نشانگرهای کیفیت Cistanches Herba بر اساس رابطه طیف اثر آنتی اکسیدانی

خلاصه

هدف: ایجاد روش تحقیق برای نشانگرهای کیفیت (Q-markers)Cistanches Herba(CH) بر اساسرابطه طیف اثر آنتی اکسیدانی، زمینه ای را برای مطالعه مواد دارویی و کنترل کیفیت آن فراهم می کند. روش‌ها: کروماتوگرافی مایع با عملکرد فوق‌العاده بالا (UPLC) برای ایجاد نمایه‌های اثر انگشت برای 10 دسته CH استفاده شد. یک مدل آسیب اکسیداتیو سلولی با استفاده از H2O2 ایجاد شد، و ظرفیت آنتی اکسیدانی CH بر اساس نیمه حداکثر غلظت مهاری گونه‌های اکسیژن فعال، و همچنین سطوح سوپراکسیدیسموتاز و کاتالاز به عنوان شاخص‌های دارویی تعیین شد. رابطه طیف-اثر از طریق تحلیل مولفه اصلی، تحلیل همبستگی پیرسون و تحلیل رگرسیون حداقل مربعات جزئی ایجاد شد. اجزای فعال در معرض اعتبار دارویی قرار گرفتند. نتایج: پروفایل های اثرانگشت برای CH با استفاده از UPLC ایجاد شد و 17 قله رایج را شناسایی کرد. بر اساس تحلیل همبستگی طیف-اثر، 9 مؤلفه انتخاب شد. نتایج تأیید فارماکولوژیک نشان داد که ژنیپوزیدیک اسید، 8-اپیلوگانیک اسید،اکیناکوزید, اکتئوزید,ایزواکتئوزید، وتوبولوزید Aفعالیت آنتی اکسیدانی را به صورت وابسته به غلظت نشان داد. نتیجه‌گیری: این مطالعه نشانگرهای Q را برای CH بر اساس رابطه طیف-اثر بررسی کرد و اطلاعات مرجع را برای پایه ماده دارویی و بهبود استاندارد کیفیت آن ارائه کرد.

کلید واژه ها:سیستانچس هربا; نشانگر Q;رابطه طیف - اثر; آنتی اکسیدان

عصاره ارگانیک سیستانچ با 30% اکیناکوزید و 12% آکتئوزید برای عملکرد کلیه

سیستانچساقه گوشتی خشک شده با برگ های فلس دار Cistanche deserticola YCMa یا Cistanche tubulosa (Schenk) Wight، گیاهی متعلق به جنس Cistanche از خانواده Orobanchiaceae است. اولین بار در "Shen Nong's Materia Medica" ثبت شد و به عنوان درجه برتر فهرست شده است [1]. طبع آن گرم، طعم شیرین و شور است. به مریدین های کلیه و روده بزرگ باز می گردد. دارای اثرات تغذیه کننده یانگ کلیه، تامین کننده جوهر و خون، مرطوب کننده روده و ملین است و داروی مهمی برای تقویت کلیه و تامین کننده اسانس [2-3] است. کلیه ها ذات را ذخیره می کنند و جوهر و خون از یک منبع می آیند. در صورت کمبود جوهر و خون، بر فعالیت های کلی زندگی بدن انسان تأثیر می گذارد. مغز مولد جوهر در استخوان ها ذخیره می شود و مغز دریای مغز است. اگر جوهر کلیه ناکافی باشد، استخوان ها تغذیه خود را از دست می دهند و مغز دچار کمبود می شود و در نتیجه تغییرات تخریبی استخوان مانند شل شدن بافت، از دست دادن دندان، از دست دادن حافظه، زوال عقل و کاهش عملکرد سیستم ایمنی بدن ایجاد می شود [4-6]. سیستانش دسرتیکولا حاوی گلیکوزیدهای فنیل اتانول، ایریدوئیدها، لیگنان ها و سایر اجزای ساختاری از جمله اکیناسید، ورباسکوزید، ایزورباسکوزید، جنیپینیک اسید و اسید اپیستریانیک است. ، توبولین A و غیره [7]. کنترل کیفی فعلی سیستانچ دسرتیکولا در نسخه 2020 "فارماکوپه جمهوری خلق چین" فقط محتوای اکیناسید و ورباسکوزید را مشخص می کند که نمی تواند به طور کامل ویژگی های عمل چند جزئی و چند هدفی طب سنتی چینی را منعکس کند. که برای کنترل و ارزیابی کیفی آن مساعد نیست.

