قسمت 1: آکتئوزید با مهار القای C-Fos و مسیر NF-KB و کاهش تولید ROS، استئوکلاستوژنز ناشی از RANKL را سرکوب می کند.

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

سونگ یوپ لی 1،2، کیون سو لی 3.¤، سی هیون یی 2.، سونگ هو کوک، جئونگ-چای لی 22،3*

خلاصه

مطالعات متعددی گزارش کرده اند که سایتوکین های التهابی واسطه های مهمی برای استئوکلاستوژنز هستند و در نتیجه باعث تحلیل بیش از حد استخوان و پوکی استخوان می شوند.اکتئوزید از گیاه سیستانچترکیب فعال اصلی Rehmannia glutinosa که در طب سنتی شرقی کاربرد فراوانی دارد، دارای پتانسیل ضد التهابی و آنتی اکسیدانی است. در این مطالعه متوجه شدیم کهاکتئوزیدبه طور قابل توجهی تمایز و تشکیل استئوکلاست از ماکروفاژهای مغز استخوان (BMM) و ماکروفاژهای RAW264.7 را مهار کرد که توسط فعال کننده گیرنده لیگاند فاکتور هسته‌ای کاپاB (NF-kB) (RANKL) تحریک می‌شوند.اکتئوزیدپیش درمانی همچنین از تحلیل استخوان توسط استئوکلاست های بالغ به روشی وابسته به دوز جلوگیری کرد. Acteoside (10 میلی‌مولار) فعال‌سازی RANKL کیناز p38، کینازهای تنظیم‌شده با سیگنال خارج سلولی و کیناز N ترمینال C-Jun را کاهش داد و همچنین با مهار فسفوریلاسیون زیرواحد p65 kBa و kBa، فعال‌سازی NF-kB را سرکوب کرد. علاوه بر این، افزایش با واسطه RANKL در بیان c-Fos و فاکتور هسته ای سلول های T فعال، سیتوپلاسمی 1 (NFATc1) و در تولید فاکتور نکروز تومور-a، اینترلوکین (IL){15}}b و IL{16}} ظاهراً با پیش تیمار اکتئوزید مهار شدند. علاوه بر این، شفاهیاکتئوزیدکاهش از دست دادن استخوان ناشی از تخمدان و تولید سیتوکین التهابی برای کنترل سطوح. داده‌های ما نشان می‌دهد که اکتئوزید تمایز و بلوغ استئوکلاست‌ها را از پیش‌سازهای استئوکلاستیک با سرکوب فعال‌سازی پروتئین کینازهای فعال‌شده با میتوژن و فاکتورهای رونویسی مانند NF-kB، c-Fos و NFATc1 ناشی از RANKL، مهار می‌کند. در مجموع، این نتایج نشان می دهد که اکتئوزید ممکن است به عنوان یک عامل ضد جذب برای کاهش از دست دادن استخوان با مسدود کردن فعال شدن استئوکلاست عمل کند.

سیستانش اکتئوزید

مقدمه

استخوان به طور مداوم با فعالیت متعادل استئوکلاست و استئوبلاست بازسازی می شود [1]. استئوکلاست ها از سلول های پیش ساز خونساز دودمان مونوسیت/ماکروفاژ به وجود می آیند، در حالی که استئوبلاست ها از دودمان مزانشیمی هستند [2]. فعال شدن غیرطبیعی استئوکلاست یا کاهش استئوبلاستوژنز می تواند هموستاز استخوان را مختل کند و در نهایت باعث ایجاد بیماری هایی مانند پوکی استخوان، آرتریت و سرطان استخوان شود [3،4]. پوکی استخوان یک بیماری شایع استخوانی است که منجر به افزایش خطر شکستگی می شود. شایع ترین شکل پوکی استخوان ناشی از کمبود استروژن در زنان یائسه است. داروهایی مانند کورتیکواستروئیدها و داروهای ضد صرع نیز ممکن است باعث عدم تعادل بین جذب و تشکیل استخوان شوند که می تواند منجر به پوکی استخوان شود [5].

