توبولوزید B از سیستانچ سالسا سلول های عصبی PC12 را از آپوپتوز و استرس اکسیداتیو ناشی از 1-متیل-4-فنیل پیریدینیم یونی نجات می دهد.

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

Guoqing Zheng، Xiaoping Pu، Li Lei، Pengfei Tu، Changling Li

خلاصه:

محافظ عصبیاثرات توبولوزید B از سیستانچیکی از فنیل اتانوئیدهای جدا شده از چینی هاداروی گیاهی سیستانچ سالساروی آپوپتوز و استرس اکسیداتیو ناشی از 1-متیل-4-فنیل پیریدینیم یون (MPP plus) در سلول‌های عصبی PC12 مورد بررسی قرار گرفت. سلول‌های PC12 تیمار شده با MPP - با استفاده از روش MTF، فلوسیتومتری و الکتروفورز ژل DNA آگارز، تحت مرگ آپوپتوز قرار گرفتند. تجمع درون سلولی گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) با رنگ‌آمیزی DCFH-DA با میکروسکوپ کانفوکال اسکن لیزری (LSCM) اندازه‌گیری شد. درمان همزمان با توهولوزید B به طور قابل توجهی سمیت سلولی ناشی از MPP، قطعه قطعه شدن DNA و تجمع درون سلولی ROS را کاهش داد. این نتایج به شدت نشان می دهد که توبولوزید B از آپوپتوز و استرس اکسیداتیو ناشی از MPP جلوگیری می کند. توبولوزید B ممکن است به عنوان یک استفاده شودضد بیماری پارکینسونعوامل

مقدمه

از نظر پاتولوژیک، بیماری پارکینسون پراکنده (PD) معمولاً با از دست دادن نورون‌های کاتکول آمینرژیک، به‌ویژه نورون‌های دوپامینرژیک جسم سیاه پارس فشرده (SNc) و وجود نورون درونی مشخص می‌شود. ادخال هایی به نام اجسام لوی در مناطق آسیب دیده مغز. با وجود عوامل مختلفی که در پاتوژنز PD دخیل بوده اند، مکانیسم های دخیل در شروع و پیشرفت PD نامشخص است، حتی اگر علت PD پاسخ داده شده باشد، چندین خط شواهد قویاً دخالت استرس اکسیداتیو را نشان می دهد که در نهایت منجر به این می شود. به مرگ نورونی یا آپوپتوز توسط تولید بیش از حد رادیکال های آزاد [1]، [2]، [3]. این واقعیت که سیستم دوپامینرژیک نیگرال می تواند سطوح بالایی از رادیکال های آزاد تولید کند و دارای سطوح نسبتاً پایینی از سیستم دفاعی آنتی اکسیدانی است، این فرضیه را تأیید می کند. هم مطالعات in vivo و هم in vitro سمیت عصبی ناشی از استرس اکسیداتیو MPP را نشان دادند، یک متابولیت فعال L-methyl-4-phenyl-l,2,3,{9}}tetrahydropyridine (MPTP) بر روی نورون های دوپامینرژیک [4]. ]، [5]. دخالت رادیکال‌های آزاد که بیش از حد توسط استرس اکسیداتیو تولید می‌شوند، به عنوان علت اصلی اختلالات عصبی مانند PD، نقش محوری آنتی اکسیدان‌ها را نشان می‌دهد. توبولوزید B (شکل 1) یکی از ترکیبات فنیل اتانوئیدی جدا شده از ساقهسالسا سیستانچ. مطالعات قبلی نشان داده بود که بسیاری از فنیل اتانوئیدها از جمله توبولوزید B فعالیت قوی در مهار رادیکال های آزاد را نشان می دهند[6]، [7].

