تجزیه و تحلیل کمی پروتئومیکس بیماران کووید-19: Fetuin-A و Tetranectin به عنوان تعدیل کننده های بالقوه پاسخ های ایمنی ذاتی

خلاصه

درمان موارد شدید بیماری کروناویروس 2019 (COVID-19) برای به حداقل رساندن مرگ و میر و آسیب اندام های انتهایی بسیار مهم است. در اینجا ما یک آنالیز پروتئومی از نمونه‌های پلاسما از بیماران خفیف، متوسط ​​و شدید COVID-19 انجام دادیم. تجزیه و تحلیل پروتئین های متفاوت بیان شده و اهداف بالقوه درمانی متفاوت مربوط به پاسخ های ایمنی ذاتی مانند fetuin-A، vitronectin (TN) و پاراکسوناز (PON1) را نشان داد. علاوه بر این، تغییرات پروتئین در پلاسما اختلال در تنظیم کمپلمان و آبشارهای انعقادی را در بیماران مبتلا به کووید{7} در مقایسه با افراد سالم نشان داد. در نتیجه، داده‌های پروتئومیکس ما fetuin-A و TN را به‌عنوان اهداف بالقوه‌ای پیشنهاد کردند که ممکن است برای تشخیص و همچنین امضاهایی برای درک بهتر پاتوژنز بیماری COVID{9}} استفاده شوند.

اندام های انتهایی به بافت ها یا اندام هایی اطلاق می شود که در نهایت عملکردهای خاصی را در بدن انسان انجام می دهند، مانند کبد، کلیه ها و ریه ها. آسیب به این اندام ها می تواند منجر به انواع بیماری های عمده مانند بیماری مزمن کلیوی، سیروز کبدی و بیماری انسدادی مزمن ریه شود. ایمنی به پاسخ ایمنی بدن به میکروارگانیسم ها و بافت های بیماری زا خارجی اشاره دارد. ایمنی بدن طبیعی باقی می ماند که می تواند از بروز و وخامت بیشتر بیماری ها جلوگیری کند. بنابراین، آسیب اندام های انتهایی ارتباط نزدیکی با ایمنی دارد و آنها بر عملکرد ایمنی بدن انسان تأثیر می گذارند.

آسیب اندام انتهایی می تواند منجر به آسیب به تعداد و کیفیت سلول های ایمنی در بدن شود. به عنوان مثال، بیماران مبتلا به بیماری کبدی لکوپنی، عملکرد غیرطبیعی کبد و کاهش سنتز آنتی بادی را تجربه خواهند کرد که آنها را مستعد ابتلا به عفونت پس از بیماری می کند. کاهش عملکرد کلیه منجر به اورمی می شود. سندرم، کم خونی، پوکی استخوان و سایر بیماری ها، این عوامل بر عملکرد ایمنی بدن نیز تأثیر خواهند گذاشت. از سوی دیگر، پاسخ ایمنی بدن می تواند بر اندام های انتهایی نیز تأثیر بگذارد، به عنوان مثال، پاسخ ایمنی بیش از حد می تواند منجر به هپاتیت ایمنی یا ذات الریه آنافیلاکتیک شود. تأثیر متقابل آسیب اندام های انتهایی و اختلال عملکرد ایمنی بدن را مستعد ابتلا به بیماری ها می کند و طول عمر آن را کوتاه می کند.

بنابراین، حفظ عملکرد طبیعی اندام انتهایی و عملکرد قوی ایمنی، کلید حفظ سلامتی است. افراد باید از طریق یک سبک زندگی خوب، مانند رژیم غذایی سالم، ورزش مناسب و آرامش، از آسیب اندام های انتهایی جلوگیری کنند و از طریق پیشگیری و درمان فعال بیماری ها، عملکرد طبیعی سیستم ایمنی بدن را حفظ کنند. مشاهده می شود که باید به مصونیت خود توجه کنیم. سیستانچ می تواند ایمنی را بهبود بخشد و اثر آن خوب است. پلی ساکاریدهای موجود در گوشت می توانند پاسخ ایمنی سیستم ایمنی بدن انسان را تنظیم کنند، توانایی استرس سلول های ایمنی را بهبود بخشند و سلول های ایمنی را تقویت کنند. اثر باکتری کش

روی فواید سلامتی سیستانچ کلیک کنید

1. معرفی

سندرم حاد تنفسی شدید، کروناویروس 2 (SARS-CoV-2)، بیماری کروناویروس 2019 (COVID-19) [1]. بیماری کووید{6}} با فنوتیپ‌های بالینی مختلف از بدون علامت، خفیف، متوسط ​​تا شدید یا بسیار شدید مشخص می‌شود که با ذات‌الریه شدید و خطر بالای مرگ در جمعیت مسن به‌ویژه در بیماران بالای 70 سال مشخص می‌شود. 2،3]. واکسن‌ها در اواخر سال 2020 تولید شدند و اکثر مردم در سراسر جهان با حداقل 2 دوز واکسینه شدند. با وجود کاهش تعداد افراد مبتلا و همچنین موارد شدید گزارش شده، مشکل هنوز حل نشده است و علت پیشرفت بیماری به وضعیت شدید ناشناخته باقی مانده است. علاوه بر این، SARS-CoV{13}} مانند سایر ویروس‌ها در طول زمان تغییر می‌کند و انواع جدید ممکن است در ویژگی‌های اصلی مانند گسترش و شدت بیماری مرتبط با آن تغییراتی داشته باشند و کمتر (نوع omicron) [4] یا بیشتر شوند (دلتا). نوع) [5] شدید. ظهور بالقوه انواع جدید هنوز ممکن است و درک مکانیسم مسیرهای پشت بیماری کووید{16}} بسیار حیاتی است.

