مطالعه کمی پروتئومیک مسیر فیبرینوژن را در بیماری کبد پلی کیستیک آشکار می کند Ⅱ

3. نتایج

3.1. کلیه و کبد از مکانیسم های کیستیک یکسانی پیروی نمی کنند

مطالعات قبلی نشان داد که غیرفعال شدن زودهنگام ژن Pkd1 (قبل از p12) باعث ایجاد سریع بیماری پلی کیستیک (پنجره کیستیک) می شود، در حالی که غیرفعال شدن پس از p14 منجر به تشکیل کیست دیر هنگام پس از 4 تا 5 ماه، با یک فنوتیپ خفیف (پنجره غیر کیستیک) می شود. [19]. با استفاده از همان مدل ارتولوگ ADPKD (Pkd1cond/cond؛ Tam-Cre) [18،19]، بررسی کردیم که آیا این پنجره رشد کلیوی با یک پنجره مشابه از رشد کبدی مطابقت دارد یا خیر. برای مقایسه مستقیم با مطالعات قبلی ما [37]، موش ها با تاموکسیفن القا شدند تا ژن Pkd1 را در روزهای 14 (p14) و 12 (p12) پس از زایمان غیرفعال کنند و در سن 30 روزگی (p30) قربانی شدند. جالب توجه است، ما یک فنوتیپ کیستیک را در هر دو نقطه زمانی با درجه متفاوتی از بیماری (خفیف و شدید) مشاهده کردیم، که نشان می‌دهد کلیه و کبد دارای پنجره‌های رشد کیستیک مستقل هستند (شکل 1a)، و/یا ممکن است زمان‌بندی و پیشرفت بیماری متفاوت باشد. . هیچ تفاوتی بین نر و ماده در این سن کشتار بین هر دو پنجره غیرفعال یافت نشد (n=6 برای هر گروه جهش یافته استفاده شد). حیوانات جهش یافته p14 فنوتیپ خفیف تری نسبت به گروه جهش یافته p12 با مقادیر کمتر شاخص کیستیک، تعداد کیست ها و عملکرد کبدی بر اساس مقدار سرمی ALP ارائه کردند (شکل 1b-d). این اولین مطالعه‌ای است که پنجره‌ها/مکانیسم‌های مختلف رشد را برای کمبود کبد و کلیه Pkd1 نشان می‌دهد. این تفاوت های مولکولی باید در مطالعات آینده مشخص شود.

شکل 1. خصوصیات فنوتیپ کبد کیستیک در روز 30 از مراحل p12 و p14. حذف Pkd1 در p12 سیستوژنز شدیدتری را به همراه دارد. (الف) تصاویر ماکروسکوپی و میکروسکوپی نمایشی از هماتوکسیلین-ائوزین رنگ‌آمیزی شده از کبد Pkd1cond/cond؛ نوع وحشی موش Tam-Cre (WT, Pkd1cond/cond؛Tam-Cre−) و جهش یافته (KO, Pkd1cond/Cre+Tam). ) با حذف ژن Pkd1 ناشی از تاموکسیفن در روز 14 پس از تولد (گروه 14 p) و 12 (گروه p12). همه موش ها در p3 قربانی شدند. نوار مقیاس، 2 میلی متر (پانل بالایی) 100 میکرومتر (پانل پایین). n تعداد نمونه ها در هر گروه را نشان می دهد و Bd به معنای مجرای صفراوی است. (ب، ج) شاخص کیست کبدی و تعداد کیست های فنوتیپ های مختلف. (d,e) مقادیر ALP و ALT سرم خون. میله ها نشان دهنده میانگین ± SEM در همه موارد هستند. P<0.05 با آزمون t Student (دو دنباله) به عنوان یک نتیجه معنی دار در نظر گرفته شد. ns نشان دهنده عدم اهمیت است. * p <0.05، ** p <0.01، *** p <0.001.

برای بیماری کلیوی گیاه سیستانچ را کلیک کنید

3.2. تفنگ ساچمه ای و آنالیز پروتئومی SWATH-MS در PLD

همانطور که در شکل 2 اشاره شد، ما آنالیز پروتئوم دیفرانسیل را در هر دو مرحله کیستیک (p12 - بیماری کیستیک شدید - و p14 - بیماری کیستیک خفیف -) جهش‌یافته‌ها (KO) در مقایسه با حیوانات نوع وحشی (WT) انجام دادیم تا شناسایی و مکانیسم‌های مولکولی مرتبط تحت سیستوژنز کبد و پیشرفت بیماری را مشخص می‌کند.