بسیاری از مهارکننده های ضد جذب از جمله بیس فسفونات ها، کلسی تونین، استروژن و تعدیل کننده های انتخابی گیرنده استروژن برای درمان پوکی استخوان استفاده شده اند. این مهارکننده ها با مهار عملکرد استئوکلاست ها توده استخوانی را حفظ می کنند [6]. درمان جایگزینی استروژن محبوب ترین درمان برای پیشگیری و درمان پوکی استخوان پس از یائسگی است. با این حال، درمان جایگزین استروژن طولانی مدت می تواند خطر ابتلا به سرطان آندومتر و سینه را افزایش دهد. بنابراین، بسیاری از محققین تلاش خود را بر توسعه یک عامل ضد جذب جدید متمرکز کرده اند که عوارض جانبی نداشته باشد [7-10]. از آنجایی که استئوکلاست ها در تحلیل استخوان عمل می کنند، به طور خاص مهار استئوکلاست ها هدف اصلی در مطالعات متعدد در نظر گرفته شده است.

استئوکلاست ها سلول های غول پیکر چند هسته ای هستند که توسط پیش سازهای تک هسته ای خانواده مونوسیت/ماکروفاژ از طریق تکثیر متوالی، تمایز و ادغام سلول های پیش ساز خونساز شکل می گیرند [11]. فاکتور تحریک کننده کلنی ماکروفاژها (M-CSF) و فعال کننده گیرنده لیگاند فاکتور هسته ای (NF) -kB (RANK) (RANKL) از عوامل ضروری برای تمایز استئوکلاست ها هستند [12]. علاوه بر این، چندین سایتوکین التهابی، مانند فاکتور نکروز تومور (TNF) و اینترلوکین (IL){5}}b، با تعدیل القای RANKL، استئوپروتجرین و M-CSF به استئوکلاستوژنز کمک می کنند [7،13]. اتصال RANKL به گیرنده RANK سطح سلول منجر به کمپلکس های فاکتورهای مرتبط با RANKL/RANK/TNFR (TRAF) می شود که به طور متوالی NF-kB و پروتئین کینازهای فعال شده با میتوژن (MAPKs) را فعال می کند، از جمله c-Jun N ترمینال کیناز (JNK)، p38. کیناز و کیناز مرتبط با سیگنال خارج سلولی (ERK) [14]. این فعال‌سازی نقش کلیدی در میانجی‌گری تمایز، فعال‌سازی و بقای استئوکلاست دارد. RANKL همچنین بیان فاکتورهای رونویسی مانند فاکتور هسته ای سلول های T فعال، سیتوپلاسمی 1 (NFATc1) و c-Fos را فعال می کند که برای رشد استئوکلاست ها ضروری هستند [7،9]. بنابراین، سیگنالینگ RANKL هدف اصلی عوامل ضد جذب است که فعال شدن استئوکلاست و از دست دادن استخوان را سرکوب می کند.

اکتئوزیدترکیب فعال اصلی Rehmannia glutinosa است که به طور گسترده در طب سنتی شرقی استفاده می شود [15،16]. Acteoside یک آنتی اکسیدان قوی است و دارای فعالیت های ضد کبدی، ضد التهابی و ضد درد است [17-20]. قبلاً دریافتیم که اکتئوزید با تنظیم سیگنال دهی ERK [21]، فعالیت تیروزیناز و بیوسنتز ملانین را کاهش می دهد، در برابر آسیب لثه با واسطه گونه های اکسیژن فعال (ROS) محافظت می کند [22]، و آسیب سلولی ناشی از مایکوتوکسین را سرکوب می کند [23]. این اثرات ارتباط نزدیکی با توانایی نوکلئوزیدها برای حذف ROS و تنظیم سیگنالینگ با واسطه MAPK دارد. به طور خاص، ROS برای واسطه مسیرهای سیگنالینگ ناشی از RANKL و رویدادهای سلولی در استئوکلاست‌ها پیشنهاد می‌شود. پیش درمانی با آنتی اکسیدان‌ها، فعال‌سازی NF-kB، ERK و IkBa ناشی از RANKL را مهار کرد و در نتیجه استئوکلاستوژنز را سرکوب کرد [24]. این یافته ها قویاً نشان می دهد که علاوه بر فعالیت ضد التهابی، فعالیت آنتی اکسیدانی برای یک عامل ضد جذب بسیار مهم است، بنابراین اکتئوزید می تواند استئوکلاستوژنز ناشی از RANKL را سرکوب کند.