به خوبی شناخته شده است که اختلال در پاسخ های ایمنی مشکل اصلی در برابر پاکسازی ویروس و بهبودی از بیماری است. علاوه بر این، پاسخ‌های ایمنی ذاتی به عنوان عوامل کلیدی در تعدیل پیشرفت بیماری به سمت فنوتیپ‌های بالینی بدون علامت، خفیف، متوسط، شدید یا بسیار شدید در نظر گرفته می‌شوند [6،7]. نوتروفیل ها و مونوسیت ها/ماکروفاژها عناصر دفاعی حیاتی خط مقدم هستند که پاسخ های ایمنی ذاتی را در طول عفونت هدایت می کنند [8،9]. پروتئین اسپایک SARS-CoV{5}} ممکن است ماکروفاژها را مستقیماً از طریق گیرنده ACE2 موجود در این سلول ها فعال کند [10].

در طول عفونت، سلول‌های ایمنی چندین پروتئین، سیتوکین و واسطه‌ها را برای تنظیم التهاب و حفظ هموستاز فیزیولوژیکی بدن آزاد می‌کنند. پروتئومیکس مبتنی بر پلاسما یک رویکرد عملی برای تجزیه و تحلیل پروفایل های پروتئین و مرتب سازی تغییرات مرتبط با شرایط پاتوفیزیولوژیک یا پیشرفت بیماری است [11]. مطالعات مختلف پروتئومیکس برای شناسایی و مشخص کردن پروفایل‌های پروتئوم در گروه‌های COVID{2} مختلف با استفاده از بافت‌ها [12،13]، سلول‌ها [14] یا پلاسما [15،16] انجام شد. بنابراین، پروتئومیک‌های مبتنی بر پلاسما را برای شناسایی پروتئین‌های مرتبط با سیستم ایمنی ذاتی مرتبط با بیماری کووید{10} و پیشرفت شدت آن به کار بردیم. هدف ما مطالعه الگوی بیان پروتئین پلاسماتیک در بیماران سالم و مبتلا به کووید{11}}و ارزیابی تعامل بالقوه با پاسخ‌های ایمنی ذاتی است.

2. نتایج

2.1. پروفایل های پروتئومی پلاسما

برای ارزیابی پاسخ‌های میزبان SARS-CoV-2، یک آنالیز پروتئومیکس پلاسما از گروهی از بیماران COVID-19 و افراد سالم انجام شد. در مطالعه ما، روش iTRAQ 4plex به دلیل تکرارپذیری بالا و پوشش پروتئوم نسبت به سایر روش‌های دارای برچسب پروتئومیکس با دقت انتخاب شد [17]. علاوه بر این، برای عمق بهتر پوشش کل پروتئوم، ما شکنش پپتید تبادل کاتیونی قوی را با iTRAQ ترکیب کردیم. تصویری از گردش کار مطالعه در شکل 1 ارائه شده است. مجموعا 176 پروتئین در همه نمونه‌های پلاسمای کووید{8}} و شاهد سالم با نرخ کشف نادرست شناسایی شد.<1% at the protein level. Nevertheless, our prime interest was to identify biomarkers and investigate the pathogenesis of COVID-19. Consequently, differentially expressed proteins analysis was performed for healthy control versus other COVID-19 groups (severe, moderate, and mild) by applying pairwise comparison. Supplementary Table S1 shows a list of differentially expressed proteins in all pairwise comparisons including 'severe v. Control', 'moderate v. Control', and 'mild v. Control'. The statistical criteria for the quantitative analysis were set with a cutoff for fold change with >1.20 برای تنظیم بالا و<0.83 for down-regulation and a p-value of <0.05 (Supplementary Table S2). 

نتایج نشان داد که تعداد پروتئین‌هایی که در بین گروه‌های مقایسه تغییر کرده‌اند، همانطور که در شکل 2a نشان داده شده است، متفاوت است. نتایج مقایسه ای نشان داد که 27 درصد از اندازه گیری های پروتئین بیان شده متفاوت در هر سه گروه همپوشانی دارند (شکل 2b). نمودار ون همچنین نشان داد که تعداد پروتئین‌های منحصربه‌فرد در شفقت زوجی خفیف در مقایسه با گروه‌های کنترل دارای تعداد بیشتری است. این لزوماً تفاوت‌ها را در سطح شناسایی پروتئین نشان نمی‌دهد، بلکه سطح کمی را با توجه به اینکه معیارهای آماری برای تغییر برابر و p-value انتخاب شده‌اند، نشان می‌دهد. برای ارزیابی اینکه آیا اندازه‌گیری‌های پروتئین بیان شده متفاوت برای همه مقایسه‌ها را می‌توان در بین گروه‌های COVID{4}} متمایز کرد یا خیر، آنالیز PCA استفاده شد. جالب توجه است، نتایج نشان داد که تمایز واضحی در بین گروه‌های COVID{5}} وجود دارد که در شکل 3 نشان داده شده است. علاوه بر این، پروتئین‌های بیان شده متفاوت با ایجاد یک نمودار آتشفشانی برای همه مقایسه‌های زوجی کنترل سالم در مقابل کووید ارائه شده‌اند. 7}} گروه (شکل 4). چندین پروتئین بیان شده متفاوت در مجموعه داده ما قبلاً به عنوان نشانگرهای زیستی برای COVID-19 گزارش شده است [16،18].