شکل 2. طرح گردش کار نشان داده شده. ما از یک مدل موش ADPKD (Pkd1cond/cond؛ موش Tam-Cre) استفاده کردیم که در آن غیرفعال‌سازی ژنتیکی Pkd1 با تجویز تاموکسیفن در روز 10 پس از تولد (p10) و p11 (پیشرفت سریع بیماری) یا p15 و p16 (پیشرفت بیماری با تأخیر) القا شد. ) با توجه به سوئیچ تکاملی برای سیستوژنز کلیه، دو گروه مطالعه به نام های p12 و p14 را تعریف می کند [19]. برای هر دو گروه، ما از n برابر یا بیشتر از شش نفر از نوع وحشی (WT) و جهش یافته (KO) در هر شرایط استفاده کردیم و همه حیوانات در p30 قربانی شدند. ما پروتئوم دیفرانسیل کبدهای WT و KO را در هر دو شدت بیماری کیستیک کبدی (شکل 1) با استفاده از تجزیه و تحلیل DDA-MS اکتسابی پروتئومیک کمی SWATH-MS و تفنگ ساچمه ای مطالعه کردیم. از بین پروتئین‌هایی که فراوانی آن‌ها تغییر قابل‌توجهی داشتند، از بیوانفورماتیک استفاده کردیم. شکل 2. طرح گردش کار نشان‌داده شده. ما از یک مدل موش ADPKD (موش Pkd1cond/cond؛ موش Tam-Cre) استفاده کردیم که در آن غیرفعال‌سازی ژنتیکی Pkd1 با تجویز تاموکسیفن در روز 10 پس از تولد (p10) و p11 (پیشرفت سریع بیماری) یا p15 و p16 (پیشرفت بیماری با تاخیر) القا شد. ) با توجه به سوئیچ تکاملی برای سیستوژنز کلیه، دو گروه مطالعه به نام های p12 و p14 را تعریف می کند [19]. برای هر دو گروه، ما از n مساوی یا بیشتر از شش فرد نوع وحشی (WT) و جهش یافته (KO) در هر شرایط استفاده کردیم و همه حیوانات در p30 قربانی شدند. ما پروتئوم دیفرانسیل کبدهای WT و KO را در هر دو شدت بیماری کیستیک کبدی (شکل 1) با استفاده از تجزیه و تحلیل DDA-MS پروتئومیک کمی SWATH-MS و تفنگ ساچمه ای بررسی کردیم. از میان پروتئین‌هایی که فراوانی آن‌ها تغییر قابل‌توجهی داشتند، از ابزارهای بیوانفورماتیک برای شناسایی اهداف و مسیرهای درمانی جدید درگیر در بیماری استفاده کردیم. در نهایت، ما آن اهداف را ابتدا با استفاده از روش‌های سیلیکونی (تحلیل DDA در مقابل SWATH) و در نهایت در داخل بدن، و همچنین RT-qPCR، وسترن بلات و ایمونوهیستوشیمی تایید کردیم. p به معنای روز پس از زایمان است

الگوی بیان پروتئین در سیستوژنز کبدی ابتدا، ما آنالیز طیف سنجی جرمی پروتئومی را با استفاده از تفنگ ساچمه ای DDA-MS یا DDA انجام دادیم. این تجزیه و تحلیل اجازه می دهد تا پروتئوم را از نمونه های کامل و منفرد مشخص کند، حضور/عدم وجود پروتئین هایی با حساسیت بالا اما بدون ارائه کمیت آنها را فراهم می کند. ما به طور انحصاری تمام پروتئین های بیان شده متفاوت در بیش از پنج نمونه مستقل از مجموع شش نمونه را برای مراحل p14 و p12 افراد نوع وحشی و افراد جهش یافته در نظر گرفتیم (شکل S1). در p14، 1 پروتئین انحصاری WT (یا با تنظیم پایین برای بیماری) و 7 پروتئین منحصر به فرد MUT (تنظیم بالا) شناسایی شد، در حالی که در p12، هشت پروتئین انحصاری WT و شش پروتئین منحصر به فرد MUT مشاهده شد (شکل S1).