به منظور بهبود سطح کنترل کیفیت طب سنتی چینی و بهینه سازی ارزیابی کیفیت طب سنتی چینی، آکادمیسین لیو چانگ شیائو مفهوم جدید نشانگر کیفیت (Q-مارکر) طب سنتی چینی را پیشنهاد کرد [8]. در میان آنها، "اثربخشی" عنصر اصلی در "پنج اصل" نشانگر Q [9] است و همچنین هسته اصلی ارزیابی کیفیت داروهای سنتی چینی است.

با توجه به وضعیت تحقیقاتی فعلی در رابطه ضعیف بین استانداردهای کیفیت و اثربخشی دارو، بررسی نشانگرهای Q داروهای سنتی چینی و ایجاد استانداردهای کیفی علمی و معقول‌تر برای بهبود کیفیت داروهای سنتی چینی اهمیت زیادی دارد. رابطه طیف-اثر این است که پیک های کروماتوگرافی اثر انگشت طب سنتی چینی را با داده های فارماکودینامیک خاص برای یافتن مواد موثر طب سنتی چینی پیوند می دهد، در نتیجه کیفیت ذاتی طب سنتی چین را منعکس می کند [10]. ایجاد یک مدل ریاضی بازده طیفی می‌تواند QMarker طب سنتی چینی را از دیدگاه «کل‌نگر» روشن کند، و مرجع بیشتری برای کنترل کیفیت بعدی طب سنتی چینی، فرمول‌بندی استانداردهای کیفیت و غربالگری مواد فعال فراهم کند. این مطالعه از اثر انگشت ترکیب شده با نرخ نیمه بازداری گونه‌های اکسیژن فعال (ROS IC50)، محتوای سوپراکسید دیسموتاز (SOD) و کاتالاز (CAT) برای مطالعه رابطه طیف اثر طب سنتی چینی استفاده می‌کند و از تجزیه و تحلیل اجزای اصلی استفاده می‌کند. (PCA) ، تجزیه و تحلیل همبستگی پیرسون (PCC) و تجزیه و تحلیل رگرسیون حداقل مربعات جزئی (PLS) برای تجزیه و تحلیل جامع نشانگر Q از Cistanche deserticola برای ارائه مبنایی برای کنترل کیفیت آن.

1 ماده

1.1 نمونه

Cistanche deserticolaاز شهرستان Yutian، سین کیانگ و پایگاه کاشت Cistanche deserticola خوب کشاورزی (GAP) در مغولستان داخلی برداشت شد. توسط محقق Zhang Tiejun از موسسه تحقیقات دارویی تیانجین با نام های Cistanche tubulosa (Schenk) Wight و Cistanche deserticola شناسایی شد.

YC Ma، اطلاعات دقیق در جدول 1 نشان داده شده است.

1.2 آزمایش پزشکی

Echinaceaside (تعداد دسته: 111670-201907، خلوص: 91.8%) و verbascoside (تعداد دسته: 111530-201914، خلوص: 95.2%) هر دو از موسسه کنترل غذا و داروی چین خریداری شدند. ایزورسکوزید (شماره دسته: 61303-13 -7)، سالیدروسید (شماره دسته: 10338-51-9)، 8-اپیستریکنوئیک اسید (شماره دسته: 82509-41-9)، جنیپینیک اسید (شماره دسته: Z24A10X95926) , tuberosin B (شماره دسته: 112516-04-08)، 2-استیل اوژنول گلیکوزید (شماره دسته: 94492-24-7) از Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., با خلوص بیشتر از یا برابر با 98 درصد؛ سیستانچ گلیکوزید A (شماره دسته: MUST -20062806، خلوص: 98.51%) و واسکولین A (شماره دسته: MUST19110102، خلوص: 98.57%) از Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd. خریداری شد. استونیتریل و اسید فرمیک خالص از نظر کروماتوگرافی از شرکت Tianjin Concord Technology Co., Ltd. خریداری شد. آب تصفیه شده (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.). ویتامین E (VE، V8010، Beijing Solarbio Company)؛

دی متیل سولفوکسید (DMSO, D{0}}ML, Sigma Company, USA); کیت تشخیص تکثیر سلولی تک محلول آبی CellTiter 96® (G3580، Promega Company، ایالات متحده). کیت تشخیص CAT (S0051)، کیت تشخیص فعالیت SOD S0101M) و کیت تشخیص ROS (S0033S) از شرکت بیوتکنولوژی Shanghai Biyuntian خریداری شد.

