قسمت 1 جهش ERCC1 مانع از ترمیم آسیب DNA و ایجاد اختلال در عملکرد کبد و کلیه در بیماران می شود

مخاطب: ali.ma@wecistanche.com

کاتیا آپلت و همکاران

روی فواید عصاره سیستانچ برای عملکرد کلیه کلیک کنید

مقدمه

شش میلیارد جفت باز از ژنوم انسان به طور مداوم در معرض عوامل آسیب‌رسان به DNA قرار می‌گیرند و باعث ایجاد طیف گسترده‌ای از ضایعات DNA ژنومی، از جمله محصولات عکسی ناشی از نور UV، پیوندهای عرضی درون و بین رشته‌ای (ICL) و DNA دوگانه می‌شوند. شکستن رشته ها (DSB). برای اطمینان از یکپارچگی ژنومی، این ضایعات DNA باید به روشی خاص و کارآمد ترمیم شوند. مکانیسم های مختلف ترمیم DNA تکامل یافته اند که هر کدام بر روی زیر مجموعه خاصی از ضایعات DNA عمل می کنند. در حالی که بسیاری از پروتئین های ترمیم DNA در یک مسیر واحد، آندونوکلئاز هترودیمریک، درگیر هستندERCC1-XPF بین چندین مسیر ترمیم DNA متمایز مکانیکی مشترک است (Manandhar et al., 2015).

XPF ناپایدار است و به سرعت تخریب می شود، که با هترودایمریزاسیون آن باERCC1(Biggerstaff et al., 1993). تعامل بین این دو پروتئین توسط یک موتیف دوتایی مارپیچ - مارپیچ (HhH)2 واقع در انتهای C مربوطه آنها و همچنین از طریق دامنه مرکزی انجام می شود.ERCC1و دامنه نوکلئاز XPF (de Laat و همکاران، 1998b؛ جونز و همکاران، 2020؛ Tripsianes و همکاران، 2005؛ Tsodikov و همکاران، 2005). اتصال به DNA دو رشته ای توسط ERCC1 تسهیل می شود، در حالی که XPF ارتباط با DNA تک رشته ای (ssDNA) را از طریق دامنه (HhH)2 آن واسطه می کند (Tsodikov و همکاران، 2005). پس از قرار گرفتن، XPF از فعالیت کاتالیزوری خود از طریق موتیف نوکلئاز بسیار حفاظت شده خود برای جدا کردن بسترهای DNA مختلف در 59 محل اتصال حباب ها و 39 برآمدگی تک رشته ای که از یک مارپیچ دوگانه DNA امتداد یافته اند استفاده می کند (de Laat et al., 1998a; Enzlin and Sch¨). هستند، 2002؛ ماتسوناگا و همکاران، 1996). نقش کلیدی ERCC{15}} XPF برای اولین بار در ترمیم برش نوکلئوتیدی (NER) نشان داده شد، جایی که DNA 59 آسیب دیده را به ضایعه می شکافد (Sijbers et al., 1996a).

NER طیف گسترده ای از ضایعات DNA غیرمرتبط از نظر ساختاری، از جمله محصولات نوری ناشی از اشعه ماوراء بنفش را از طریق دو مسیر فرعی خود شناسایی می کند: ترمیم ژنوم جهانی (GGR) و ترمیم همراه با رونویسی (TCR). بخش عمده ای از فعالیت NER به GGR متکی است، جایی که پروتئین XPC محصولات نوری را در سراسر ژنوم تشخیص می دهد و مجموعه فاکتور رونویسی IIH (TFIIH) را به کار می گیرد (Sugasawa et al., 1998; Volker et al., 2001). ضایعات DNA که باعث توقف RNA پلیمراز II (RNAPII) در طول رونویسی می‌شوند، باعث جذب پروتئین‌های اختصاصی TCR مانند CSB، CSA و UVSSA می‌شوند که به نوبه خود کمپلکس TFIIH را جذب می‌کنند (ناکازاوا و همکاران، 2020؛ van der Weegen). و همکاران، 2020). پس از جذب TFIIH به ضایعه DNA، قیف GGR و TCR به یک مکانیسم مولکولی مشترک شامل ارتباط XPA و XPG (Marteijn et al., 2014)، که فعالیت هلیکاز TFIIH را تحریک می کند و یک کمپلکس دقیق پایدار را همراه با RPA تشکیل می دهد. کوکیچ و همکاران، 2019؛ ریدل و همکاران، 2003؛ واکاسوگی و سانکار، 1998). اینERCC1-هترودایمر XPF توسط XPA از طریق دامنه اتصال XPA به مجتمع NER جذب می شود.ERCC1(تسودیکوف و همکاران، 2007؛ ولکر و همکاران، 2001). یک برش دوگانه توسط فعالیت هماهنگ اندونوکلئازهای XPF (59 از ضایعه) و XPG (39 از ضایعه) باعث آزاد شدن کششی از ssDNA حاوی ضایعه DNA می شود (Li و همکاران، 1995؛ Matsunaga و همکاران، 1995؛ O. Donovan و همکاران، 1994؛ Staresincic و همکاران، 2009)، پس از آن شکاف ایجاد شده پر شده و برای تعمیر کامل بسته می شود.

علاوه بر NER نشان داده شد کهERCC1-XPF همچنین نقش اساسی در ترمیم ICL ایفا می کند (Klein Douwel et al., 2014). این مسیر ترمیم با تکرار متوقف شده آغاز می شود و شامل شناسایی چنگال تکرار متوقف شده با ICL توسط کمپلکس کم خونی فانکونی (FA) با هسته چند پروتئینی است که به عنوان کمپلکس لیگاز یوبیکوئیتین E3 برای FANCD2 عمل می کند. یکپارچه سازی FANCD2 باعث استخدام SLX4 می شود که به نوبه خود هدف قرار می دهدERCC1-XPF به ICL (عبدالله و همکاران، 2017؛ کلاین دوول و همکاران، 2014؛ والدن و دینز، 2014؛ وود، 2010). پس از جذب، ERCC{5}}XPF با برش رشته DNA والدین در هر دو طرف ضایعه، باز کردن ICL را واسطه می‌کند تا امکان بای پس و ترمیم بعدی ضایعه فراهم شود (Kuraoka و همکاران، 2000). در نهایت، ERCC{7}}XPF نیز با نوترکیبی همولوگ در تعمیر DSB دخیل است (احمد و همکاران، 2008)، که طی آن می‌تواند به طور موثر واسطه‌های نوترکیبی مختلف را جدا کند (Wyatt et al., 2017). از طرف دیگر، سلول‌ها از مسیر بازپخت تک رشته‌ای وابسته به RAD مستعد خطا استفاده می‌کنند، که شامل بازپخت نواحی با میکروهومولوژی و حذف بعدی 39 ssDNA غیرهمولوگ توسطERCC1-XPF (ادیر و همکاران، 2000؛ لی و همکاران، 2013، 2019). با این حال، نقش دقیق ERCC1-XPF در این مسیرهای تعمیر DSB به طور کامل شناخته نشده است.