در مرحله بعد، ما از روشی استفاده کردیم که به ما امکان می داد پروتئین های بیان شده متفاوت را کمی کنیم. ما یک آنالیز پروتئومی کمی SWATH-MS بر روی همان نمونه‌هایی که برای DDA استفاده کردیم، انجام دادیم و 1500 پروتئین در هر نمونه و بیش از 2000 پروتئین در هر گروه مطالعه به دست آوردیم. ابتدا، ما نرمال سازی مجموع مساحت کل (TAS) را انجام دادیم تا ارزیابی کنیم که نمونه های ما از یک الگوی توزیع نرمال پیروی می کنند، همانطور که در شکل های S2 و S3 نشان داده شده است. در مرحله بعد، پروتئین را با تفاوت معنی‌دار بین گروه‌های Wild Type و Mutant مورد مطالعه قرار دادیم. جدول 1 پروتئین هایی را با تغییر فراوانی قابل توجه با افزایش دو برابری (تنظیم بالا) یا کاهش (تنظیم پایین) و مقدار p تنظیم شده قابل توجه (طبق آزمون t-استودنت پارامتریک) در WT در مقابل نشان می دهد. نمونه های MUT در p14 و p12. در مجموع، شش پروتئین تفاوت قابل‌توجهی در فراوانی پروتئین بین گروه‌های WT p14 و MUT-p14 نشان دادند (پنج پروتئین با تنظیم بالا و یک پروتئین با تنظیم پایین). بین WT-p12 و MUT-p12، 26 پروتئین (20 پروتئین با تنظیم بالا و 6 پروتئین با تنظیم پایین) تفاوت های قابل توجهی را نشان دادند (شکل 3a و جدول 1). از نظر گرافیکی، این تغییرات را می توان از طریق نمودارهای آتشفشان مشاهده کرد، که با ترسیم تغییرات log(2) برابر برای همه پروتئین های شناسایی شده در برابر مقدار p-log(10) آنها ایجاد شد (شکل 3b). تفاوت های قابل توجهی بین سطوح فراوانی پروتئین را می توان در نقشه حرارتی با مقادیر جداگانه با توجه به مناطق کتابخانه طیفی، و سطح خوشه بندی آن در تجزیه و تحلیل نقشه حرارتی خوشه ای مشاهده کرد (شکل 3c و S4). این خوشه‌های شناسایی شده توسط تجزیه و تحلیل SWATH-MS به ما کمک می‌کنند تا آن نمونه‌های جدا شده از نظر کیفی را شناسایی کنیم تا برای تجزیه و تحلیل کمی در نظر گرفته شوند (شکل S5). یک تحلیل آماری چند متغیره بدون نظارت با استفاده از تجزیه و تحلیل مؤلفه اصلی (PCA) برای مقایسه داده ها بین نمونه ها انجام شد (شکل S6). داده‌های نقشه حرارتی و PCA تکرارپذیری را در میان نمونه‌های سه‌گانه نشان دادند، زیرا سه تکرار در هر دو تجزیه و تحلیل از نزدیک خوشه‌بندی شدند. ما می‌توانیم هم در PCA و هم در تحلیل خوشه‌ای نقشه حرارتی (شکل‌های S5 و S6) مشاهده کنیم که چگونه برخی از نمونه‌ها به درستی گروه‌بندی نشده‌اند و بین هر دو خوشه همپوشانی دارند. با این وجود، می‌توانیم تمایل به جداسازی داده‌ها را در خوشه‌های Wild Type و Mutant مشاهده کنیم. تعداد کمتر پروتئین ها با تفاوت قابل توجه در p14 در مقابل p12 را می توان با درجه متفاوت شدت توجیه کرد (شکل 2)، که نشان می دهد تعداد پروتئین ها و مسیرها بر اساس شدت و وضعیت بیماری فنوتیپ کیستیک افزایش می یابد.

3.3. خوشه بندی، غنی سازی مسیر و تجزیه و تحلیل برهمکنش پروتئین-پروتئین بیان ژن در PLD

