طور قابل توجهی مرگ سلولی ناشی از استرس اکسیداتیو را کاهش داد (شکل 1B,C). برای آزمایش اینکه آیا متابولیت های ورباسکوزید می توانند مسئول اثر محافظتی مشاهده شده باشند، سلول های tc3 با هیدروکسی تیروزول و اسیدهای کافئیک (0.8 و 16 میکرومولار) به مدت 5 روز تحت درمان قرار گرفتند. هر دو متابولیت زنده ماندن سلولی را افزایش ندادند، برعکس، یک اثر سیتوتوکسیک، مرتبط تر پس از قرار گرفتن در معرض H2O2، برای غلظت 16 میکرومولار تشخیص داده شد (شکل S1). این یافته ثابت می‌کند که ورباسکوزید و نه متابولیت‌های آن اثر محافظتی بر درمان H2O2 دارند.

3.2. Verbascoside هوموستاز ردوکس را تعدیل می کند و اثر ضد التهابی در سلول ها اعمال می کند.

ما ابتدا در سلول های tc3 اثرات ضد التهابی و آنتی اکسیدانی ورباسکوزید مشاهده شده در سایر انواع سلول را تایید کردیم [24،29،34]. فعالیت مهاری ROS ورباسکوزید با سلول‌های tc3 نشان‌دار شده با پروب نفوذپذیر سلولی خاص DCFDA (2/،7/-دی کلروفورسئین دی‌استات) ارزیابی شد. همانطور که در شکل 2A نشان داده شده است، کاهش قابل توجهی از محتوای ROS پس از پیش تیمار ورباسکوزید، هم در شرایط تنش پایه و هم در شرایط استرس اکسیداتیو، مشاهده شد.

تجزیه و تحلیل‌های وسترن بلات کاهش قابل‌توجه نشانگرهای استرس اکسیداتیو آکرولئین و بیان {{0}هیدروکسی‌نوننال (HNE) را در سلول‌های تیمار شده با ورباسکوزید نشان داد. علاوه بر این، ما افزایش بیان سوپراکسید دیسموتاز (SOD1) را یافتیم، که نشان می‌دهد ورباسکوزید فعالیت آنتی‌اکسیدانی خود را احتمالاً با دو مکانیسم مختلف، مستقیماً به عنوان یک جاذب ROS و به‌طور غیرمستقیم با القای بیان آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی اعمال می‌کند (شکل 2B،C).

اثر ضد التهابی ورباسکوزید روی سلول‌ها با ارزیابی فعال‌سازی مسیر NFKB، مهم‌ترین مسیر پیش‌التهاب در این سلول‌ها، ارزیابی شد [38]. با تجزیه و تحلیل وسترن بلات، بیان کاهش یافته بازدارنده فاکتور هسته ای کاپا B (IKB) و فاکتور هسته ای کاپا-زنجیره سبک-افزایش دهنده (NFKB) و کاهش قابل توجه فسفوریلاسیون NFKB در سلول های از قبل تیمار شده را یافتیم که این فرضیه را تأیید می کند. اثربخشی ورباسکوزید برای کاهش التهاب سلولی (شکل 2D,E).

3.3. Verbascoside پاسخ پروتئین باز سلول ها را تعدیل می کند

سپس مکانیسم مولکولی را که توسط آن ورباسکوزید نقش های آنتی اکسیدانی و ضد التهابی را اعمال می کند، با تمرکز بر شبکه آندوپلاسمی که به عنوان یک حسگر کلیدی سیگنال های متابولیک و استرس در سلول ها ظاهر می شود، تجزیه و تحلیل کردیم. تحت شرایط استرس، اندامک یک پاسخ هموستاتیک، معروف به پاسخ پروتئین بازشده (UPR)، با هدف بازیابی عملکرد ER ایجاد می کند. با این حال، فعال شدن بیش از حد این مسیر منجر به آپوپتوز می شود [39،40].

نشانگرهای افزایش استرس ER عبارتند از تنظیم دگرگونی پروتئین های چاپرون و فعال شدن پاسخ UPR. تجزیه و تحلیل وسترن بلات سلول های تیمار شده با ورباسکوزید، کاهش سطوح دو چپرونین پروتئین شوک حرارتی 70 (HSP70) و پروتئین ایمونوگلوبولین اتصال (BIP) را نشان داد (شکل 3A,B). علاوه بر این، کاهش قابل توجهی از بیان ER کیناز شبه پروتئین کیناز (PERK) و کاهش فسفوریلاسیون اکتور پایین دست آن، فاکتور شروع ترجمه یوکاریوتی 2 (eIF2)، شناسایی شد.

برای قسمت 2 اینجا را کلیک کنید