اهمیت مسیرهای ترمیم DNA توسط فنوتیپ بالینی افراد مبتلا به اختلالات ارثی ترمیم-کمبود DNA تاکید می شود. غیرفعال شدن GGR منجر به Xeroderma pigmentosum می شود (XP; MIM 278700, 610651, 278720, 278730, 278740, 278760, and 278780; DiGiovanna and Kraemer, 2012, 2012, 2012, 2012, 278760, MIM 278700) سرطان پوست تخریب عصبی، عقب ماندگی رشد و بیماری چند سیستمی بدون سرطان پوست در سندرم Cockayne مشاهده می شود (CS؛ MIM 216400 و 133540). بیماران CS دارای یک نقص ژنتیکی انتخابی در TCR هستند که از پردازش RNAPII متوقف شده با آسیب DNA جلوگیری می کند (Karikkineth et al., 2017; Nakazawa et al., 2020; Nakazawa et al., 2012; Ribeiro et al., 2018; Tufeg. c Vidakovi´c و همکاران، 2020). جهش در ژنهای ترمیم ICL ضروری باعث FA (MIM 227650 ، 300514 ، 227645 ، 605724 ، 227646 ، 600901 ، 603467 ، 614082 ، 609053 ، 609054 ، 614083 ، 614087 ، 610832 ، 610832 ، 610832 ، 613390 ، ناهنجاری های اندام و بی ثباتی ژنومی (Auerbach, 2009). نقشERCC1-XPF در ترمیم ICL با وجود جهش‌هایی در XPF که منجر به فنوتیپ FA می‌شود تاکید می‌شود (Bogliolo و همکاران، 2013؛ Ceccaldi و همکاران، 2016؛ Kashiyama و همکاران، 2013). نقایص ارثی در ترمیم DSB باعث ایجاد طیف گسترده ای از اختلالات مرتبط با حساسیت پرتویی، استعداد سرطان، نقص ایمنی و تخریب عصبی می شود (هلفریخت و همکاران، 2020؛ مک کینون و کالدکات، 2007).

اختلالات ترمیم-کمبود DNA نادر است و با فرکانس تخمینی 1 در 200،000 تولد زنده در سراسر جهان برای XP، CS، و FA رخ می دهد. با این حال، تنها دو گزارش از افراد مبتلا به جهش های دو آللی ERCC1 (MIM 126380) تا به امروز شرح داده شده است (Jaspers et al., 2007; Kashiyama et al., 2013). هر دو فرد ویژگی های سازگار با CS را نشان دادند و در 14 ماهگی و 2.5 سالگی مردند. اولین و شدیدترین فرد مبتلا (165TOR) دارای یک کدون توقف نابهنگام (Q158X) در یک آلل و یک نوع نادرست F231L در دیگری بود (Jaspers et al., 2007). فرد دوم (CS20LO) برای نوع F231L هموزیگوت بود (Kashiyama et al., 2013). سلول های هر دو فرد نسبت به آسیب DNA ناشی از اشعه ماوراء بنفش حساسیت نشان دادند، و به ویژه 165TOR نیز نسبت به عوامل القا کننده ICL حساس بود. هر دو فرد در اوایل کودکی مردند (1 تا 2 سال؛ یاسپرس و همکاران، 2007؛ کاشیاما و همکاران، 2013). فرد سوم (XP202DC) با جهش های دو آللی ERCC1 که در سن 37 سالگی درگذشت در چکیده جلسه ذکر شده است (Imoto, K., et al. 2007. بیماران مبتلا به نقص در پروتئین های ترمیم کننده برش نوکلئوتیدی متقابلERCC1یا XPF گزرودرمی پیگمنتوزوم را با دژنراسیون شدید عصبی دیر شروع نشان می دهد. [چکیده] J. Invest. درماتول. 127: S92). این فرد هتروزیگوت مرکب برای یک جهش بی معنی (K226X) و یک جهش اسپلایس درERCC1. شرح فنوتیپی مفصلی در دسترس نیست و تأثیر این جهش‌های ERCC1 ناشناخته است.

فنوتیپ دو فرد فوق‌الذکر شدیدتر از آن چیزی است که از کمبود NER به تنهایی انتظار می‌رود، مطابق با دخالت ERCC1-XPF در مسیرهای ترمیم DNA متعدد. در همین راستا، موش‌های ERCC1 یا XPF-KO کشندگی جنینی بالایی را نشان دادند و طول عمرشان کاهش یافت و به دلیل نارسایی شدید کبد مردند (مک ویر و همکاران، 1993؛ تیان و همکاران، 2004؛ ویدا و همکاران، 1997). که در موش های XPA-KO با کمبود NER مشاهده نشد (de Vries et al., 1995; Nakane et al., 1995).

در مطالعه حاضر، ما دو خواهر و برادر با جهش‌های ERCC1 دو آللی را توصیف می‌کنیم که دارای فنوتیپ منحصربه‌فردی از قد کوتاه، حساسیت به نور، بیماری کبدی پیشرونده کلستاتیک و توبولوپاتی کلیوی هستند. هر دوی این افراد قبل از 10 سالگی دچار اختلال پیشرونده کبدی شدند و نیاز به پیوند کبد داشتند. مطالعات عملکردی نشان می‌دهد که سطح پروتئین حالت پایدار ERCC1 و XPF به طور چشمگیری در سلول‌های بستری و سلول‌های اپیتلیال متلاشی‌کننده‌ای که نوع نادرست موجود در بیماران را حمل می‌کنند، کاهش یافته است. علاوه بر این، پروتئین جهش یافته ERCC1 تنها با سایر پروتئین های ترمیم کننده NER و ICL به صورت ضعیف تعامل داشت. ما یک مورد جدید از کمبود ERCC1 را گزارش می‌کنیم که به شدت NER را تحت تأثیر قرار می‌دهد و تأثیر قابل‌توجهی بر ترمیم ICL دارد، که در مجموع منجر به یک فنوتیپ منحصربه‌فرد می‌شود که ترکیبی از کوتاه‌قدی، حساسیت به نور، و کبد پیشرونده است.اختلال عملکرد کلیه.