با توجه به این یافته‌ها، ما در مطالعه حاضر اثر tubu]nside B را بر سمیت عصبی ناشی از MPP به علاوه در شرایط آزمایشگاهی، با استفاده از خط سلولی فئوکروموسیتوم عصب سمپاتیک PC12 که طی سال‌ها با موفقیت برای مطالعه عملکرد عصبی مورد استفاده قرار گرفته است، بررسی کردیم [8]. [9].

ضد بیماری پارکینسون:سیستانچ

مواد و روش ها

مواد

توبولوزید B ازسالسا سیستانچبا مهربانی توسط دکتر لی لی (بخش محصولات طبیعی، دانشکده علوم دارویی، دانشگاه پکن، پکن، چین) ارائه شد. خلوص ترکیب با آنالیز HPLC بیش از 98 درصد بود. محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM)، سرم اسب، و سرم جنین گوساله از GIBCO BRL، 1-یون متیل-فنیل پیریدینیم (MPP plus)، پلی-ال-لیزین، 3-(4، 5 -دی متیل تیازول-2 -یل)-2،5- دی فنیل تترازولیوم بروماید (MTT)، پروپیدیوم یدید (PI)، RNase A، پروتئیناز K، و 2;7'-دی کلروفلورسین دی استات (DCFH-DA) از سیگما خریداری شد.

کشت سلولی

سلول‌های PCI2 در DMEM حاوی 1{10}} درصد سرم اسب، 5 درصد سرم جنین گوساله، 100 واحد بر میلی‌لیتر پنی‌سیلین و 100 میکروگرم در میلی‌لیتر استرپتومایسین نگهداری شدند. سلول ها در انکوباتور مرطوب شده با هوادهی 95 درصد هوا و 5 درصد CO2 در دمای 37 درجه کشت داده شدند. تمام آزمایش‌ها 24-48 ساعت پس از کاشت سلول‌ها انجام شد. هنگامی که سلول ها به مرحله subconfluent نزدیک شدند، سلول ها به طور معمول با تریپسینیزاسیون 0.25 درصد برداشت شدند و در فلاسک های کشت 25 سانتی متری تقسیم شدند.

تجزیه و تحلیل زنده ماندن سلول

زنده ماندن سلول با استفاده از روش اصلاح شده MTT همانطور که قبلاً توضیح داده شد تعیین شد، به طور خلاصه، سلول‌های PC12 در صفحات چاهی با تراکم I × 104 سقف در هر چاهک کاشته شدند. کشت ها به مدت 48 ساعت رشد کردند و سپس محیط به محیطی که حاوی غلظت های مختلف توبولنساید B یا MPP بود تغییر یافت. پس از انکوباسیون تا 48 ساعت و 72 ساعت، محلول MTr (5 میلی گرم در میلی لیتر در DMEM) به صفحات چاهک اضافه شد و سلول ها به مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه شدند. پس از حذف محیط، بلورهای سلول و رنگ با افزودن 200 میکرولیتر DMSO حل شدند و جذب در طول موج 570 نانومتر (540 نانومتر به عنوان مرجع) با دستگاه میکروپلیت خوان مدل 550 (Bio-Rad) اندازه گیری شد. زنده ماندن سلولی نیز با استفاده از روش حذف تریپان بلو مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. سلول ها جمع آوری شدند، به آرامی پلت شدند و با محلول 6/0 درصد تریپان بلو برای 3 بار رنگ آمیزی شدند. درصد سلول های غیر رنگی متعاقباً در ده میدان میکروسکوپی به طور تصادفی انتخاب شد. به عنوان یک داروی مثبت، از 100 نانوگرم در میلی لیتر فاکتور رشد اپیدرمی (EGF) استفاده شد.