در مطالعه حاضر، بررسی کردیم که آیا اکتئوزید اثر درمانی بر تحلیل استخوان دارد یا خیر. ما اثرات اکتئوزید را بر تمایز استئوکلاست‌ها و تحلیل استخوان و مکانیسم‌های سلولی مرتبط با استفاده از سیستم‌های تجربی آزمایشگاهی و درون تنی بررسی کردیم.

اکتئوزید سیستانچ استئوکلاستوژنز ناشی از RANKL را سرکوب می کند

مواد و روش ها

بیانیه اخلاق

روش‌های مراقبت و استفاده از حیوانات توسط کمیته اخلاق در مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه ملی Chonbuk تأیید شد (شماره مجوز CBU 2010-0007). تمام آزمایشات در این مطالعه بر اساس دستورالعمل کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات دانشگاه انجام شد.

موش، مواد شیمیایی و محصولات آزمایشگاهی

موش‌های ماده چهار هفته‌ای ICR از Orient Bio Inc. (سئول، کره) خریداری شدند و در دمای 2261uC و رطوبت 5565 درصد در چرخه نور/تاریکی 12 ساعت با دسترسی آزاد به غذا و آب نگهداری شدند. اکتئوزید (3،{6}}دی هیدروکسی-بفناتیل-Oa-رامنوپیرانوسیل-(1R3){14}}O-کافئویل-bD-گلوکوپیرانوزید؛ C29H36O15) (شکل S1) از برگ های Rehmannia glutinosa جدا شد. اکتئوزید قبل از استفاده در سالین بافر فسفات (PBS) حل شد. RANKL، TNF-a، IL-1b، IL{26}}، و M-CSF از R & D Systems (مینیاپولیس، MN، ایالات متحده آمریکا) خریداری شدند. آنتی بادی های مخصوص c-Fos، p65، p-p65، p-ERK، ERK، JNK، p-JNK، NFATc1، IkBa، p-IkBa، و b-actin از بیوتکنولوژی سانتا کروز (سانتا کروز، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد. ). آنتی بادی برای p-p38 و p38 از Cell Signaling Technology (دانورز، MA، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. کیت های سنجش کلسیم و استئوکلسین (OC) EIA به ترتیب از BioAssay Systems (Hayward، CA، USA) و Biomedical Technologies (Stoughton، MA، USA) برای تعیین پارامترهای بیوشیمیایی سرم خریداری شدند. کیت سنجش اسید فسفاتاز مقاوم به تارتارات موش (TRAP) (سیستم‌های تشخیصی ایمنی، اسکاتسدیل، AZ، ​​ایالات متحده آمریکا) نیز برای اندازه‌گیری سطح سرمی TRAP5b استفاده شد. مگر اینکه در غیر این صورت مشخص شود، مواد شیمیایی اضافی از شرکت شیمیایی سیگما (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) و محصولات آزمایشگاهی از SPL Life Sciences (پوچون، کره جنوبی) تهیه شد.