نتایج

دو خواهر و برادر با حساسیت به نور، قد کوتاه و اختلال عملکرد کبد و کلیه پیشرونده

خواهر و برادر 1 (PV50LD؛ شکل 1 الف) 13 ساله است، بزرگ‌ترین سه خواهر و برادر از والدین سالم و غیرمرتبط از قومیت‌های مختلط از جمله بومیان استرالیایی، مالتی، و میراث انگلیسی-سلتی. در طول بارداری، مادرش یک کاردیومیوپاتی متسع گذرا داشت که پس از زایمان برطرف شد. او در هفته 39 بارداری به دنیا آمد و وزن هنگام تولد 1.9 کیلوگرم (Z=3.8-)، طول 44 سانتی متر (Z=2.44-) و دور سر 29.5 سانتی متر (Z {{{{ 17}} −3.8). او در دوران نوزادی رشد ضعیفی داشت و در 18 ماهگی، اختلال عملکرد کبد با الگوی عمدتاً کلستاتیک مشاهده شد. سونوگرافی کبد و کلانژیوپانکراتوگرافی رزونانس مغناطیسی طبیعی بود. عملکرد کبد به تدریج کاهش یافت، همانطور که از افزایش تدریجی -گلوتامیل ترانسفراز (GGT)، آلانین ترانس آمیناز (ALT) و سطوح بیلی روبین (شکل S1، A-C) مشهود است. در بیوپسی کبد (در سن 3.5 سالگی)، پارانشیم لوبولار تغییراتی را در مورفولوژی هسته‌ای سلول‌های کبدی نشان داد، با هسته‌های بسیار بزرگ‌تر و سلول‌هایی با هسته‌های دوتایی (شکل S1 D) تا مناطقی که سلول‌ها هسته‌های کوچک و غیرقابل توجهی دارند. فیبروز پورتال خفیف و انبساط پورتال فیبری خفیف و التهاب رابط کانونی خفیف بدون داکتوپنی یا فیبروز پری داکتال وجود داشت (شکل S1 E).

او تعداد زیادی عفونت های مکرر از جمله ورم لوزه، آبله مرغان، بیماری دست و پا و دهان، ذات الریه، برونشیت، و دوره های مکرر تب، درد شکم، و مدفوع رنگ پریده را بدون هیچ دلیلی تجربه کرد. بررسی های ایمونولوژیک هیچ نقص ایمنی را شناسایی نکرد. او دچار اپیزودهایی از حساسیت به نور چشم و پوست شد. در سن 6 سالگی، اختلال عملکرد کلیه، با ویژگی‌هایی حاکی از اختلال عملکرد لوله پروگزیمال با آلبومینوری (محدوده زیر نفروتیک) و هیپرکلسیوری تشخیص داده شد. عملکرد کلیه او با اپیزودهای متناوب نوسان داشتآسیب حاد کلیه، ترقی خواهنارسایی کلیهبا افزایش سطح کراتینین (شکل S1 F)، و حداقل پاسخ به مهار استیل کولین استراز. سونوگرافی کلیه کوچک نشان دادکلیه هابا افزایش اکوژنیسیته و کاهش تمایز کورتیکومدولاری. تست های عملکرد ریه بیماری محدود کننده ریوی خفیف تا متوسط ​​را نشان داد.

نقاط عطف رشد طبیعی بود، اما برخی از مشکلات یادگیری در سن مدرسه مشهود بود و هیچ نشانه ای از پسرفت وجود نداشت. بینایی و شنوایی طبیعی بود. رشد با وجود تغذیه تکمیلی بسیار کند باقی ماند. او تا سن 9.5 سالگی نسبتاً پایدار بود تا زمانی که شواهدی مبنی بر جبران جبران ناپذیر کبد با افزایش تدریجی سطح بیلی روبین (شکل S1 C) و نسبت نرمال شده بین المللی را نشان داد. او در سن 9 سال و 10 ماهگی تحت پیوند کبد ارتوتوپی قرار گرفت. به دنبال پیوند کبد، توبولوپاتی او تثبیت شده است، اگرچه کراتینین سرم او همچنان با سرعت کمتری افزایش می یابد (شکل S1 F). او از نظر بالینی پایدار است. در سن 12 سالگی، نارسایی تخمدان تشخیص داده شد. تصویربرداری رزونانس مغناطیسی مغز (MRI) در سن 12 سالگی آتروفی مغزی خفیف همراه با آتروفی متوسط ​​مخچه و آتروفی خفیف ساقه مغز را نشان داد. در آخرین ارزیابی (در سن 13.5 سال)، رشد آهسته بود (وزن 22.4 کیلوگرم [Z=6.08-] و قد 134.7 سانتی متر [Z=-3.72]). او بدنی بسیار باریک با حجم عضلانی ضعیف و چربی زیر پوستی کمی داشت. او در مناطقی که در معرض آفتاب قرار دارند دچار کک مک شده بود (شکل 1 A). او چشمان کمی عمیق داشت و موهای سرش نازک بود. هیچ ناهنجاری اشعه شعاعی وجود نداشت. معاینه عصبی ضعف خفیف، حداقل آتاکسی و رفلکس های افسرده را نشان داد.

خواهر و برادر 2 (PV46LD؛ شکل 1 A) 11 ساله است، خواهر کوچکتر از خواهر یا برادر 1 است. بارداری به دلیل جفت سرراهی و کاردیومیوپاتی گذرا مادر پیچیده بود و خواهر و برادر 2 در هفته 35 بارداری با وزن تولد به دنیا آمدند. 1.79 کیلوگرم (صدک سوم)، طول 45 سانتی متر (صدک 50) و دور جلو 29 سانتی متر (کمتر از صدک سوم). او مقدار کمی چربی زیر جلدی داشت و ویژگی های صورتش شبیه خواهر یا برادر بزرگترش بود. او ناتوانی در رشد در سال اول زندگی و نارسایی کبد از سن 2 سالگی را نشان داد، با افزایش قابل توجه سطوح GGT، ALT و بیلی روبین (شکل S1، A-C). بیوپسی کبد در سن 6 سالگی آسیب به مجاری صفراوی داخل کبدی را نشان داد که منجر به فیبروز پری داکتال شد. همانند نمونه‌برداری از کبد خواهرش، تعداد متوسطی از سلول‌های کبدی دو هسته‌ای مشاهده شد که برخی از آنها دارای هسته‌های بزرگ و هسته‌های بزرگ بودند.