تشخیص آپوپتوز با فلوسیتومتری

سلول های آپوپتوز توسط فلوسیتومتری با استفاده از پروپیدیوم یدید (PI) شناسایی شدند [11]. به طور خلاصه، حدود 1 × 106 سلول انکوبه شده با مواد آزمایشی توسط سانتریفیوژ برداشت و یک بار با PBS شسته شد. سلول ها با اتانول 7 درصد به مدت 24 ساعت در - 20 درجه تثبیت شدند و یک بار با PBS شسته شدند. سپس سلول ها در 300 میکرولیتر PBS حاوی 0.5 میلی گرم در میلی لیتر RNase و 0.5 میلی گرم در میلی لیتر PI معلق شدند. پس از انکوباسیون بیشتر به مدت 30 دقیقه در تاریکی، فلوسیتومتری با FACScan (Becton Dickinson، هایدلبرگ، آلمان) انجام شد.

ما از پروتکل مور [12] استفاده کردیم که تنها DNA تکه تکه شده را جدا کرد و آزمایش ها با استفاده از تعداد مساوی کشت از هر گروه آزمایش عادی شدند. به طور خلاصه، 3 × 1{20}}6 نورون از هر یک از نمونه های تیمار شده در محلول نمک متعادل هنک (1{14}} گرم به مدت 10 دقیقه) شسته شدند و گلوله های تشکیل شده در پایین لوله همگن شدند. با 1 میلی‌لیتر بافر لیز (10 میلی‌مولار Tris در pH 7.4. 5 میلی‌مولار EDTA، 1 درصد Triton X{11}}) به مدت 20 دقیقه روی یخ. پس از سانتریفیوژ در 11، {25}} گرم برای 20 بارندگی در 4 درجه، سوپرناتانت حاوی DNA تکه تکه شده خارج شد و با 20 میلی گرم در میلی لیتر RNase A در دمای 37 درجه به مدت 1 ساعت و 0.1 میلی گرم در میلی لیتر پروتئیناز K در دمای 56 درجه هضم شد. برای 1 ساعت اضافی DNA تکه تکه شده با استفاده از فنل و کلروفرم استخراج شد و در دمای 1O،{33}} گرم برای 1 بارندگی در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. حداقل به مدت 1 ساعت در{30}} درجه قرار داده می شود تا DNA رسوب کند. پس از سانتریفیوژ در 15، گرم به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه، مواد رویی خارج شدند و گلوله های DNA یک بار با اتانول 80 درصد شسته شدند (15000 گرم برای 15 دقیقه در 4 درجه)، در هوا خشک شدند و در 20 میکرولیتر TE حل شدند. بافر در pH 7.6. سپس کل نمونه بر روی ژل آگارز 1.5 درصد به مدت 1 ساعت با ولتاژ 85 ولت الکتروفورز شد. ژل مورد بررسی قرار گرفت و توسط یک سیستم مستندات ژل محصولات فرابنفش (GELDOC{49}}، Bio-Rad، ایالات متحده آمریکا) مورد بررسی و عکسبرداری قرار گرفت.

اندازه گیری برای تشکیل ROS داخل سلولی

تشکیل پراکسیدهای درون سلولی با یک میکروسکوپ لیزری اسکن کانفوکال با استفاده از یک ترکیب غیر فلورسنت، 2"7"-دی کلروفلورسئین دی استات (DCFH-DA) [13] که در داخل سلول ها توسط استرازهای درون زا به اسید آزاد یونیزه شده استری می شود، تشخیص داده شد. ;7"-dichlorofluorescein. 2"،7-Dichlorofiuorescin می‌تواند توسط هیدروآنتی اکسیدان‌ها به فلورسنت 2"7"-dichlorofluorescein (DCF) اکسید شود. سلول ها با 10 میکرومولار DCFH-DA به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه انکوبه شدند. کشت ها دو بار با محلول نمک متعادل هنک شسته و در همان محیط تصویربرداری شدند. تصویربرداری با استفاده از میکروسکوپ لیزری اسکن کانفوکال انجام شد، DCF در 488 نانومتر برانگیخته شد و فیلتر انتشار یک فیلتر مانع 510 نانومتری بود، برای ارائه یک مقایسه معتبر، از پارامترهای اکتسابی یکسان برای همه مشاهدات استفاده شد. موقعیت عمودی بهینه در وسط سلول ها تنظیم شد و سپس میدان به سرعت اسکن شد. از آنجا که روشنایی در طول موج تحریک 488 نانومتر باعث افزایش فلورسانس به دلیل اکسیداسیون این رنگ شد، هر میدان دقیقاً برای مدت یکسان در معرض نور قرار گرفت. مقادیر پایه از سلول های تحریک نشده به عنوان مقادیر کنترل برای مقایسه با سلول های تیمار شده با MPP در حضور یا عدم حضور توبولوزید B استفاده شد. پس از اسکن، میانگین شدت فلورسانس نسبی در 15-20 اجسام سلول عصبی در هر میدان میکروسکوپ در چهار میدان اندازه گیری شد. کشت های جداگانه در هر شرایط درمانی