هستی شناسی ژن و آنالیز مسیر با استفاده از ابزار آنلاین "STRING" بر روی اندازه گیری های متفاوت پروتئین بیان شده برای بیماران سالم و بیماران مبتلا به کووید{{{0}} صرف نظر از گروهی که در آن قرار دارند، انجام شد. برای تجزیه و تحلیل Go غنی سازی، اکثریت پروتئین‌های بیان‌شده متفاوت به ترتیب در تنظیم بیولوژیکی، ناحیه خارج سلولی و تنظیم‌کننده عملکرد مولکولی برای فرآیند بیولوژیکی، مکمل سلولی و عملکرد مولکولی نقش دارند (مواد تکمیلی، شکل S1). علاوه بر این، ما پروتئین های متفاوت بیان شده و مشارکت آنها در تجزیه و تحلیل مسیر را با استفاده از پایگاه داده KEGG مطالعه کرده ایم. معیارهای آماری تجزیه و تحلیل غنی‌سازی 01/0p< انتخاب شد و رتبه‌بندی شرایط مسیر بر اساس غنی‌سازی برابر بود که در مواد تکمیلی نشان داده شده است (شکل S2). در طول عفونت، سلول‌های آسیب‌دیده و مرده پاسخ‌های ایمنی بزرگی را آغاز می‌کنند و اجزای سلولی مختلف و اندوتوکسین‌هایی را آزاد می‌کنند که آبشار انعقاد خون را فعال می‌کنند [19]. فعال شدن چنین مسیرهایی منجر به اختلال عملکرد اندوتلیال و التهاب و همچنین تحریک مهاجرت لکوسیت ها و نفوذ بافت می شود و در نتیجه باعث فعال شدن پاسخ های موضعی ایمنی ذاتی می شود [20]. در مطالعه ما، سیستم مکمل که تعدیل‌کننده مرکزی ایمنی ذاتی و مسیرهای آبشاری انعقادی است، مهم‌ترین مورد در میان سایر اصطلاحات مسیر است. چندین مطالعه پروتئومیکس روی پلاسمای بیماران COVID{7} نشان داد که آبشارهای مکمل و انعقاد یکی از غنی‌ترین مسیرها هستند [21،22]. با این حال، تمرکز بحث ما بر روی سه پروتئین fetuin-A، TN، و PON{11}} به عنوان اهداف جدید بالقوه درگیر در پاسخ‌های ایمنی ذاتی به عفونت SARS-COV-2 و شدت کووید است. 14}} بیماری.

2.2. سطوح پلاسمایی TNF با علائم بیماری COVID{2}} مرتبط است

طوفان سیتوکین ناشی از Sars-CoV2 یکی از نشانه های موارد شدید بیماری کووید{2}} است [23]. گزارش شده است که انتشار بیش از حد TNF با شدت و پیش آگهی ضعیف بیماران مبتلا به بیماری کووید{5}} مرتبط است [24،25]. در مطالعه ما، اندازه‌گیری سطوح پلاسمایی TNF افزایش مورد انتظار در گروه‌های کووید{8}} را در مقایسه با گروه‌های سالم نشان داد که با افزایش بیشتر در نمونه‌های شدید در مقایسه با نمونه‌های متوسط ​​یا خفیف تأیید شد.

3. بحث

چندین مطالعه پروتئومیکس غیرهدفمند برای بررسی تغییر در نمونه‌های سرم/پلاسما COVID{0}} مورد استفاده قرار گرفته است. تعداد پروتئین‌های شناسایی‌شده از این مطالعات به دلیل روش‌های مختلفی که مورد استفاده قرار گرفت، متفاوت است. رویکرد کمی سازی بدون برچسب با استفاده از روش اکتساب مستقل از داده، پوشش پروتئوم پلاسما بالاتری را نشان داد [26]. برای رویکرد پروتئومی مبتنی بر برچسب‌گذاری، روش کمیت‌سنجی TMT مبتنی بر Orbitrap LC-MS/MS پوشش پروتئوم پلاسما/سرم بالاتری را با تعداد پروتئین‌های شناسایی‌شده به 900 نشان داده است [27]. در مطالعه ما، تعداد کل پروتئین‌های شناسایی‌شده 176 بود، که بسیار نزدیک به دو مطالعه منتشر شده است که از آنالیزگر جرم یکسان (TripleTOF) استفاده کردند، جایی که آنها 179 و 189 پروتئین را شناسایی کردند [28،29]. پروتئین های در گردش در پلاسمای بیماران کووید{14} دریچه ای برای تشخیص پیشرفت و شدت بیماری، و همچنین نشانه التهاب و پاسخ های ایمنی ذاتی و سازگار ارائه می دهند.