او دوره هایی از حساسیت به نور چشم و پوست داشت. او یافته هایی از یک توبولوپاتی کلیوی با نارسایی خفیف کلیوی، با افزایش تدریجی سطح کراتینین داشت (شکل S1 F). سونوگرافی کلیه کوچک نشان دادکلیه هابا نفروکلسینوز نقاط عطف رشد طبیعی بود، اما یک ناتوانی ذهنی خفیف (IQ 66) در سن مدرسه تشخیص داده شد. پیشرفت آهسته رو به جلو با نقاط عطف رشد عصبی و بدون رگرسیون قطعی وجود دارد. بینایی و شنوایی طبیعی بود. نارسایی کبد پیشرونده بود و در 8 سالگی تحت پیوند کبد قرار گرفت. MRI مغز در سن 5 سالگی طبیعی بود، اما تکرار MRI در 10 سالگی آتروفی مخچه متوسط ​​و آتروفی مغزی خفیف را نشان داد. در سن 11 سالگی، اندازه گیری استروژن، هورمون محرک فولیکول و هورمون لوتئینیزه کننده الگویی از نارسایی تخمدان را نشان داد. در آخرین ارزیابی در سن 11 سالگی، رشد آهسته بود (وزن 20 کیلوگرم [Z=3.89-] و قد 120.7 سانتی متر [Z=3.17--]). او بدنی بسیار لاغر با حداقل چربی زیر جلدی و حجم عضلانی ضعیف، ویژگی‌های صورت خانوادگی، چشم‌های خفیف عمیق و کک و مک در نواحی در معرض آفتاب داشت (شکل 1 A). او هیچ ناهنجاری اشعه شعاعی نداشت. معاینه عصبی ضعف خفیف همراه با آتاکسی خفیف و عدم وجود رفلکس را نشان داد.

تجزیه و تحلیل مولکولی جهش های جدید دو آللی ERCC1 را شناسایی می کند

Exome sequencing revealed that both siblings harbor a novel missense variant in exon 4 of the ERCC1 gene (p.R156W; c.466C>T) on the paternal allele (Fig. S2 A). The presence of the c.466C>نوع نادرست T با توالی سنگر در هر دو خواهر و برادر مبتلا تایید شد (شکل 1 B). توالی یابی کل ژنوم حذفی را در اگزون 4 بر روی آلل مادر نشان داد (hg19: chr19:45,922,{7}},924,375؛ شکل S2 B) که توسط PCR کمی مقایسه ای (qPCR) اگزون 4 و اگزون تأیید شد. 5 از ERCC1 در هر دو خواهر و برادر و مادر (شکل 1، C و D). حذف، که انتظار می رود یک آلل صفر باشد، نه در پدر و نه در چهار نمونه کنترل منفی تشخیص داده شد (شکل 1 D).

While a previously described pathogenic ERCC1 missense variant (p.F231L; c.693C>G) در دامنه (HhH)2 قرار دارد (شکل 1 E)، نوع اشتباه (p.R156W) در دامنه مرکزی ERCC1 قرار دارد و در نزدیکی جیب اتصال XPA (110-154 aa) قرار دارد. از ERCC1 (شکل 1 E). تجزیه و تحلیل ساختاری دامنه مرکزی ERCC1 یک جیب آبگریز باریک V شکل را نشان داد که یک موتیف کوتاه (67-80 aa) موجود در XPA را متصل می‌کند (شکل 1 F؛ Tsodikov و همکاران، 2007). آمینو اسیدهایی که در ERCC1 محفظه اتصال XPA را می پوشانند (شکل 1 F) برای NER مهم هستند اما برای سایر مسیرهای تعمیر وابسته به ERCC غیرقابل استفاده هستند (اورلی و همکاران، 2010). باقیمانده R156 که در بیماران جایگزین می‌شود درست در زیر پاکت اتصال XPA قرار دارد و یک پل نمک با اسید آمینه مخالف D129 تشکیل می‌دهد (شکل 1 F). بنابراین جایگزینی R156W احتمالاً بر پایداری جیب اتصال XPA تأثیر می گذارد. این امکان وجود دارد که این جایگزینی برهمکنش بین دامنه مرکزی ERCC1 و حوزه نوکلئاز XPF را نیز تضعیف کند (جونز و همکاران، 2020)، و ما پیش‌بینی می‌کنیم که این می‌تواند منجر به بی‌ثباتی خفیف تا متوسط ​​رابط هترودایمر شود. منجر به کاهش پایداری پروتئین می شود.

فیبروبلاست‌های PV46LD و PV50LD نقص شدید NER را نشان می‌دهند. علامت مشخصه کمبود NER حساسیت قوی به تابش UV-C است. برای پرداختن به تأثیر کمبود ERCC1 بر عملکرد NER، فیبروبلاست‌های اولیه را از بیوپسی پوست هر دو خواهر و برادر مبتلا به‌دست آوردیم. برای اجازه دادن به سنجش بقای کلونوژنیک، سلول‌های PV50LD را با معرفی hTERT جاودانه کردیم (شکل S3 A). به عنوان یک کنترل، سلول‌های کامل ERCC1-KO را در سلول‌های RPE1-hTERT توسط CRISPR-Cas9 تولید کردیم (شکل 2 A). سنجش بقای کلونوژنیک UV-C نشان داد که سلول‌های PV50LD-hTERT به تابش UV-C بسیار حساس هستند، اگرچه به اندازه سلول‌های ERCC{15}KO کامل (شکل 2 B) نیستند، که نشان دهنده نقص شدید در NER است.

ضایعات DNA ناشی از اشعه ماوراء بنفش که در طول رونویسی با آنها مواجه می شوند، توسط TCR ترمیم می شوند، که می توان آن را با روش بازیابی سنتز RNA (RRS) اندازه گیری کرد (ناکازاوا و همکاران، 2010). ما RRS را در فیبروبلاست‌های 48 BR (WT)، فیبروبلاست‌های بیمار، و فیبروبلاست‌های اولیه با کمبود XPA (XP1PD) را به عنوان شاهد اندازه‌گیری کردیم. برچسب‌گذاری رونوشت‌های نوپا با ترکیب 5-اتینیل-اوریدین، کاهش شدید ناشی از اشعه ماوراء بنفش را در رونوشت‌های نوپا در تمام رده‌های سلولی در ۳ ساعت پس از UV-C نشان داد. در حالی که 48BR رونویسی را به طور کامل طی 18 ساعت پس از تابش UV-C بازیابی کرد، هر دو فیبروبلاست بیمار حتی کمتر از سلول‌های بیمار XP-A دارای کمبود NER (شکل 2، C و D) بهبود یافتند، که نشان می‌دهد که TCR در این شرایط عملاً وجود ندارد.