برای ایجاد عملکرد مربوط به پروتئین های بیان شده متفاوت شناسایی شده توسط تجزیه و تحلیل SWATH-MS، از چندین ابزار بیوانفورماتیک و اشکال تجزیه و تحلیل استفاده کردیم. اصطلاحات و مسیرهای هستی شناسی ژن (GO) با استفاده از FunRich [39،40]، String [41] و Reactome [42] انجام شد. پروتئین ها در تجزیه و تحلیل غنی سازی ژن FunRich مرتب شدند. با توجه به فرآیند بیولوژیکی، غنی‌ترین گروه پروتئین‌ها برای گروه p14 (کیستیک خفیف) مربوط به انتقال اسیدهای چرب و بیوسنتز پروستاگلاندین و برای گروه p12 (کیستیک شدید) با فعالیت فیبرینوژن/فیبرین، چسبندگی سلول-سلول/ماتریکس و متابولیک بود. فرآیند (شکل 4a، پانل بالایی). ANXA2 و کمپلکس فیبرینوژن به ترتیب غنی‌ترین اجزای سلولی در گروه‌های p14 و p12 بودند. علاوه بر این، فضای خارج سلولی جزء سلولی با بیشترین درصد پروتئین در هر دو گروه بود (شکل 4a، پانل پایین). به طور مشابه، همان تجزیه و تحلیل با تجزیه و تحلیل رشته ایجاد شد، شناسایی فرآیندهای متابولیک مختلف به عنوان فرآیند بیولوژیکی اصلی، و فضای خارج سلولی به عنوان غنی ترین جزء سلولی. مطابق با نتایج GO (شکل S7a). در نهایت، ما تجزیه و تحلیل را با پلت فرم Reactome تکرار کردیم و دریافتیم که متابولیسم و ​​سیستم ایمنی غنی‌ترین مسیرها هستند (شکل S7b).

تجزیه و تحلیل پروتئین-پروتئین یا خوشه بر اساس آنالیز رشته نیز به منظور بررسی برهمکنش های احتمالی پروتئین-پروتئین (تعامل با شواهد تجربی) انجام شد. برهمکنش‌های پروتئینی متعددی در گروه‌های مختلف شناسایی شد (شکل S8)، اما یک خوشه در p14 و دیگری در p12 بر اساس تعداد برهم‌کنش‌های بین پروتئین‌ها و سطح بیان مرتبط‌تر بودند (شکل 4b). خوشه p{4}} حاوی پروتئین انکسین A2 (ANXA2_P{20}}7356) مرتبط با چندین عملکرد سلولی، مانند فیبرینولیز، تحرک سلولی (در سلول های اپیتلیال)، پروتئین مربوط به اکتین است. برهمکنش‌های اسکلت سلولی و ماتریکس سلولی [43]، در تعامل با دو پروتئین دیگر که در انتقال چربی درون سلولی دخیل هستند (FABP{10}}P12710 و FABP{12}}Q05816). جالب توجه است که گروه مرتبط دیگری از پروتئین‌ها در خوشه p{14}}با یک تعامل پروتئین-پروتئین بسیار قوی بین چندین فیبرینوژن (FGL{15}}Q71KU9، FIBB{18}}Q8K0E8، FIBA{22 شناسایی شد. }}E9PV24 و FIBGG_Q8VCM7). فیبرینوژن ها در رشد سلول های کبدی نقش دارند و واسطه پخش پلاکت خون، کلاژن بینابینی و ضایعات فیبروتیک هستند [44]. علاوه بر این، پروتئین‌های اضافی با فیبرینوژن‌ها تعامل دارند (شکل S8)، مانند آمیلوئید p-component سرم (SAMP{31}}P12246)، هموپکسین (HEMO{33}}Q91X72) یا هیدروکسی اسید اکسیداز 2 (HAOX{31}). {37}}Q9NYQ2). مطابق با نتایج رشته‌ای، کمپلکس‌های ANXA2 و فیبرینوژن نیز غنی‌ترین اجزای سلولی بودند که با تجزیه و تحلیل FunRich شناسایی شدند (شکل 4a). جالب توجه است، هنگام مقایسه داده‌های به‌دست‌آمده با تجزیه و تحلیل DDA و SWATH، تأیید کردیم که چندین پروتئین شناسایی‌شده توسط SWATH نیز با تجزیه و تحلیل DDA شناسایی شدند، از جمله چندین پروتئین مرتبط با کمپلکس فیبرینوژن (SAMP/Apcs و S10A9/S100a9؛ جدول S3).

3.4. اعتبار سنجی تجزیه و تحلیل SWATH-MS، مجموعه فیبرینوژن را به عنوان یک مکانیسم مولکولی جدید مرتبط با PLD آشکار می کند.