سیستانچ

تحلیل آماری

تمام مقادیر به دست آمده به عنوان میانگین ± انحراف معیار بیان شد. معنی‌داری تفاوت‌های بین گروه‌ها با استفاده از آزمون t-test تعیین شد. مقادیر p محاسبه شده کمتر از 05/0 0 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد.

نتایج

همانطور که در شکل 2 نشان داده شده است، MPP plus باعث کاهش وابسته به دوز در زنده ماندن سلول های PCI2 شد. در مقابل، EGF، یک فاکتور نوروتروفیک معروف، محافظت قابل‌توجهی از زنده‌مانی سلولی در 100ng/mL MPP ایجاد کرد. اثرات سیتوتوکسیک ناشی از MPP نیز در حضور توبولوزید B کاهش یافت (5، 10، 50 یا 100 میکروگرم در میلی‌لیتر{11}} ، اگرچه با قدرت کمتر از داروی مرجع (شکل 3). توبولوزید B در این غلظت‌ها اثرات محافظتی سلولی را به روشی وابسته به دوز نشان می‌دهد و این ترکیب به تنهایی هیچ سمیت سلولی آشکاری ایجاد نمی‌کند (داده‌ها نشان داده نشده است). الکتروفورز ژل عصاره DNA از سلول های PCI 2 تیمار شده با 200 میکرومولار MPP پلاس به مدت 48 ساعت، نردبان DNA را نشان داد. یک نشانه کلاسیک آپوپتوز، توبولوزید B، در دوزهای 10 و 100μg·ml{19} باعث ایجاد نردبان DNA می‌شود (شکل 4). در حضور یا عدم حضور توبولوزید B. کمیت‌سازی پروفایل چرخه سلولی با PI تعداد سقف‌هایی با ویژگی‌های ساب دیپلوئیدی (منطقه M1) را نشان داد که نشان‌دهنده تکه تکه شدن DNA آپوپتوز است. در سلول‌های تیمار نشده، کسر ساب دیپلوئید آپوپتوز تا 5 تا 94 درصد از کل 10000 سلول حداقل بود (شکل 5 A). پس از 48 ساعت قرار گرفتن در معرض MPP، درصد آپوپتوز به 43.02;j; (شکل 5 B) افزایش یافت. هنگامی که به کشت سلولی اضافه شد، توبولوزید B آپوپتوز ناشی از MPP را به روشی وابسته به دوز مهار کرد. در غلظت 10 ug·ml{34} حفاظت توسط توبولوزید B از نظر آماری معنی‌دار نبود، اما در 50 و 1 00ug·ml{37}}، به ترتیب 45 و 63 درصد کاهش یافت. مشاهده شد که منجر به افزایش درصد سلول های زنده ماندن شد (شکل 5D, E).