برای بررسی فعالیت GGR، ما سنتز DNA برنامه ریزی نشده (UDS) را در سلول های غیرقابل تقسیم اندازه گیری کردیم (ناکازاوا و همکاران، 2010). برای این منظور، فیبروبلاست‌های اولیه به صورت موضعی با نور UV-C تحت تابش قرار گرفتند و به دنبال آن برچسب‌گذاری پالس با آنالوگ تیمیدین 5-اتینیل-دئوکسی‌اوریدین (EdU) برای اندازه‌گیری ترمیم انجام شد. ادغام Clear EdU در سلول‌های 48BR در محل‌های آسیب DNA ناشی از UV محلی شناسایی شد. با این حال، فقط سطوح بسیار پایین ادغام EdU در فیبروبلاست‌های بیمار در سطوح مشابه با فیبروبلاست‌های دارای کمبود XPA (XP1PD؛ شکل 2، E و F) قابل تشخیص بود. سطوح UDS در سلول‌های PV46LD و PV50LD قابل مقایسه یا حتی کمتر از سطوح اندازه‌گیری شده در ERCC{12}}کمبود 165TOR (Jaspers et al., 2007) و CS20LO (Kashiyama et al., 2013) بود که قبلاً توضیح داده شد. سلول هایی که به صورت موازی گنجانده شده اند (شکل 2 G و شکل S3 B). نکته مهم، بیان مجدد ERCC1 برچسب‌گذاری شده با منوها در هر دو فیبروبلاست، ادغام EdU را کاملاً نجات داد (شکل 2، E و F؛ و شکل S3 C)، که تأیید می‌کند که نقص قوی UDS به دلیل کمبود ERCC1 است. ما همچنین فیبروبلاست‌های اولیه را از والدین به‌دست آوردیم که UDS طبیعی را در محل‌های آسیب موضعی UV نشان می‌دهند (شکل 2 H)، که نشان می‌دهد نقص هتروزیگوت ERCC1 مربوطه در والدین به طور کامل توسط آلل WT جبران می‌شود.

فیبروبلاست های PV46LD و PV50LD سطح پروتئین ERCC1 و XPF بسیار پایینی دارند.

NER شامل مونتاژ بسیار هماهنگ و متوالی مجتمع‌های ترمیم DNA است، که طی آن جذب XPA در پایین دست TFIIH اما بالادست ERCC1-XPF انجام می‌شود (Volker et al., 2001). برای پرداختن به اینکه تا چه حد فیبروبلاست‌های بیمار هنوز از مونتاژ کمپلکس NER پشتیبانی می‌کنند، ما فیبروبلاست‌ها را با UV-C به صورت موضعی تحت تابش قرار دادیم و جذب چندین پروتئین NER هسته‌ای را با برچسب‌گذاری ایمونوفلورسانس کنترل کردیم (شکل 3 A، کمی‌سازی، و شکل S3 D). جذب واضح TFIIH، XPA، و ERCC1 در محل‌های آسیب DNA محلی ناشی از اشعه UV در سلول‌های 48BR شناسایی شد، در حالی که سلول‌های XP1PD دارای کمبود XPA نتوانستند ERCC1 را همانطور که قبلا توضیح داده شد، جذب کنند (شکل 3 A و شکل S3 D؛ Volker et. آل.، 2001). هر دو سلول PV46LD و PV50LD به‌کارگیری طبیعی TFIIH و XPA را نشان دادند، در حالی که استخدام ERCC1 در محل‌های آسیب DNA ناشی از UV محلی غیرقابل تشخیص بود (شکل 3 A و شکل S3 D).

از دست دادن محلی سازی ERCC1 می تواند به دلیل شکست در استخدام ERCC1، کاهش عمومی سطح پروتئین ERCC1 یا ترکیبی از این دو باشد. تجزیه و تحلیل وسترن بلات در واقع نشان داد که سطوح حالت پایدار هر دو ERCC1 و XPF به طور چشمگیری در سلول های PV46LD و PV50LD کاهش یافته است (شکل 3 B). با این حال، بیان باقیمانده ERCC1 در مقایسه با سلول‌های کامل ERCC{9} KO هنوز شناسایی شد (شکل 3 B). کاهش سطح پروتئین ERCC1 و XPF در سلول های PV46LD بسیار شبیه به سطوح کاهش یافته در سلول های CS20LO یا 165TOR بود (شکل 3 C و شکل S3، E و F)، که نشان می دهد فنوتیپ شدیدتر در فرد از که این سلول ها مشتق شده اند به دلیل تأثیر قوی تر بر پایداری پروتئین نیست. مطابق با نتایج UDS ما، بیان طبیعی ERCC1 و XPF را در سلول‌های والدین شناسایی کردیم که نشان‌دهنده جبران توسط آلل WT است (شکل 3 D). برچسب گذاری ایمونوفلورسانس تایید کرد که سطح پروتئین ERCC1 و XPF به شدت کاهش یافته است، در حالی که سلول های والدین از سلول های WT قابل تشخیص نیستند (شکل 3 E). کمی کردن داده‌های وسترن بلات نشان می‌دهد که سطوح پروتئین ERCC1 به حدود 20 درصد فیبروبلاست‌های بستری کاهش یافته است، همچنین منجر به کاهش مشابه سطوح XPF می‌شود (تقریبا 20 درصد؛ شکل 3 F).

ضربه زدن به نوع اشتباه R156W منجر به ناپایداری ERCC1-پروتئین XPF و نقص شدید NER می‌شود.

این وسوسه انگیز است که حدس بزنیم که سطوح پایین پروتئین حالت پایدار ERCC1-XPF و نقص قوی NER در فیبروبلاست های بیمار توسط جایگزینی اسید آمینه R156W در ERCC1 ایجاد می شود. با این حال، با توجه به اینکه افراد مبتلا خواهر و برادر هستند، نمی‌توانیم ویژگی‌های ژنتیکی دیگر مشترک بین آنها را نیز در ایجاد این فنوتیپ رد کنیم.

To directly assess this, we decided to generate knock-in lines (KIs) carrying the R156W amino acid substitution in RPE1- hTERT cells using CRISPR-Cas9 technology. We obtained homozygous KI clones carrying the patient mutation in ERCC1 (p.R156W; c.466C>T)، که توسط توالی یابی Sanger در دو کلون منفرد تأیید شد (شکل 4 A). جهش نادرست باعث کاهش شدید سطوح پروتئین ERCC1 و XPF در هر دو کلون KI شد (کلون های 2-17 و 2-51؛ شکل 4 B و شکل S4، A و B). کمی‌سازی داده‌های وسترن بلات نشان داد که سطح پروتئین ERCC1 و XPF تقریباً به اندازه سلول‌های ERCC{9}}KO پایین بود (شکل 4 C). این یافته ها نشان می دهد که جایگزینی اسید آمینه R156W تأثیر قوی بر پایداری ERCC1 دارد.