کشت های سلولی

سلول‌های مغز استخوان از درشت نی و استخوان ران موش‌های ماده ۶ هفته‌ای ICR بر اساس روش‌هایی که قبلاً توضیح داده شد، به‌دست آمدند [25]. سوسپانسیون مغز استخوان در یک ظرف کشت 100- میلی متری در حضور ng/ml 50 M-CSF انکوبه شد. پس از 3 روز، از سلول های چسبنده به عنوان ماکروفاژهای مغز استخوان (BMMs) برای القای تمایز استئوکلاستیک استفاده شد. برخی از سلول های مغز استخوان نیز به مدت 48 ساعت بدون M-CSF انکوبه شدند و سلول های چسبنده در یک محیط تمایز دهنده استئوبلاست، همانطور که در جاهای دیگر توضیح داده شد، کشت داده شدند [25]. سلول‌های ماکروفاژ RAW264.7 در محیط Eagle اصلاح‌شده Dulbecco (DMEM) همراه با 10 درصد سرم جنین گاو (FBS)، 2 میلی‌مولار L-گلوتامین و آنتی‌بیوتیک‌ها کشت داده شدند. این سلول‌ها به‌عنوان یک خط سلولی همتا برای BMMs برای بررسی اثر اکتئوزید بر استئوکلاستوژنز استفاده شدند.

تمایز استئوکلاستیک و رنگ آمیزی TRAP

BMMs با غلظت های مختلف ({0}}-50 میلی مولار) از قبل تیمار شدنداکتئوزیدبه مدت 2 ساعت قبل از تحریک با 100 نانوگرم در میلی لیتر RANKL. در روزهای 2 و 5 محیط کشت با محیط تازه جایگزین شد. پس از 7 روز انکوباسیون، کشت ها در 4 درصد پارافورمالدئید بافر PBS تثبیت شدند و با استفاده از کیت سیگما آلدریچ طبق دستورالعمل سازنده با TRAP رنگ آمیزی شدند. سلول های TRAP مثبت با استفاده از میکروسکوپ نوری شمارش شدند و سلول های حاوی 3 هسته یا بیشتر به عنوان استئوکلاست در نظر گرفته شدند. سلول های RAW 264.7 نیز پس از پیش تیمار با آکتئوزید به مدت 2 ساعت در معرض 100 نانوگرم در میلی لیتر RANKL قرار گرفتند و پس از 7 روز انکوباسیون، سلول ها برای رنگ آمیزی TRAP پردازش شدند.

اندازه گیری زنده ماندن سلول

زنده ماندن سلول ها با استفاده از معرف نمک تترازولیوم محلول در آب (WST) تعیین شد. به طور خلاصه، سلول‌های BMM یا RAW264.7 کشت‌شده در محیط رشد حاوی 10 درصد FBS و آنتی‌بیوتیک‌ها با 10 میلی‌مولار آکتئوزید یا یک ترکیب فنلی مانند کوئرستین، لوتئولین، آپیژنین یا اپی گالوکاتچین گالات (EGCG) تیمار شدند. پس از 48 ساعت انکوباسیون، معرف WST{7}} به کشت ها اضافه شد. پس از انکوباسیون به مدت 4 ساعت دیگر، جذب ویژه WST در 450 نانومتر با استفاده از یک میکروپلیت خوان (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA) اندازه گیری شد.

سنجش تحلیل استخوان

BMMها (16105 سلول در میلی‌لیتر) در a-MEM حاوی 50 نانوگرم در میلی‌لیتر M-CSF و 100 نانوگرم در میلی‌لیتر RANKL معلق شدند، سپس در یک 24-صفحه چاه پوشیده شده با نانوبلورهای فسفات کلسیم (OAAS{6}) تقسیم شدند. }؛ زیرلایه سنجش فعالیت استئوکلاست، شرکت Oscotec، Choongnam، کره جنوبی) با تراکم 26104 سلول/cm2 با و بدون اکتئوزید. پس از انکوباسیون به مدت 7 روز، سلول ها با هیپوکلریت سدیم 5 درصد از پلیت ها خارج شدند و تشکیل گودال در زیر میکروسکوپ نوری مشاهده شد. ناحیه جذب شده نیز توسط یک تحلیلگر تصویر اندازه گیری شد و به صورت درصدی از مقدار کنترل بیان شد.