1.3 ابزار

کروماتوگرافی مایع با عملکرد فوق العاده بالا واترز کلاس H-PDA (شرکت واترز، ایالات متحده); تراز الکترونیکی Sartorius BT25S (شرکت سارتوریوس، آلمان)؛ سانتریفیوژ رومیزی پرسرعت H1650 (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.); SpectraMax M5

میکروپلیت خوان (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.); میکروسکوپ بیولوژیکی WYS-41XDY (شرکت ابزار اپتیکال ابزار میکرو تیانجین، آموزشی ویبولیتین).

1.4 سلول

در این آزمایش از سلول های کلیه جنینی انسان HEK 293 استفاده شد و از بانک سلولی آکادمی علوم چین خریداری شد.

2 روش

2.1 ایجاد نقشه اثر انگشت

2.1.1 تهیه محلول آزمایش: 2 گرم ماده دارویی Cistanche deserticola را وزن کرده، 1{8}} برابر آب اضافه کنید، 3 بار حرارت دهید و رفلاکس کنید، هر بار 1 ساعت، سانتریفیوژ کنید.{16}} × 105r·min{10}} به مدت 15 دقیقه (شعاع گریز از مرکز 300 میلی متر است)، مواد رویی را با هم ترکیب کرده و غلیظ کنید تا محلولی با غلظت جرمی 100 mg·mL{14}} درست کنید، آن را 10 بار رقیق کنید. و آن را از طریق یک غشای فیلتر ریز متخلخل 0.22 میکرومتر برای بدست آوردن آن فیلتر کنید.

2.1.2 تهیه محلول مرجع مخلوط

8-اپیستریکنیک اسید، سالیدروسید، اکیناسید، سیستانش گلیکوزید A، جنیپینیک اسید، ورباسکوزید، آنتوسیانوزید A، ایزورباسکوزید و 2'-استیل اوژنول را مصرف کنید. گلیکوزید و ماده مرجع آنژیوزید B در مقادیر مناسب اندازه گیری و به دقت وزن شدند. محلول متانول 50% را برای حل شدن اضافه کنید و محلول مخلوطی از ماده مرجع با غلظت جرمی 20 میکروگرم در میلی لیتر-1 تهیه کنید.

2.1.3 شرایط کروماتوگرافی

ستون ACQUITY UPLC®BEH C18 (100 میلی‌متر × 2.1 میلی‌متر، 1.7 میکرومتر)؛ فاز متحرک استونیتریل (A) ~ 0.1% محلول اسید فرمیک (B)، برنامه شستشوی گرادیان (0 ~ 6 دقیقه، 5% ~ 8% A ؛ 6~10 دقیقه، 8% ~ 15% A است. 10~13 دقیقه، 15%~19%A، 13~20 دقیقه، 19%~25%A)؛ طول موج تشخیص 237 نانومتر است. سرعت جریان 0.4 میلی لیتر · دقیقه -1 است. دمای ستون 40 درجه است. حجم تزریق 3 میکرولیتر است.

2.1.4 انتخاب اوج مرجع

در کروماتوگرافی مایع فوق عملکرد (UPLC) Cistanche deserticola، پیک با بیشترین نسبت سطح پیک، زمان ماند متوسط ​​و جداسازی خوب به عنوان پیک مرجع طیف اثر انگشت انتخاب شد.

2.1.5 بررسی روش شناختی

آزمایش دقیق: نمونه T1 را بگیرید و محلول آزمایش را طبق روش زیر 2.1.1 آماده کنید. نمونه را 6 بار به طور مداوم تزریق کنید و اثر انگشت را ثبت کنید. نتایج نشان می‌دهد که مساحت پیک نسبی RSD هر پیک 0.10%~4.61% است و زمان ماند نسبی RSD 0.08% ~ 1.32% است که نشان می‌دهد ابزار خوب است. دقت، درستی.