برای اثبات بیشتر اینکه نقص NER در فیبروبلاست‌های بیمار ناشی از جایگزینی اسید آمینه R156W در ERCC1 است، ما فعالیت TCR را با نظارت بر شروع مجدد رونویسی پس از تابش UV اندازه‌گیری کردیم. در حالی که سلول‌های RPE{2}}hTERT والدین شروع مجدد طبیعی را در 18 ساعت پس از UV نشان دادند، هر دو کلون R156W-KI یک نقص TCR قوی قابل مقایسه با سلول‌های KO کامل ERCC1- را نشان دادند (شکل 4، D و E). به طور مشابه، آزمایش‌های UDS فعالیت طبیعی GGR را در سلول‌های RPE{8}hTERT والدین نشان داد که در هر دو کلون R156W-KI و سلول‌های ERCC{12}KO به شدت زیر 10 درصد کاهش یافت (شکل 4، F و G) . در نهایت، ما حساسیت UV یک کلون R156W-KI (2-51) را در مقایسه با فیبروبلاست PV50LD بیمار جاودانه‌شده با hTERT اندازه‌گیری کردیم. سلول‌های R156W-KI یک فنوتیپ قوی حساس به UV را نشان دادند، اگرچه به اندازه سلول‌های KO کامل ERCC{23} حساس نبودند (شکل 4 H). جالب توجه است که فنوتیپ حساس به UV R156W-KI بسیار شبیه به فیبروبلاست های بیمار PV50LD-hTERT بود. این یافته ها نشان می دهد که سطوح پایین پروتئین ERCC{30}}XPF و نقص قوی NER پیامد مستقیم جایگزینی اسید آمینه R156W در ERCC1 است.

جایگزینی ERCC1R156W باعث محلی سازی جزئی سیتوپلاسمی می شود

فیبروبلاست‌های بیمار و سلول‌های KI به طور چشمگیری کاهش سطح پروتئین و کاهش شدید فعالیت NER را نشان می‌دهند. در مرحله بعد می خواستیم بررسی کنیم که آیا نقص NER فقط به دلیل کاهش سطح پروتئین ERCC1-XPF ایجاد می شود یا اینکه پروتئین جهش یافته ERCC1R156W فعالیت آن را به عنوان اندونوکلئاز یا در NER کاهش داده است.

برای رفع این مشکل، سلول‌های ERCC1-KO را توسط CRISPR Cas9 در سلول‌های U2OS مجهز به سیستم Flp-In/T-Rex تولید کردیم. با استفاده از نوترکیبی مبتنی بر Flp، ما cDNA‌هایی را که ERCC1WT یا ERCC1R156W با برچسب GFP را کد می‌کنند به سایت هدف شناسایی Flp ژنومی (FRT) هدف قرار دادیم تا بیان القایی از یک پروموتر ویروسی قوی را فعال کنیم. تجزیه و تحلیل وسترن بلات نشان داد که ERCC1WT و ERCC1R156W در سطوح مشابهی بیان می‌شوند و بیان هر یک از پروتئین‌ها کاهش سطح پروتئین XPF مشاهده شده در سلول‌های ERCC{14}} KO را نجات می‌دهد (شکل 5 A). بنابراین، این سلول‌ها یک سیستم مدل عالی برای تفکیک تأثیر خاص جایگزینی ERCC1R156W هستند که در سطوح WT از تأثیر بیان کمتر ERCC1 در فیبروبلاست‌های بیمار و سلول‌های اپیتلیال KI بیان می‌شوند.

مطالعات قبلی نشان داده‌اند که جهش‌های نادرست در XPF می‌توانند باعث جابجایی نادرست ERCC{0}}XPF در سیتوپلاسم شوند (احمد و همکاران، 2010). مطابق با این، ما همچنین تشخیص دادیم که حدود 40 درصد از پروتئین ERCC1R156W به اشتباه در سیتوپلاسم جاسازی شده است، که تنها حدود 15 درصد در سلول های بیان کننده ERCC1WT بود (شکل 5، B و C). این مکان یابی نادرست ERCC1 همچنین باعث افزایش کسری از XPF سیتوپلاسمی شد (شکل 5، B و C)، که نشان می دهد ERCC1R156W ممکن است تا حدی اشتباه باشد.

برای آزمایش این امکان، آزمایش‌های رسوب ایمنی را روی ERCC1WT-GFP و ERCC1R156W-GFP انجام دادیم و سپس طیف‌سنجی جرمی بدون برچسب کمی (MS) را برای نقشه‌برداری برهم‌کنش‌های دیفرانسیل دو پروتئین ERCC1 انجام دادیم. نکته مهم، MS کمی تایید کرد که مقادیر مساوی از پروتئین ERCC1WT-GFP و ERCC1R156W-GFP پایین کشیده شد (شکل 5 D). به طور قابل توجهی، اینتراکتوم ERCC1R156W برای پروتئین های شوک حرارتی (HSPs)، به ویژه برای خانواده HSPA غنی شد، در حالی که تعامل با XPF در مقایسه با ERCC1WT (شکل 5 D) از نظر کمی کاهش یافت. پروتئین‌های HSPA، چاپرون‌های تاشونده پروتئینی هستند که از تجمع پروتئین‌های اشتباه تا شده جلوگیری می‌کنند (استتلر و همکاران، 2010). آزمایش‌های تشدید ایمنی (Co-IP) در واقع تأیید کرد که ERCC1R156W-GFP به شدت با HSPA4 در مقایسه با ERCC1WT (شکل 5 E) تعامل دارد، که نشان‌دهنده تا زدن نادرست ERCC1R156W است.

برای بررسی میزان فعال بودن ERCC1R156W-XPF به عنوان اندونوکلئاز، ما کمپلکس نوترکیب را از سلول های حشره Sf9 خالص کردیم (شکل S4 C). روش قبلی ما شامل یک مرحله فیلتراسیون ژل است که به ما امکان می دهد ارزیابی کنیم که آیا ERCC1-XPF در حالت دایمری یا تجمعی است (شکل 5 F، بخش های 2 و 1، به ترتیب). بازده کمپلکس نوترکیب ERCC1R156W XPF کمتر بود و سطح بالاتری از پروتئین تجمعی را نشان داد. علاوه بر این، ما همچنین متوجه کاهش کسر پروتئین هترودیمری در مقایسه با ERCC1WT-XPF شدیم (شکل 5 F). با این وجود، ERCC1R156W-XPF هترودیمری نوترکیب در کسر 2 زمانی که با یک بستر DNA مدل ساقه حلقه انکوبه شد، کاملا فعال بود، در حالی که ERCC{20}}XPFD687A غیرفعال کاتالیستی، که به عنوان کنترل منفی گنجانده شد، فاقد فعالیت برش بود (شکل . 5 گرم). این یافته‌ها نشان می‌دهد که ERCC1R156W-XPF تا حدی به اشتباه تا شده و به‌طور نادرست موضع‌گیری شده است، اما بخش پروتئینی که به‌درستی تا می‌شود همچنان به عنوان اندونوکلئاز فعال است.