تجزیه و تحلیل وسترن بلات

لیزهای پروتئین کامل در بافر لیز همانطور که در جاهای دیگر توضیح داده شد آماده شدند [26]. پروتئین های سیتوزولی و هسته ای همانطور که قبلاً توضیح داده شد آماده شدند [25]. مقادیر مساوی از عصاره پروتئینی توسط 12-15 درصد SDS-PAGE جدا شد و بر روی غشاهای پلی وینیل دی فلوراید لکه دار شد. بلات‌ها با آنتی‌بادی‌های اولیه یک شبه در دمای 4uC قبل از انکوباسیون با آنتی‌بادی ثانویه در بافر مسدودکننده به مدت 1 ساعت بررسی شدند. لکه ها بودند

با نورتابی شیمیایی افزایش یافته (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, UK) و در معرض فیلم اشعه ایکس (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA) توسعه یافته است.

سنجش فعالیت MAPK

سلول ها با قبل تیمار شدنداکتئوزیدبه مدت 2 ساعت و سپس با RANKL برای -30 دقیقه اضافی تحریک می شود. فعالیت های MAPK با استفاده از کیت های سنجش ایمونومتری، مانند کیت سنجش کیناز p-p38 (Assay Designs, Inc., MI, USA)، کیت سنجش آنزیمی p-ERK (Assay Designs) و کیت ELISA ساندویچ p-SAPK/JNK تعیین شد. (تکنولوژی سیگنالینگ سلولی، MA، ایالات متحده آمریکا). تمام مراحل از دستورالعمل های سازنده پیروی می کردند و میزان جذب توسط دستگاه میکروپلیت خوان اندازه گیری می شد.

سنجش تغییر حرکت الکتروفورتیک (EMSA)

واکنش های اتصال به پروتئین DNA به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق، با 10-15 میلی گرم پروتئین در 20 میلی لیتر بافر حاوی 1 میلی گرم در میلی لیتر BSA، 0.5 میلی گرم در میلی لیتر پلی (dI-dC)، 5 درصد گلیسرول انجام شد. 1 میلی‌مولار DTT، 1 میلی‌مولار PMSF، 10 میلی‌مولار Tris-Cl (pH 7.5)، 50 میلی‌مولار NaCl، 30،{18}} cpm از الیگونوکلئوتیدهای نشاندار شده با dCTP [a{19}}P] و قطعه کلنو DNA پلیمراز نمونه ها بر روی ژل های پلی آکریل آمید 6 درصد جدا شدند، که خشک شده و در معرض فیلم اشعه ایکس (شرکت ایستمن کداک) به مدت 12 تا 24 ساعت در دمای 270 درجه سانتی گراد قرار گرفتند. توالی پرایمر الیگونوکلئوتیدی خاص برای NF-kB عبارت بودند از 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTG GCC TGG A-39 و 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGG ACC GGA CCT GGA A -59.

سنجش NF-kB لوسیفراز

ماکروفاژهای RAW264.7 در پلیت‌های چاهک با 0.8 میلی‌گرم ناقل گزارشگر kB-لوسیفراز با استفاده از 2 میلی‌لیتر لیپوفکتامین 2000 (Invitrogen، Carlsbad، CA، USA) طبق دستورالعمل سازنده ترانسفکت شدند. در 24 ساعت پس از ترانسفکشن، سلول ها با RANKL در حضور و عدم حضور آکتئوزید به مدت 24 ساعت تحریک شدند. سلول ها در 100 میلی لیتر بافر لیز گزارشگر معلق شدند

(Promega، مدیسون، WI، ایالات متحده آمریکا). مقادیر مساوی از نمونه های پروتئین در میکروپلیت های چاهک قرار داده شد و با سوبسترای لوسیفراز مخلوط شد. لومینسانس با استفاده از نور سنج میکروپلیتی (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) اندازه گیری شد. در این آزمایش، یک پپتید بازدارنده نفوذپذیر NF-kB (BIOMOL، Butler Pike، PA، USA) به عنوان یک مهارکننده kB مثبت استفاده شد.