بر اساس این داده ها، ما از تجزیه و تحلیل SWATH-MS (شکل S9) پروتئین های تغییر یافته مربوط به کمپلکس فیبرینوژن در مراحل p12 و p14 را برای اعتبار سنجی in vivo با RT-qPCR، وسترن بلات و ایمونوهیستوشیمی انتخاب کردیم تا تایید آنها را تا حد ممکن ایجاد کنیم. اهداف بیماری هشت مورد از 10 از این پروتئین‌های انتخاب شده در سطح mRNA توسط RT-qPCR تأیید شدند (شکل 5). یکی در 14-مرحله (ANXA2_P07356) و در p{11}}گروه (SAMP_P12246, FGL1_Q71KU9, ILK{ 17}}O55222، S10A9_P31725، FIBB_Q8K0E8، HEMO_Q91X72، FIBA_E9PV24 و FIBG_Q8VCM7)، و یک پایین- در گروه p12 تنظیم می شود (HAOX{37}}Q9NYQ2). جالب توجه است که بیان ژنی دو پروتئین با فاصله بیشتر یا برهمکنش کمتر با گروه فیبرینوژن (ILK و S10A9) تنها مواردی بودند که تایید نشدند (شکل 5c).

افزایش تنظیم کمپلکس فیبرینوژن (پروتئین های ANXA2، SAMP، FIBB، FIBA، FIBG و HAOX2) با تجزیه و تحلیل وسترن بلات (WB) بیشتر تایید شد (شکل 6). به طور کلی، بیان ژن و WB بسیار با داده های پروتئومی SWATH-MS سازگار بود. در نهایت، ما همچنین اعتبار سنجی ایمونوهیستوشیمی مجموعه فیبرینوژن را در نمونه های کبد جهش یافته و پلی کیستیک انجام دادیم (شکل 7). رنگ آمیزی فیبرینوژن در سلول های اپیتلیال پوشش کیست و اتساع مجرای صفراوی به شدت بالا تنظیم شد (شکل 7a). این نتایج، برای اولین بار، مجموعه فیبرینوژن را به عنوان یک مسیر احتمالی مرتبط با سیستوژنز کبدی و به عنوان یک هدف درمانی احتمالی در آینده برای PLD آشکار می کند.

شکل 5. اعتبارسنجی اهداف احتمالی PLD توسط RT-qPCR. بیان ژن 8 تا 1{26}} هدف انتخاب شده با داده های SWATH-MS همبستگی دارد. RT-qPCRs انکسین A2 هدف p14 انتخاب شده با تنظیم بالا (Anxa2) (a). p12 با تنظیم بالا جزء p آمیلوئید، سرم (Apcs، ژن SAMP)، فیبرینوژن مانند 1 (Fgl1)، زنجیره بتا فیبرینوژن (Fgb)، هموپکسین (Hpx)، زنجیره آلفا فیبرینوژن (Fga)، زنجیره گاما فیبرینوژن (Fgg) را هدف قرار می دهد. (ب)، کیناز متصل به اینتگرین (Ilk) و S1{28}}{{3{32}}}} پروتئین اتصال دهنده کلسیم A9 (S100a9) (c); و P12 هدف هیدروکسی اسید اکسیداز 2 (Hao2) با تنظیم پایین (d). n=6 برای هر گروه پروتئین استفاده شد. Gapdh به عنوان یک ژن خانه داری استفاده شد. میله ها نشان دهنده میانگین ± SEM هستند. از آزمون t Student با دو دنباله استفاده شد و مقدار p<0.05 معنی دار در نظر گرفته شد. ns: معنی دار نیست (p بزرگتر یا مساوی 0.05)، * p < 0.05، ** p <0.01، *** p <0.001.

شکل 7. کمپلکس فیبرینوژن در اپیتلیوم کیستیک تنظیم شده است. (الف، ب) تصاویری از ایمونوهیستوشیمی فیبرینوژن در مجرای صفراوی (پانل فوقانی) و پارانشیم کبد (پانل پایینی) (الف) و کمی سازی آن (ب). n=6 برای هر گروه استفاده شد. آنالیز ایمونوهیستوشیمی افزایش تنظیم فیبرینوژن را از طریق اپیتلیوم کیستیک نشان داد. نمونه ها با گروه p12 مطابقت داشتند. نوارهای مقیاس نشان دهنده 100 میکرومتر است. Bd به معنای مجرای صفراوی است. میله ها نشان دهنده میانگین ± SEM هستند. از آزمون t Student با دو دنباله استفاده شد و مقدار p<0.05 معنی دار در نظر گرفته شد. *** p < 0.001.

خدمات حمایتی Wecistanche - بزرگترین صادرکننده سیستانچ در چین:

ایمیل:wallence.suen@wecistanche.com

واتساپ/تلفن:+86 15292862950

خرید برای جزئیات بیشتر مشخصات:

https٪3a٪2f٪2fwww.xjcistanche.com٪2fcistanche-shop

برای عفونت کلیه، عصاره طبیعی ارگانیک سیستانچ با 25% اکیناکوزید و 9% آکتئوزید دریافت کنید.