پروتئین جهش یافته ERCC1R156W نمی تواند به طور موثر با فاکتورهای اصلی NER تعامل کند.

ما در مرحله بعد به چگونگی تأثیر جایگزینی ERCC1R156W بر NER با استفاده از سلول‌های ERCC{2}}کو بازسازی‌شده پرداختیم. از آنجایی که جایگزینی R156W درست در زیر محفظه اتصال XPA در ERCC1 قرار دارد (شکل 1 F)، ما پرسیدیم که آیا ERCC1R156W همچنان می‌تواند با پروتئین‌های NER در پاسخ به تابش UV تعامل داشته باشد یا خیر. برای آزمایش این، ما ERCC1WT-GFP، ERCC1R156W-GFP، یا GFP را که به سیگنال محلی سازی هسته ای (GFP-NLS) ادغام شده بودند، به عنوان کنترل از سلول های تحت تابش اشعه ماوراء بنفش ایمن سازی کردیم و متعاقبا MS بدون برچسب را انجام دادیم. با مقایسه ERCC{17}}GFP با GPF-NLS، متقابل‌های سازنده و همچنین متقابل ناشی از UV ERCC1 را شناسایی کردیم. تجزیه و تحلیل ما نشان داد که هر دو ERCC1WT و ERCC1R156W با XPF و پروتئین‌های داربست مخصوص تعمیر ICL SLX4 و SLX4IP تعامل دارند، البته در سلول‌های بیانگر ERCC1R156W به طور کمی کاهش یافته است (شکل 6، A و B). به طور شگفت انگیزی، تعامل ناشی از UV با زیرواحد TFIIH XPB در سلول های ERCC1WT به طور کامل در سلول های ERCC1R156W از بین رفت (شکل 6، A و B). آزمایشات Co-IP تأیید کرد که ERCC1R156W در پاسخ به تابش اشعه ماوراء بنفش با TFIIH یا XPA شکست خورده است، در حالی که فعل و انفعالات قوی پس از پایین کشیدن ERCC1WT شناسایی شد (شکل 6 C و شکل S4، D و E).

استخدام ERCC1-XPF به کمپلکس‌های NER کاملاً به XPA وابسته است (Volker et al., 2001)، این سؤال را مطرح می‌کند که آیا ERCC1R156W هنوز در مکان‌های آسیب DNA ناشی از اشعه UV به کار گرفته می‌شود. برای پرداختن به این موضوع، جذب ERCC1-GFP به ضایعات DNA ناشی از اشعه ماوراء بنفش را با استفاده از تصویربرداری سلول زنده نظارت کردیم. برای این منظور، سلول‌ها با لیزر UV-C ({9}}nm) تابش شدند، که باعث جذب سریع ERCC1WT-GFP در 60 ثانیه اول پس از تابش شد، و در حدود 120 ثانیه به فلات رسید (شکل 6، D و E). در مقابل، تنها جذب بسیار ضعیف ERCC1R156W-GFP را می توان با تابش UV-C با استفاده از شرایط یکسان تشخیص داد (شکل 6، D و E). این یافته ها نشان می دهد که ناتوانی ERCC1R156W در تعامل با XPA ارتباط آن را با کمپلکس NER به شدت محدود می کند.

یافته‌های ما در سلول‌های بازسازی‌شده ERCC1-KO نشان می‌دهد که ERCC1R156W همچنان از فعالیت تعمیر باقی‌مانده (تقریباً 40 درصد) در سطوحی مشابه با ERCC1WT پشتیبانی می‌کند. برای اندازه‌گیری ترمیم باقی‌مانده در فیبروبلاست‌های اولیه PV46LD و PV50LD، که بیانگر کاهش شدید پروتئین جهش یافته ERCC1R156W بود، آزمایش‌های UDS را انجام دادیم که در آن به سلول‌ها اجازه دادیم تا EdU را برای مدت زمان طولانی (4 ساعت) ترکیب کنند تا ترمیم باقی‌مانده را ضبط کنند. . در حالی که UDS در سلول های XP1PD دارای کمبود XPA هنوز کمتر از 10 درصد بود، در سلول های PV46LD و PV50LD UDS از 10 درصد به 20 درصد UDS تحت این شرایط افزایش یافت (شکل 6 J و شکل S5 A). این یافته‌ها نشان می‌دهد که پروتئین جهش یافته ERCC1R156W، که در سطوح پایین در سلول‌های بیمار بیان می‌شود، از فعالیت باقی‌مانده NER پشتیبانی می‌کند، که احتمالاً ویژگی‌های بالینی خفیف XP مانند دیده‌شده در هر دو خواهر و برادر را توضیح می‌دهد. تحت این شرایط، ما همچنین UDS باقیمانده را در سلول‌های 165TOR (جاسپرز و همکاران، 2007) و CS20LO (Kashiyama و همکاران، 2013) با کمبود ERCC که قبلا شرح داده شده بود در سطوحی حتی بالاتر از سلول‌های PV46LD و PV50LD شناسایی کردیم. (شکل 6 J و شکل S5 A).