اندازه گیری سیتوکین ها

سلول‌های BMM یا RAW264.7 با RANKL در حضور آکتئوزید در 24-صفحه‌های کشت چاه تحریک شدند. پس از 48 ساعت انکوباسیون، سوپرناتانت های کشت با استفاده از کیت های اختصاصی OptEIATM TNF-a-، IL{6}}b- و IL{8} با روش ELISA بر اساس دستورالعمل سازنده، جمع آوری و ارزیابی شدند.

واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس در زمان واقعی (RT-PCR)

بیان mRNA نشانگرهای استئوکلاستیک، مانند c-Fos، NFATc1، و TNF-a، توسط RT-PCR بلادرنگ تعیین شد. به طور خلاصه، RNA کل از ماکروفاژها با معرف تریزول طبق دستورالعمل سازنده (Invitrogen) استخراج شد. cDNA با 1 میلی گرم RNA کل با استفاده از SuperScript Reverse Transcriptase II و پرایمرهای (Invitrogen) سنتز شد. Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) برای تشخیص تجمع محصول PCR در حین دوچرخه سواری با سیستم تشخیص توالی ABI 7500 (Applied Biosystems) استفاده شد. پس از دناتوراسیون در دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه، PCR انجام شد

با استفاده از چهل چرخه دناتوراسیون 3-مرحله‌ای در دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 ثانیه، بازپخت در دمای 60 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 ثانیه، و گسترش در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه انجام شد. تمام واکنش‌های PCR حداقل در سه تکرار انجام شد و سطح بیان به ژن HPRT خانه‌دار در همان واکنش نرمال شد. این مطالعه از همان توالی پرایمرهایی استفاده کرد که در جاهای دیگر توضیح داده شد [7].

اندازه گیری ROS داخل سلولی

محلول ذخیره‌ای از 29 دی کلرودی‌هیدروفلورسئین-دی استات (DCFH-DA) (5{11}} میلی‌مولار؛ Calbiochem، دارمشتات، آلمان) در DMSO تهیه شد و در دمای 220 درجه سانتی‌گراد در تاریکی ذخیره شد. به طور خلاصه، BMMs (106 سلول در میلی‌لیتر در {7}صفحه چاهک) با 50 نانوگرم در میلی‌لیتر M-CSF به مدت 24 ساعت کشت داده شدند و سپس با غلظت‌های مختلف (0 تا 10 میلی‌مولار) تیمار شدند.اکتئوزید2 ساعت قبل از تحریک با 100 نانوگرم در میلی لیتر RANKL. پس از 1 ساعت انکوباسیون همزمان، این سلول ها متعاقبا با 25 میلی مولار DCFH-DA به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند. فلورسانس سبز 29،{8}}دی کلروفلورسئین (DCF) در 515 نانومتر (FL 1) با استفاده از سیستم FACS VantageH (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) و 10,{13} ثبت شد. رویدادها در هر نمونه شمارش شدند.