تولید و انتشار بیش از حد سیتوکین های پیش التهابی به عنوان نکته کلیدی در تغییر فنوتیپ بالینی از وضعیت متوسط ​​به شدید در بیماران کووید-19 در نظر گرفته می شود. در جریان عفونت، پاسخ‌های ایمنی ذاتی توسط الگوهای مولکولی مرتبط با آسیب (DAMPs) یا الگوهای مولکولی مرتبط با پاتوژن (PAMPs) تعدیل می‌شوند [30]. پروتئین های فاز حاد (APP) مانند fetuin-A به طور سیستماتیک در پلاسما آزاد می شوند تا از فرآیند ضد التهابی در طول التهاب پشتیبانی کنند. در مطالعه ما، کاهش واضحی از جنین-A پلاسماتیک در موارد متوسط ​​و شدید در مقایسه با افراد سالم مشاهده کردیم (شکل 4). نشان داده شد که fetuin-A ممکن است واسطه های اولیه (TNF، IL{11}}، IL{12}} و INF) و دیررس (HMGB1) را که توسط سلول های ایمنی ذاتی مانند ماکروفاژها آزاد می شوند، مهار کند [31]. تجزیه و تحلیل TNF در گروه کووید{15}} ما، روند افزایش غلظت پلاسمایی را در مقایسه با اهداکنندگان سالم نشان می‌دهد که در موارد شدید قوی‌تر هستند (مواد تکمیلی، شکل S3). در طول التهاب، مونوسیت/ماکروفاژهای فعال، سیتوکین‌های پیش‌التهابی را آزاد می‌کنند که توسط یک آمین بیوژنیک موجود در همه جا به نام اسپرمین تضعیف می‌شوند [32]. با این حال، اثرات ضد التهابی اسپرم به fetuin-A وابسته است. بنابراین اسپرمین نمی تواند عملکرد سلول های دارای کمبود مونوسیت/ماکروفاژ fetuin-A را مهار کند [33]. علاوه بر این، کاهش سطح fetuin-A ممکن است مربوط به ناهنجاری های عروقی و ترومبوز باشد که در موارد بسیار شدید به دلیل افزایش کلسیفیکاسیون عروقی و اختلال عملکرد اندوتلیال [34،35] و استرس اکسیداتیو [36] مرتبط با سطوح fetuin-A مرتبط است. .

پس از عفونت ویروسی، آپوپتوز سلولی یکی از مکانیسم های دفاعی میزبان است. با این حال، تجمع بیش از حد سلول‌های آپوپتوز به دلیل نقص در پاکسازی سلولی آپوپتوز با التهاب و خودایمنی همراه است [37]. کاهش سطح پلاسمایی fetuin-A می‌تواند حداقل تا حدی در این فرآیند نقش داشته باشد زیرا ظرفیت فاگوسیتوز برای تمیز کردن سلول‌های آپوپتوز توسط ماکروفاژها [38] و وزیکول‌ها توسط VSMC [39] را افزایش می‌دهد.

اخیراً گزارش شده است که fetuin-A نه تنها به عنوان یک مهارکننده کلسیفیکاسیون، بلکه به عنوان یک جزء محافظتی چندگانه با کاهش فیبروز و التهاب و تعدیل پلاریزاسیون ماکروفاژها، نقش مهمی ایفا می کند [40].

رادلوف و همکاران نشان داد که fetuin-A یک ژن هدف HIF است که نقش محافظتی در اختلال عملکرد کلیه ناشی از هیپوکسی دارد [40]. Fetuin-A اضافه بار کلسیم ماکروفاژها را به دلیل هیپوکسی کاهش می دهد. ما اخیراً نشان دادیم که پروتئین اسپایک ویروس SARS-CoV-2 ماکروفاژهای مشابه را فعال می‌کند و سطح کلسیم داخل سلولی را افزایش می‌دهد [41]. بنابراین fetuin-A ممکن است نقش جاذب کلسیم را برای تنظیم هموستاز سلولی و تعدیل پلاریزاسیون کافی برای پاسخ‌های ایمنی ذاتی معقول بازی کند و در نتیجه از التهاب بیش از حد جلوگیری کند.