تاثیر ERCC1R156W در تعمیر ICL

در طول تعمیر ICL، پروتئین داربست SLX4 از ERCC1-XPF برای انجام برش‌های باز کردن قلاب که امکان ترمیم بعدی را فراهم می‌کند، استفاده می‌کند. تجزیه و تحلیل MS ما نشان داد که ERCC1R156W همچنان با SLX4 تعامل دارد، البته در سطوح کاهش یافته در مقایسه با ERCC1WT (شکل 6، A و B). آزمایشات Co-IP در واقع برهمکنش قوی ERCC1WT با SLX4 را تایید کرد، که تحت تأثیر تابش UV قرار نگرفت، در حالی که تعامل با ERCC1R156W به شدت کاهش یافت (شکل 7 A). برای بررسی اینکه آیا این کاهش تعامل بر جذب ERCC1 به ICL تأثیر می‌گذارد، ما سلول‌ها را به صورت موضعی با لیزر UV-A (365 نانومتر) در حضور تری اکسسالن، که یک مشتق پسورالن است که ICLs را در تابش UV تشکیل می‌دهد، تابش کردیم (Velimezi et al. ، 2018). تابش موضعی با لیزر UV-A باعث به‌کارگیری FANCD2 درون‌زا فقط در سلول‌های حساس‌شده با تریاکسالن شد، که نشان می‌دهد ICLs تحت شرایط ما القا شده‌اند (شکل S5 B). ما می‌توانیم استخدام قوی GFP-ERCC1WT-GFP در ICLهای محلی را تشخیص دهیم، در حالی که استخدام ERCC1R156W بسیار ضعیف‌تر بود (شکل 7، B و C)، که نشان می‌دهد کاهش تعامل با SLX4 کارایی استفاده از ERCC1R156W را نیز کاهش می‌دهد. ICL ها با این حال، سنجش بقای کلونوژنیک پس از قرار گرفتن در معرض عامل القاکننده ICL میتومایسین C (MMC) نشان داد که ERCC1R156W حساسیت بیش از حد سلول‌های ERCC{31}KO به MMC را نجات داد، اگرچه کمی کمتر از ERCC1WT (شکل 7 D). این آزمایش‌ها نشان می‌دهند که پروتئین جهش یافته ERCC1R156W از تعمیر ICL نزدیک به سطوح WT پشتیبانی می‌کند، زمانی که پروتئین جهش یافته سطوح تقریباً طبیعی بیان می‌شود.

برای پرداختن به اینکه آیا فیبروبلاست‌های بیمار PV46LD و PV50LD، که کاهش قابل‌توجهی بیان ERCC1R156W را نشان می‌دهند، هنوز از تعمیر کارآمد ICL پشتیبانی می‌کنند، ما یک سنجش شکست کروموزوم ناشی از MMC را انجام دادیم. این روش شکست های کروموزوم ناشی از MMC را در سلول های متافاز ناشی از نقص در ترمیم ICL اندازه گیری می کند. در حالی که سلول های 48BR (WT) شکست های بسیار کمی را پس از MMC انباشته کردند، ما شکست کروموزوم های ناشی از MMC را در سلول های WK8103 مشتق از بیمار فانکونی اندازه گیری کردیم (Poll et al., 1984; Fig. 7 E). هر دو PV46LD و PV50LD یک فنوتیپ میانی با افزایش تشکیل شکست در پاسخ به MMC نشان دادند، اگرچه نه به همان میزان سلول های فانکونی (شکل 7 E). مطابق با این، سلول‌های PV50LD-hTERT و سلول‌های RPE{17}hTERT R156W-KI در سنجش‌های بقای کلونوژنیک به MMC حساس بودند، در حالی که سلول‌های VU121F-hTERT دارای کمبود FANCF (Joenje و همکاران، 1997) و به‌ویژه ERCC{17} {24}}سلول‌های KO به MMC حساس بودند (شکل 7 F). در نتیجه، بیان کمتر ERCC1R156W و کاهش تعامل با SLX4 تأثیر قابل‌توجهی بر ترمیم ICL دارد، اگرچه سلول‌های بیمار تقریباً به اندازه سلول‌های Fanconi یا کامل ERCC{29}KO حساس نیستند. این احتمالاً توضیح می دهد که چرا هیچ ویژگی مشابه FA در این دو خواهر و برادر آشکار نیست.

تاثیر ERCC1R156W در تعمیر DSB

با توجه به نقش ERCC1-XPF در تعمیر DSB، همچنین به این موضوع پرداختیم که ERCC1R156W هنوز تا چه حد از این فرآیند تعمیر پشتیبانی می‌کند. برای این منظور، ما تصویربرداری سلول زنده را پس از تابش لیزر UV-A در سلول های حساس شده با BrdU برای تولید DSB های محلی انجام دادیم (لوکاس و همکاران، 2003). به کارگیری XRCC4 درون زا را می توان در مکان های تابش لیزر موضعی UV-A تنها پس از حساس شدن BrdU (شکل S5 C) شناسایی کرد، که نشان می دهد DSB ها تحت شرایط ما القا شده اند. استخدام ERCC1WT-GFP در سایت های DSB به وضوح شناسایی شد، در حالی که این برای ERCC1R156W بسیار ضعیف تر بود (شکل 8، A و B). با این حال، سنجش بقای کلونوژنیک پس از پرتوهای یونیزان (IR) هیچ تفاوتی بین سلول‌های ERCC{14}}KO بازسازی‌شده با ERCC1WT یا ERCC1R156W (شکل 8 C) نشان نداد، که نشان می‌دهد پروتئین جهش یافته ERCC1 از تعمیر DSB پشتیبانی می‌کند.

همچنین برای رسیدگی به این موضوع در سلول‌های بیمار، سنجش‌های بقای کلونوژنیک را در فیبروبلاست‌های جاودانه‌شده با hTERT پس از قرار گرفتن در معرض دوزهای فزاینده IR انجام دادیم. فیبروبلاست های کمبود XRCC4 (CS16NG-hTERT؛ Guo و همکاران، 2015) به وضوح به IR در کمترین دوز (2 گری) حساس بودند. با این حال، سلول های PV50LD-hTERT در 2 گری خیلی حساس نبودند و فقط در دوزهای بالاتر حساسیت بیشتری نشان دادند (شکل 8 D). در واقع، سلول‌های کامل ERCC{10}}KO و سلول‌های R156W-KI فقط حساسیت حاشیه‌ای را به IR نشان می‌دهند (شکل S5 D)، که نشان‌دهنده کمک جزئی ERCC{14}}XPF برای محافظت از سلول‌ها در برابر IR است. روش دیگر برای ارزیابی ظرفیت تعمیر DSB، نظارت بر وضوح کانون های H2AX ناشی از IR در زمان است. هر دو فیبروبلاست 48BR و بیمار، پاکسازی طبیعی کانون های H2AX را در عرض 24 ساعت پس از تابش با دوز فیزیولوژیکی 2 گری نشان دادند (شکل 8، E و F؛ و شکل S5 E). با این حال، درمان سلول های 48BR با مهار کننده پروتئین کیناز وابسته به DNA (DNA-PK) وضوح کانونی H2AX را در تمام نقاط زمانی تجزیه و تحلیل شده به طور کامل سرکوب کرد (شکل 8، E و F). این یافته ها نشان می دهد که سلول های PV46LD و PV50LD در تعمیر DSB تحت بار آسیب کم کاملاً مهارت دارند.