القای پوکی استخوان ناشی از اواریکتومی

برای این مطالعه از موش های ماده ICR (6 هفته ای) استفاده شد. موش‌ها تحت بیهوشی تحت عمل جراحی ساختگی (Sham, n =10) یا برداشتن تخمدان جراحی (OVX, n=20) قرار گرفتند. یک هفته پس از جراحی، موش های OVX به طور تصادفی به 2 گروه 10 تایی تقسیم شدند: OVX دوطرفه و OVX دوطرفه با 200 میلی لیتر مکمل

PBS حاوی 1 میلی مولار اکتئوزید خوراکی (گروه AC). اکتئوزید خوراکی هر 3 روز یک بار به مدت 8 هفته پس از جراحی تجویز شد

همان مقدار PBS به گروه های شم و OVX داده شد. پس از 1 روز از آخرین تجویز، موش‌ها قربانی شدند و سپس پارامترهای بیوشیمیایی سرم و ساختار استخوانی {1}بعدی آنالیز شد.

تعیین پارامترهای بیوشیمیایی سرم

نمونه خون از طریق سوراخ قلبی و سرم با سانتریفیوژ جمع آوری شد. نمونه های سرم در دمای 280 درجه سانتیگراد برای تجزیه و تحلیل پارامترهای بیوشیمیایی ذخیره شدند. سطح سرمی IL-1b و IL-6 با استفاده از کیت ELISA همانطور که در بالا توضیح داده شد، تخمین زده شد، در حالی که فعالیت آلکالین فسفاتاز (ALP) با استفاده از یک روش رنگ سنجی بیوشیمیایی که مقدار p را اندازه گیری می کند، تعیین شد. -نیتروفنول تولید شده از یک بستر فسفات p-نیتروفنل، همانطور که در جاهای دیگر توضیح داده شد [27]. برای تخمین بیومارکرهای تشکیل و جذب استخوان، سطوح سرمی OC، کلسیم و TRAP5b نیز طبق دستورالعمل سازنده تعیین شد.

تجزیه و تحلیل ساختار استخوان و پارامترهای مورفومتریک

استخوان ران موش ها (گروه های شم، OVX و AC) تشریح شد و با سالین فیزیولوژیکی برای آزمایش مکانیکی پر شد. استحکام مکانیکی استخوان ران همانطور که در جای دیگر توضیح داده شد اندازه گیری شد [28]. بار شکستگی به عنوان نیروی اوج بر حسب نیوتن در نقطه ای ثبت شد که شفت میانی استخوان ران راست شکسته شد. علاوه بر این، استخوان ران سبک هر حیوان با استفاده از یک سیستم توموگرافی میکروکامپیوتری (micro-CT) (سیستم میکروفوکوس اشعه ایکس SkyScan 1076، Kontich، بلژیک) به صورت هیستومورفومتری آنالیز شد. به طور خلاصه، استخوان‌های موجود در ذخیره‌سازی فرمالدئید 4 درصد، قبل از بسته‌شدن در «فیلم چسبنده» پلاستیکی یا در پارافیلم، به‌طور سطحی روی بافت کاغذی خشک شدند تا از خشک شدن در طول اسکن جلوگیری شود. هر استخوان بسته بندی شده با پلاستیک در لوله های فوم پلاستیکی / پلی استایرن قرار داده شد که به صورت عمودی در محفظه نمونه اسکنر 1076 نصب شده بود.

تصویربرداری میکرو سی تی اسکن با استفاده از ولتاژ منبع 100 کیلوولت و جریان منبع 140 میلی آمپر با وضوح 35 میلی متر انجام شد.

مدل‌های سه‌بعدی استخوان‌های ترابکولار استخوان ران با استفاده از SkyScan CT Analyzer نسخه 1.11 بازسازی شدند. پارامترهای ساختاری مانند تراکم معدنی استخوان ترابکولار (BMD، g/cm3)، درصد حجم استخوان (حجم استخوان (BV) / حجم بافت (TV)، درصد)، ضخامت (Tb.Th، mm)، جداسازی (Tb.Sp. ، میلی متر) و عدد (Tb.N، 1/mm) اندازه گیری شد.