تجمع ROS داخل سلولی را می توان با استفاده از سلول های DCFH-DA (PC12) که با 200 میکرومولار MPP تیمار شده بودند به مدت 48 ساعت تشخیص داد که پس از رنگ آمیزی با رنگ DCFH-DA، فلورسانس شدیدی را در داخل سلول نشان می دهد (شکل 6). درمان همزمان با توبولوزید B (در دوزهای 10 و 100 میکروگرم در میلی‌لیتر) MPP را مهار کرد و باعث تولید ROS شد (درصد کاهش یافته به ترتیب 24، 52، و 55، 63 درصد بود).

بحث

پاتوژنز PD شامل استرس اکسیداتیو قوی، کاهش سطح آنتی اکسیدان و نقص میتوکندری است. همه آنها برای القای آپوپتوز در چندین سیستم سلولی شناخته شده اند. به طور خاص، رادیکال های آزاد نشان داده شده است که باعث مرگ سلولی فعال در نورون ها می شوند [14]. MPTP یک سندرم شبیه پارکینسون غیر قابل برگشت و شدید ایجاد می کند که باعث انحطاط انتخابی نورون های دوپامینرژیک سیاه پوست در انسان می شود. این نوروتوکسین برای ایجاد مدل های حیوانی PD استفاده شده است. MPTP توسط مونوآمین اکسیداز B به MPP تبدیل می شود که در میتوکندری انباشته می شود. جایی که کمپلکس میتوکندری I و آن روزهای میتوکندری را مهار می کند. عملکرد باعث آپوپتوز می شود [16]. بنابراین، سمیت عصبی ناشی از MPP به همراه 一 در نورون های دوپامینرژیک به طور گسترده به عنوان یک مدل اتیولوژیک PD برای غربالگری عوامل محافظت کننده عصبی مورد استفاده قرار گرفته است.

در مطالعه حاضر، ما نشان دادیم که مرگ سلولی ناشی از MPP پلاس از طریق استرس اکسیداتیو در سلول‌های PC12 توسط توبولوزید B کاهش می‌یابد. و آپوپتوز، همانطور که با استفاده از الکتروفورز ژل DNA و آنالیز فلوسایتومتری اندازه گیری شد. علاوه بر این، درمان همزمان با غلظت‌های بالاتر توبولوزید B، تولید ROS ناشی از MPP را مهار کرد. بنابراین، توبولوزید B اثرات محافظتی عصبی چند عملکردی را نشان داده است. چندین مکانیسم، به طور جداگانه یا همراه، ممکن است در اعمال توبولوزید B دخیل باشند. اثر آنتی اکسیدانی یک مکانیسم احتمالی برای محافظت عصبی با واسطه توبولوزید B است. Xiong Q دریافت که توبولوزید B یک فعالیت مهارکننده رادیکال آزاد قوی روی رادیکال 1،{8}}دی فنیل-2-پیکریل هیدرازیل و رادیکال آنیون سوپراکسید گزانتین اکسیداز تولید شده از گزانتین نشان داد [6].

اخیراً گزارش شده است که چندین فنیل اتانوئید دارای خواص مهار رادیکال های آزاد هستند و از آسیب های سمی ناشی از استرس اکسیداتیو محافظت می کنند. ROS تولید شده توسط MPP plus مانند پراکسید هیدروژن، آنیون سوپراکسید و رادیکال هیدروکسیل به آسانی به مولکول های بیولوژیکی آسیب می رساند که در نهایت می تواند منجر به مرگ سلولی آپوپتوز یا نکروز شود. بنابراین، توبولوزید B ممکن است اثرات مهاری مستقیم علیه ROS داشته باشد. در حالی که داده‌های ما مکان دقیقی را که در آن توبولوزید B برای سرکوب تجمع ROS عمل می‌کند، نشان نمی‌دهد، آنها نشان می‌دهند که مکانیسم محافظت عصبی شامل تحریک مسیرهای آنتی اکسیدانی است. مطالعه ساختار مولکولی توبولوزید B همچنین نشان می دهد که دارای ظرفیت قوی برای از بین بردن رادیکال های آزاد (ارتباط شخصی) است.