سندرم‌های اختلال عملکرد ارگان‌های چندگانه (MODS) یا MODS مرتبط با عفونت یکی از دلایل اصلی مرگ در موارد شدید کووید{1}} در نظر گرفته می‌شوند [42]. التهاب بیش از حد و اختلال در تنظیم ایمنی در طول عفونت منجر به آسیب نهایی اندام به دلیل شکست پاسخ ایمنی ذاتی و هیپرسیتوکینمی می شود. بیش از عفونت سیستمیک، اندوتوکسین های باکتریایی و RNA های ویروسی توسط سیستم ایمنی ذاتی شناسایی می شوند که باعث بیان و آزادسازی سیتوکین های اولیه (TNF و INFs) می شود. علاوه بر این، پاسخ های ایمنی ذاتی خط مقدم تولید واسطه های دیررس مانند جعبه گروه 1 با تحرک بالا (HMGB1) را تحریک می کند [43]. HMGB1 درون یا خارج سلولی بیان شده در بیشتر سلول ها آلارمینی است که پس از تحریک یا پس از مرگ سلول آزاد می شود [44]. انتشار بیش از حد HMGB1 باعث تولید سیتوکین مانند IL{12}} [45] می شود. افزایش غلظت IL{14}} با پیامدهای شدید در سندرم التهابی چند سیستمی در کودکان (MIS-C) مرتبط با عفونت SARS-CoV مرتبط بود [46]. IL{19}} عمدتاً توسط مونوسیت‌ها/ماکروفاژها ترشح می‌شود، به‌ویژه هنگامی که به فنوتیپ M{20}شکل قطبی می‌شود. همچنین نشان داده شد که HMGB1 ممکن است ماکروفاژها را از طریق گیرنده Toll مانند (TLR) 4 قطبی کند [47].

تترانکتین (CLEC3B) یکی از پروتئین‌های اتصال‌دهنده HMGB است و برهم‌کنش آن ممکن است عملکرد بیولوژیکی و فرآیند التهابی را در طول عفونت تعدیل کند. پروتئین TN بسیار خالص شده آزادسازی HMGB1 ناشی از LPS وابسته به دوز را در ماکروفاژها مهار کرد [48]. اختلال در سیستم ایمنی ذاتی که منجر به فعال شدن بیش از حد سیستم ایمنی می شود، آینده شایع موارد شدید کووید-19 و سپسیس است. اخیراً نشان داده شده است که غلظت ویترونکتین خون به طور چشمگیری در بیماران سپسیس بسیار شدید کاهش می یابد [48]. اخیرا، یومینگ لی و همکاران. [49] کاهش تنظیم ویترونکتین را در موارد شدید بیماران کووید{10}} با استفاده از روش پروتئومیکس کمی بدون برچسب گزارش کرد. ما کاهش قابل توجه پلاسمایی این پروتئین را در مطالعه خود (شکل 4) با گروه های مختلف و بر اساس روش برچسب-کمی تأیید کردیم. بنابراین ویترونکتین را می توان یک نشانگر بالقوه اختلال در تنظیم ایمنی ذاتی مرتبط با شدت علائم کووید در نظر گرفت.

تترانکتین در سیستم فیبرینولیز نقش دارد که منجر به کنترل انعقاد غیر طبیعی می شود. بنابراین کاهش TN با بیماری های قلبی عروقی مانند بیماری عروق کرونر (CAD) مرتبط است [50]. قابل توجه، بسیاری از موارد شدید بیماران مبتلا به SARS-COV{2}} اختلال عملکرد عروقی احتمالاً به دلیل کمبود TN دارند. کاهش سطح سرمی TN با کاهش پاراکسوناز 1 (PON1) در بیماری های مختلف قلبی عروقی همراه است. در مطالعه ما، کاهش PON1 (شکل 4) می تواند نشانگر پیشرفت بیماری به علائم شدید باشد زیرا گزارش شده است که وجود التهاب و استرس اکسیداتیو با کاهش PON1 سرم در بیماری های قلبی عروقی مرتبط است [51]. . علاوه بر این، سطح پایین PON1 ممکن است واکنش پیش التهابی ذاتی به عفونت ویروسی را تشدید کند زیرا نشان داده شد که PON1 واکنش بیش از حد ماکروفاژها را سرکوب می‌کند و التهاب را در آترواسکلروز حفظ می‌کند [52]. اختلال در تنظیم TN بر عوامل پایین دستی AMPK مانند HIF1 تأثیر می گذارد که فنوتیپ و عملکرد سلول های ایمنی ذاتی را تنظیم می کند و پلاریزاسیون ماکروفاژها را به سمت فنوتیپ M{14} و همچنین بلوغ DC تعدیل می کند [53،54].

در مجموع، کاهش تنظیم ویترونکتین، fetuin-A و PON1 مشاهده شده در موارد متوسط ​​و شدید ممکن است با اختلال در تنظیم پاسخ‌های ایمنی ذاتی از طریق اختلال عملکرد مونوسیت/ماکروفاژ همراه باشد که منجر به آزادسازی بیش از حد سیتوکین‌ها و پیشرفت کووید می‌شود{4} } بیماری تا وضعیت شدید.

بعلاوه، آنالیز پروتئومی ما افزایش تنظیم APOE (مواد تکمیلی، شکل S4) را در موارد شدید در مقایسه با افراد سالم نشان داد. سطح پلاسمایی APOE برای تعدیل عملکرد لیپوپروتئین و بیماری های قلبی-متابولیک شناخته شده است. علاوه بر این، APOE با تغییر پلاریزاسیون ماکروفاژها و تأثیر بر فنوتیپ‌های پیش‌/ضد التهابی در فرآیند التهابی نقش دارد [55]. در توافق با این، گزارش شد که افزایش سطح APOE ممکن است با شدت کووید{6}} مرتبط باشد [56].