تست تکرارپذیری: نمونه T1 را گرفته و طبق روش زیر 2.1.1 6 نمونه از محلول آزمایش را به صورت موازی تهیه کنید و نمونه را به طور مداوم تزریق کنید. نتایج نشان می‌دهد که سطح پیک نسبی RSD هر پیک کروماتوگرافی 1.35%~4.80% و زمان ماندن نسبی RSD 0.10%~1.80% است که الزامات اثر انگشت را برآورده می‌کند و نشان می‌دهد که تکرارپذیری ساز خوب است

تست پایداری: نمونه T1 را بگیرید و محلول آزمایش را طبق روش زیر 2.1.1 آماده کنید، نمونه ها را برای آزمایش در ساعت های 0، 2، 4، 8 و 12 تزریق کنید و اثر انگشت را ثبت کنید. RSD محاسبه‌شده ناحیه پیک نسبی هر پیک کروماتوگرافی 0.53%~4.82% است و RSD زمان ماند نسبی 0.09%~2.17% است که الزامات را برآورده می‌کند. اثر انگشت را نشان می دهد و نشان می دهد که محصول آزمایشی در عرض 12 ساعت پایدار است.

2.2 تحقیق در مورد اثر آنتی اکسیدانی Cistanche deserticola

2.2.1 تهیه مشروب مادری Cistanche deserticola

مشروب مادر را در قسمت 2.1.1 گرفته و فیلتر و استریل کنید و قبل از استفاده با محیط کشت تا غلظت لازم رقیق کنید.

2.2.2 Cistanche deserticola و شاهد مثبت

اثر VE بر زنده ماندن سلول های HEK 293 به عنوان گروه نرمال (سوسپانسیون سلولی)، گروه تجویز Cistanche deserticola (25، 50، 100، 200، 400 μg·mL-1)، گروه VE (20، 40، 60) تنظیم شد. 80، 100μmol·L-1)، 6 چاهک تکراری را برای هر غلظت تنظیم کنید، کشت را به مدت 24 ساعت انجام دهید، 20 میکرولیتر از معرف تک محلول آبی CellTiter 96® را به هر چاه اضافه کنید تا زنده ماندن سلول را شناسایی کنید، به مدت 2 ساعت به کشت ادامه دهید. و از یک میکروپلیت خوان برای تشخیص زنده ماندن سلول در 490 نانومتر استفاده کنید. مقدار جذب (OD) هر چاهک برای محاسبه میزان بقای سلول طبق فرمول (1) استفاده شد. میزان بقا (%)=(گروه آزمایشی OD/گروه خالی OD) × 100% (1)

2.2.3 Cistanche deserticola در القای H2O2

اثر ROS بر سلول های HEK 293. سلول ها به دو گروه نرمال (سوسپانسیون سلولی) و گروه تجویز سیستانش دسرتیکولا (25/6، 5/12، 25، 50، 100 میکروگرم در میلی لیتر-1 سیستانچ دسرتیکولا و 60 میکرومتر در لیتر-1 H2O2) تقسیم شدند و 24 ساعت کشت شدند. مراحل کیت تشخیص ROS را برای عملیات های بعدی دنبال کنید، رنگ آمیزی سلول را مستقیماً از طریق میکروسکوپ مشاهده کنید و از یک میکروپلیت خوان برای تشخیص شدت فلورسانس هر گروه استفاده کنید. تنظیمات پارامتر از طول موج تحریک 488 نانومتر و طول موج انتشار 525 نانومتر استفاده کردند. آزمایش سه بار تکرار شد.

2.2.4 جفت Cistanche deserticola

اثر H2O2 بر SOD در سلول های HEK 293. سلول ها به گروه های نرمال (سوسپانسیون سلولی)، گروه مدل (60μm·L-1H2O2)، گروه VE (60μm·L-1 VE و 60μm·L-1H2O2)، گروه تجویز Cistanche deserticola (100) تقسیم شدند. μg·mL–1 Cistanche deserticola و 60 μm·L–1 H2O2)، سلولها را پس از 24 ساعت کشت جمع آوری کرده، محلول آماده سازی نمونه SOD را برای لیز سلولها اضافه کرده و در دمای 4 درجه و r·min 12000 سانتریفیوژ کنید{22} } دقیقه (شعاع سانتریفیوژ 300 میلی متر است)، مایع رویی را به عنوان نمونه آزمایش کنید و مراحل کیت تشخیص SOD را برای عملیات بعدی دنبال کنید. آزمایش سه بار تکرار شد.