مکانیسم های دیگری نیز می تواند مناسب باشد. به عنوان مثال، توبولوزید B ممکن است ظرفیت مقابله با سمیت MPP را با مهار باز شدن منافذ انتقال نفوذپذیری میتوکندری و اختلال در عملکرد داشته باشد. علاوه بر این، اینکه آیا توبولوزید B اثر مستقیمی بر رشد سلول‌های عصبی دارد نیز باید در نظر گرفته شود. مکانیسم دقیق عملکرد محافظت عصبی توبولوزید B نامشخص است. مطالعات بیشتری برای روشن شدن تصویر کامل از اثر محافظت عصبی آن مورد نیاز است.

در نتیجه، توبولوزید B از عصاره سیستانچ سالسا دارای اثرات محافظتی آشکاری بر آپوپتوز ناشی از MPP و استرس اکسیداتیو است. اثرات محافظت عصبی آن در برابر سمیت MPP ＋ ممکن است مهم باشد و نشان دهد که ممکن است پتانسیل درمانی در پیشگیری و درمان PD داشته باشد.

درمان PD: cistanche

منابع

7. Xiong Q، Tezuka Y، Kaneko 1، Li H، Tran LQ Hase K، Namba T، Kadota S. مهار اکسید نیتریک توسط فنیل اتانوئیدها در ماکروفاژهای فعال. Eur J Pharmaco12000؛ 400:137 -44

8. Greene LA، Tischler AS. ایجاد یک خط کلونال نورآدرنرژیک از سلول های فئوکروموسیتوم آدرنال که به فاکتور رشد عصبی پاسخ می دهند. Proc Nat Acad Sci 1976; 73: 2424-8

9. Yao Z، Drieu K، Szweda LI، Papadopoulos V. رادیکال های آزاد و پراکسیداسیون لیپیدی باعث مرگ سلول های عصبی ناشی از آمیلوئید نمی شوند. Brain Res 1999; 847: 203- 10

10. Yamamoto T، Yuyama K، Nakamura K، Kato T، Yamamoto H. خصوصیات جنبشی سمیت اکسید نیتریک برای سلول های PC12: اثر زمان نیمه عمر انتشار NO. Eur J Pharmacol 2000; 397:25-33

11. Nicoletti l, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani E Riccardi C. روشی سریع و ساده برای اندازه گیری آپوپتوز تیموسیت با رنگ آمیزی یدید پروپیدیوم و فلوسیتومتری. J Immunol Methods 1991; 139: 271-9

12. Moore KJ، Matlashewski C. عفونت داخل سلولی توسط لیشمانیا دو نوا آپوپتوز ماکروفاژها را مهار می کند. J Immunol 1994; 152: 2930- 7

13. Mark RJ، Keller JN، Kruman I، Mattson MP. FGF پایه استرس اکسیداتیو ناشی از پپتید آمیلوئید، اختلال عملکرد میتوکندری و اختلال در فعالیت Na ＋-K ＋-ATPase را در نورون های هیپوکامپ کاهش می دهد. تحقیق مغز 1997; 756: 205-14

14. Merad-Boudia M، Nicole A، Santiard-Baron D، Saille C، CeballosPicot L اختلال میتوکندری به عنوان یک رویداد اولیه در روند آپوپتوز ناشی از کاهش گلوتاتیون در سلول های عصبی: ارتباط با بیماری پارکینسون. Biochem Pharmaco11998; 56: 645-55

15. Langston JW، Ballard P، Tetrud JW، Irwin I. پارکینسونیسم مزمن در انسان به دلیل یک محصول از سنتز مپریدین-آنالوگ. علم 1983; 219: 979-80

16. Mizuno Y, Sone N, Suzuki K, Saitoh T. مطالعات روی سمیت یون 1-me ethyl-4-phenylpyridinium (MPP ＋) علیه میتوکندری مغز موش. J Neurol Sci 1988; 86: 97-110