در جریان عفونت، تعامل سیستم ماکروفاژ-کمپلمان برای پاسخ‌های ایمنی ذاتی و همچنین تعدیل عملکردهای مکمل و انتقال از شرایط ایمنی ذاتی به شرایط ایمنی تطبیقی ​​مهم است [57]. تعامل اجزای مکمل با گیرنده‌های مختلف روی ماکروفاژها باعث ایجاد فرآیند التهابی و تولید سیتوکین می‌شود. در مطالعات مختلف پروتئومیکس گزارش شده است که اختلال در تنظیم آبشار کمپلمان [58،59] در بیماران COVID-19 و فعال شدن سیستم کمپلمان سمیت سلولی سلول T را در موارد شدید تشدید می‌کند [60]. ما افزایش قابل توجهی در مکمل‌های 1q، 5، 6، 7 (مواد تکمیلی، شکل S5) در بیماران مبتلا به کووید{12}} متوسط ​​و شدید گزارش کردیم. در طی فرآیند پاکسازی سلولی آپوپتوز، C1q پلاریزاسیون مونوسیت/ماکروفاژ را کنترل می کند و فعالیت التهابی را مهار می کند [61]. تجزیه و تحلیل غنی‌سازی ارتباط معنی‌داری را بین اجزای مکمل C1q، C5، C6، C7 و آبشارهای انعقادی نشان داد، که در آن ما همچنین دخالت سیستم کالیکرئین-کینین را از طریق کینینوژن{20}} که واکنش‌های ایمنی ذاتی را از طریق مسیر برادی کینین تعدیل می‌کند، می‌یابیم.

پژوهش حاضر از نظر حجم نمونه دارای محدودیت است. با این حال، نتایج ما مطابقت خوبی با مطالعات قبلی کووید{0}} پروتئومیکس نشان داده است که نشانگرهای زیستی را شناسایی کردیم که بیان مشابهی را نشان می‌دهند. این نشان می دهد که رویکرد پروتئومیکس دنبال شده در این مطالعه معتبر است، اما شاید بهینه نباشد.

4. نتیجه گیری

در طول عفونت SARS-COV-2، اختلال در پاسخ‌های ایمنی مشکل اصلی است که باعث تشدید بیماری کووید-19 به موارد شدید می‌شود. مسیرهای مکانیکی که منجر به اختلال عملکرد سیستم ایمنی ذاتی می‌شوند، سنگ‌های کلیدی در رفع عوارض مرتبط با عفونت کنترل‌نشده SARS-CoV{4}} هستند. تا جایی که ما می دانیم، این اولین مطالعه ای است که از رویکرد iTRAQ بر روی نمونه های پلاسما/سرم کووید{5}} استفاده می کند. سطوح سرمی TN، fetuin-A و PON1 نشانگرهای بالقوه‌ای هستند که حداقل تا حدی در سیستم ایمنی ذاتی، به ویژه در بیش فعال‌سازی ماکروفاژها دخیل هستند، و در نتیجه، می‌توانند اهداف بالقوه‌ای برای درمان کووید{9}} در نظر گرفته شوند.

5. مواد و روش ها

5.1. طرح مطالعه و جمعیت

گروه‌های مطالعه ما شامل 25 نفر است: کنترل سالم (n=5) و 20 بیمار مبتلا به SARS-COV-2 که بر اساس شدت بیماری (شکل 1) به خفیف (n=5) گروه‌بندی شده‌اند. ، متوسط ​​(n=5)، شدید (n=5) ​​و مرده (n=5). گروه مرده از ابتدای مطالعه به دلیل بیماری‌های مشترک افراد که می‌توانند بر ویژگی اثرات کووید تأثیر بگذارند، حذف شدند. همه بیماران در بیمارستان تخصصی کودکان ملک عبدالله (KASCH) و شهر پزشکی ملک عبدالعزیز (KAMC) استخدام شدند. رضایت آگاهانه توسط همه شرکت کنندگان در حالی که آنها پرسشنامه علائم بالینی و اطلاعات دموگرافیک را پر کردند امضا شد.

جمع آوری خون: 3-5 میلی لیتر خون وریدی از هر بیمار جمع آوری شد. برای جمع آوری نمونه خون از لوله های EDTA استفاده شد. سپس پلاسما با سانتریفیوژ قبل از نگهداری در دمای 80 درجه سانتیگراد برای تجزیه و تحلیل بیشتر جدا شد.

5.2. آماده سازی نمونه پلاسما پروتئومیکس iTRAQ

پنج نمونه بیولوژیکی از هر گروه در یک نمونه ادغام شدند. سپس تمام نمونه‌های پلاسما در معرض کارتریج‌های Agilent Human14 Multiple Affinity Removal Spin قرار گرفتند تا 14 پروتئین فراوان را از پلاسما طبق پروتکل ساخت (Agilent، ایالات متحده آمریکا) حذف کنند. پس از آن، هضم پروتئین با استفاده از معرف‌های 4-plex iTRAQ (Sciex، کانادا) به دنبال پروتکل ساخت با تغییرات جزئی برچسب‌گذاری شد. به طور خلاصه، 100 میکروگرم پروتئین به ترتیب با استفاده از 8 مولار اوره / 100 میلی مولار بی کربنات تری اتیل آمونیوم (TEAB)، 50 میلی مولار تریس (2- کربوکسی اتیل) فسفین (TCEP) و متیل متانتیوسولفونات (MMTS) دناتوره، احیا و آلکیله شدند. سپس نمونه های پروتئین با استفاده از تریپسین با نسبت 1:40 (تریپسین به پروتئین) به پپتیدها هضم شدند. سپس نمونه‌های پپتید به ترتیب با 114، 115، 116 و 117 برای کنترل سالم، شدید، متوسط ​​و خفیف برچسب‌گذاری شدند. سپس هر 4 نمونه نشاندار شده مخلوط و در یک نمونه ادغام شدند.