2.2.5 Cistanche deserticola در القای H2O2

اثرات CAT بر روی سلول‌های HEK 293 طبق روش 2.2.4 تیمار و به گروه‌های گروه‌بندی شدند. پس از درمان، محلول لیز را اضافه کنید، در دمای 4 درجه و 12000 r·min{6}} به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ کنید (شعاع گریز از مرکز 300 میلی متر است)، مایع رویی را بردارید و مراحل کیت تشخیص CAT را برای عملیات های بعدی دنبال کنید. . آزمایش سه بار تکرار شد.

2.2.6 تجزیه و تحلیل آماری

برای تجزیه و تحلیل آماری از نرم افزار SPSS 26.{1}} استفاده شد. هر گروه از داده ها با (±±) نشان داده شد.تحلیل واریانس یک طرفه بر روی داده هایی که با توزیع نرمال مطابقت داشتند انجام شد.در صورت مساوی بودن واریانس ها از روش کمترین اختلاف معنی دار استفاده شد.اگر واریانس ها مطابقت داشتند. ناهموار، از روش Dunnett's T3 برای ترسیم نمودار استفاده شد<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 تجزیه و تحلیل همبستگی طیف اثر آنتی اکسیدان Cistanche deserticola

2.3.1 PCA نواحی پیک پیک‌های مشترک 10 دسته از Cistanche deserticola که اثر انگشت ایجاد کرده‌اند با مقدار Z نرمال‌سازی شدند و به یک ماتریس داده سفارشی 10×17 تبدیل شدند که به نرم‌افزار SPSS 26.0 وارد شد. برای PCA

2.3.2 PCC

SPSS 26.{1}} برای انجام تجزیه و تحلیل دو متغیره برای مطالعه رابطه کارایی طیفی بین اثر انگشت Cistanche deserticola و آنتی اکسیدان ها استفاده شد. آزمون معناداری با استفاده از آزمون دو طرفه (T)، با P انجام شد<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 PLS

نتایج تجربی ناحیه پیک استاندارد شده و آنتی اکسیدان Cistanche deserticola را در نرم افزار SIMCA-P 14.1 وارد کنید، ناحیه پیک را به عنوان متغیر X تنظیم کنید و شاخص فارماکودینامیک را به عنوان متغیر Y برای انجام PLS تنظیم کنید.

2.4 تأیید فعالیت آنتی اکسیدانی نشانگر Q Cistanche deserticola

2.4.1 تهیه محلول مادری مواد موثره. مقادیر مناسبی از اسید جنیپینیک، 8-اسید اپیسترینیک، اکیناسید، ورباسکوزید، ایزورباسکوزید، و آنتوسیانوزید A را با دقت وزن کنید و DMSO اضافه کنید تا در محلول مرجع 10 mmol·L-1 حل شود.

2.4.2 اثر مواد فعال بر سمیت سلولی HEK 293.

پس از انکوباسیون سلول‌های HEK 293 به مدت 24 ساعت، غلظت‌های مختلف محلول‌های ماده فعال زیر 2.4.1 را به هر چاهک اضافه کنید ({5}}.781, 1.563, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100μmol·L-1. ) 100 میکرولیتر، تحریک مداوم

پس از انکوبه شدن سلول ها به مدت 24 ساعت، معرف تک محلول آبی CellTiter 96® برای تشخیص زنده ماندن سلول اضافه شد.

2.4.3 اثر آسیب ضد اکسیداتیو مواد فعال بر روی سلول‌های HEK 293 القایی H2O2-.

سلول ها به صورت زیر گروه بندی می شوند: گروه نرمال، گروه مدل و گروه VE بر اساس 2.2.4 گروه بندی می شوند. گروه آزمایش ({3}}.781، 1.563، 3.125 میکرومتر · L-1 ترکیب فعالیت و 60 میکرومتر · L-1 H2O2)، به مدت 24 ساعت کشت داده شد. سطوح ROS داخل سلولی، محتوای آنزیم SOD و CAT را با توجه به روش های زیر 2.2.3، 2.2.4 و 2.2.5 به ترتیب تعیین کنید.

خدمات پشتیبانی Wecistanche

ایمیل:wallence.suen@wecistanche.com

واتساپ/تلفن:+86 15292862950

خرید برای جزئیات بیشتر مشخصات:

https://www.xjcistanche.com٪2fcistanche-shop