سنجش تمایز و کانی‌سازی استخوان‌سازی سلول‌های مغز استخوان کشت‌شده در پلیت‌های کشت چاهک با DAG (10 نانومولار دگزامتازون، 50 میلی‌مولار اسید اسکوربیک و 20 میلی‌مولار b-گلیسروفسفات) تیمار شدند. حضور 10 میلی مولار اکتئوزید. پس از 2 هفته تمایز، سلول ها با اتانول 70 درصد (vol/vol) یخی به مدت 1 ساعت تثبیت شدند و با 0.2 درصد آلیزارین رد S در آب مقطر به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق رنگ آمیزی شدند. پس از رنگ‌آمیزی سلول‌ها و خشک شدن در هوا، صفحات کشت سلولی با میکروسکوپ نوری با استفاده از میکروسکوپ معکوس (Nikon TS100، ژاپن) ارزیابی شدند. برای تعیین کمیت رنگ قرمز، لکه با استیل پیریدینیم کلرید 10 درصد با تکان دادن به مدت 20 دقیقه شستشو داده شد و جذب در طول موج 560 نانومتر اندازه‌گیری شد. میزان کلسیم رسوب شده در لایه های سلولی نیز با استفاده از کیت کلسیم C (Wako Chemical Inc. Osaka، ژاپن) طبق دستورالعمل سازنده اندازه گیری شد. علاوه بر این، بیان نشانگرهای mRNA اختصاصی استخوان، مانند فاکتور رونویسی مربوط به runt{20}} (Runx2)، استریکس، سیالوپروتئین استخوان (BSP) و OC توسط RT-PCR بلادرنگ تعیین شد. پرایمرهای الیگونوکلئوتیدی این نشانگرها با اندازه محصول کمتر از 200 جفت باز با استفاده از Primer Express Software 3.0 (Applied Biosystems) همانطور که در جاهای دیگر توضیح داده شد، طراحی شدند [27].

سیستانچ اکتئوزید تشکیل استخوان را تقویت می کند

نتایج

Acteoside تشکیل استئوکلاست توسط ماکروفاژها را به روشی وابسته به دوز مهار می کند.

برای بررسی تأثیر اکتئوزید بر تمایز BMM به استئوکلاست، سلول‌ها با غلظت‌های مختلف ({0}}– 20 میلی‌مولار) آکتئوزید به مدت 7 روز در حضور 50 نانوگرم در میلی‌لیتر M-CSF و 100 نانوگرم در میلی‌لیتر کشت داده شدند. RANKL. Acteoside تعداد استئوکلاست ها را به صورت وابسته به دوز کاهش داد. هنگامی که سلول ها با 10 میلی مولار آکتئوزید به مدت 2 ساعت پیش تیمار شدند، تعداد استئوکلاست ها 43 درصد در مقایسه با سلول های مکمل M-CSF و RANKL کاهش یافت (شکل 1A). شکل 1B تمایز استئوکلاست با واسطه RANKL و مهار آن را با درمان ترکیبی با آکتئوزید نشان می دهد. مطابق با این نتیجه، پیش تیمار آکتئوزید تمایز تحریک شده با RANKL سلول های RAW264.7 و تشکیل استئوکلاست را کاهش داد (شکل 1C و D). هنگامی که پتانسیل ضد استئوکلاستیک اکتئوزید روی BMM با پتانسیل آنتی استئوکلاستی چندین ترکیب فنلی در غلظت یکسان (10 میلی مولار) مقایسه شد، لوتئولین بیشترین فعالیت را نشان داد (شکل 2A). با این حال، لوتئولین، کوئرستین، یا آپیژنین خود زنده ماندن سلول ها را کاهش داد (شکل 2B). همه ترکیبات تمایز استئوکلاستیک توسط ماکروفاژهای RAW264.7 را با فعالیت‌های نسبی زیر مهار کردند: لوتئولین. کورستین=آپیژنین .

سیستانچ اکتئوزید استئوکلاست را مهار می کند

لطفا برای قسمت 2 اینجا را کلیک کنید