5.3. تفکیک پپتیدها و نمک زدایی

نمونه تلفیقی iTRAQ به صورت آفلاین بر اساس تبادل کاتیونی با استفاده از ستون چرخشی Pierce Strong Cation Exchange (SCX) (Thermo Scientific، ایالات متحده آمریکا) طبق دستورالعمل سازنده تقسیم شد. به طور خلاصه، ستون چرخش ابتدا با استفاده از {0}}.1 درصد اسید فرمیک شرطی شد و سپس پپتیدهای نشاندار شده در ستون بارگذاری شد. دو مرحله شستشو با استفاده از اسید فرمیک {9}.1 درصد انجام شد. سپس پپتیدها با تغییر نسبت 10 درصد غلظت استونیتریل و فرمت آمونیوم از 15 میلی‌مولار به 900 میلی‌مولار، به 22 بخش شسته شدند. سپس مرحله نمک زدایی و پاکسازی توسط جاذب پلیمری فاز معکوس با استفاده از کارتریج Oasis HLB (واترز، ایالات متحده آمریکا) انجام شد. به طور خلاصه، کارتریج به ترتیب با استونیتریل و 0.1 درصد اسید فرمیک تهویه و متعادل شد. سپس پپتیدهای نشاندار بارگذاری شدند و دو مرحله شستشو با اسید فرمیک 0.1 درصد اعمال شد. شستشوی پپتیدها با استفاده از 70 درصد استونیتریل انجام شد.

5.4. NanoLC-MS/MS

هر کسری (مجموعاً 22) روی یک نانوLC 425 Ekspert (Eksigent، دوبلین، کالیفرنیا، ایالات متحده)، همراه با TripleTOF 56{7}}0 (Sciex، Concord، Canada) در سه تکرار بارگذاری شد. جداسازی پپتیدها روی NanoLC همانطور که قبلاً توضیح داده شد [41] انجام شد. MS1 و MS/MS برای تجزیه و تحلیل iTRAQ به شرح زیر تنظیم شد: محدوده جرمی TOF 250-1500 با زمان تجمع 0.25 ثانیه. معیارهای IDA برای یون های بزرگتر از 400 m/z با حالت بار 2-5 بود. آستانه فراوانی بیش از 200 cps است. CE تنظیم شده زمانی که پارامتر معرف iTRAQ بررسی شد. پارامترهای منبع یون به شرح زیر تنظیم شد: گاز منبع یون 1 (GS1)، 25. گاز پرده (CUR)، 25; IonSpray Voltage Floating (ISVF)، 2250; دمای گرمکن رابط (HIT)، 60.

5.5. تجزیه و تحلیل پروتئومیکس کمی iTRAQ

داده‌های خام MS iTRAQ با استفاده از نرم‌افزار ProteinPilot (نسخه 4.5، Sciex) برای شناسایی و تعیین کمیت پردازش شدند. پارامترها به شرح زیر تنظیم شدند: نوع نمونه، iTRAQ 4plex، Cys، آلکیلاسیون، MMTS، هضم، تریپسین، عوامل ویژه، دناتوره سازی اوره، گونه ها، هومو ساپینس، پایگاه داده، پایگاه داده UniProt Proteome Humans (دانلود شده در 29 اکتبر 2019)؛ FDR جهانی بررسی شد.

تغییر برابری و p-value به ترتیب بر اساس میانگین شدت پپتید و آزمون t دانشجو محاسبه شد. داده‌های iTRAQ MS در کنسرسیوم ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) با شناسه PXD037400 سپرده شد.

5.6. تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک

تجزیه و تحلیل PCA با استفاده از تابع 'اصلی' در نرم افزار آماری R انجام شد. VolcaNoseR [62] برای تولید نمودارهای آتشفشان استفاده شد. ابزار آنلاین STRING [63] برای غنی‌سازی ژن و تجزیه و تحلیل مسیر با معیارهای آماری در p <{2}}.05 استفاده شد. پایگاه داده کیوتو دایره المعارف ژن و ژنوم (KEGG) برای تجزیه و تحلیل مسیر استفاده شد.

5.7. اندازه گیری سنجش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم (ELISA).

نمونه ها همانطور که قبلا توضیح داده شد [64] با استفاده از فاکتور نکروز تومور (TNF-) و کیت سنجش الایزا (SEKH-0047، Solarbio life Sciences) تهیه شدند. به طور خلاصه، 100 لیتر نمونه یا استاندارد به هر چاهک اضافه شد و سپس در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت و 30 دقیقه انکوبه شد. پس از چهار بار شستشو با بافر شستشو، یک آنتی بادی تشخیص کونژوگه بیوتین (100 ul) قبل از انکوباسیون به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد اضافه شد. مرحله دوم شستشو (چهار بار) انجام شد و استرپتاویدین-HRP (100 میکرولیتر) قبل از انکوباسیون به مدت 30 دقیقه اضافه شد. پس از شستشو، یک محلول سوبسترا (TMB) (100 ul) اضافه شد و قبل از افزودن محلول توقف به مدت 15 دقیقه در تاریکی انکوبه شد و اندازه گیری جذب در 450 نانومتر تشخیص داده شد.

منابع مالی

این مقاله با کمک مالی مرکز تحقیقات بین المللی ملک عبدالله شماره. RC20/153/R و RC20/205/R و BioBank KAIMRC NGHA.

تایید اخلاق و رضایت برای شرکت

این مطالعه توسط هیئت بازبینی نهادی (IRB) کمیته اخلاق مرکز تحقیقات پزشکی بین‌المللی ملک عبدالله (KAIMRC) با IRB RC20/153/R و RC20/205/R تأیید شد. رضایت کتبی آگاهانه از همه شرکت کنندگان در مطالعه اخذ شد.

مشارکت نویسندگان

BA: تصور و طراحی آزمایش ها و تجزیه و تحلیل و تفسیر داده ها. FAM، H⋅S، KA و HA: آزمایش ها را انجام دادند. FA، HSA و MR: داده ها را تجزیه و تحلیل و تفسیر کردند. FA، MJ، AH، و MB: معرف‌ها، مواد، ابزار تجزیه و تحلیل یا داده‌ها را مشارکت داده و مقاله را نوشت. TB: تصور و طراحی آزمایش ها و تجزیه و تحلیل و تفسیر داده ها.

بیانیه در دسترس بودن داده ها

داده های مرتبط با این مطالعه در iTRAQ MS سپرده شده است. داده های iTRAQ در کنسرسیوم ProteomeXchange با شناسه PXD037400 سپرده شده است.

بیانیه اعلام علاقه

نویسندگان اعلام می کنند که هیچ منافع مالی رقیب یا روابط شخصی شناخته شده ای ندارند که به نظر می رسد بر کار گزارش شده در این مقاله تأثیر بگذارد.

قدردانی

نویسندگان از شماره پروژه حمایت از پژوهشگران (RSP-2023/17) در دانشگاه ملک سعود، ریاض، عربستان سعودی قدردانی می کنند.

منابع

[1] M. Almutlaq، و همکاران، سیستم رنین-آنژیوتانسین کلاسیک و ضد تنظیمی: نقش‌های کلیدی بالقوه در پاتوفیزیولوژی کووید{3}}، CJC Open 3 (8) (2021) 1060-1074.

[2] M. Ciccarelli و همکاران، لیپیدومیکس بدون هدف، پروفایل‌های چربی خاصی را در بیماران COVID{1} با شدت‌های متفاوت از منطقه کامپانیا (ایتالیا)، J. Pharm نشان می‌دهد. بیومد. مقعدی 217 (2022)، 114827.

[3] Q. Zhang، و همکاران، عوامل ژنتیکی و ایمونولوژیکی انسانی در پنومونی بحرانی COVID{1}، Nature 603 (7902) (2022) 587-598.

[4] TF Aiello و همکاران، عفونت با نوع Omicron SARS-CoV{2}} با بیماری کمتر شدید در بیماران بستری شده در بیمارستان مبتلا به COVID-19، J. Infect مرتبط است. 85 (5) (2022) e152-e154.

[5] CJH von Wintersdorff، و همکاران، عفونت‌های SARS-CoV-2 نوع دلتا، بارهای ویروسی را در مجاری هوایی فوقانی در مقایسه با آلفا یا غیر متغیرهای نگران‌کننده، چهار برابر افزایش می‌دهند. Rep. 12 (1) (2022), 13922.

[6] JL Schultze، AC Aschenbrenner، COVID{1}} و سیستم ایمنی ذاتی انسان، Cell 184 (7) (2021) 1671-1692.

[7] AD Lopez-Munoz، و همکاران، پروتئین نوکلئوکپسید SARS-CoV{3}} سطح سلولی ایمنی ذاتی و سازگار را تعدیل می‌کند، علم. Adv. 8 (31) (2022) eabp9770.

[8] MS Cardoso و همکاران، برهمکنش‌های فیزیکی با باکتری‌ها و انگل‌های تک یاخته‌ای، گیرنده روبنده SSC4D را به‌عنوان یک گیرنده تشخیص الگوی طیف گسترده، Front، ایجاد می‌کند. ایمونول. 12 (2021)، 760770.

[9] X. Wei، و همکاران، کمبود EDIL3 بازسازی نامطلوب قلب را توسط تله‌های خارج سلولی نوتروفیل (NET) با واسطه پلاریزاسیون ماکروفاژ، Cardiovasc بهبود می‌بخشد. Res. 118 (9) (2022) 2179-2195.

[10] X. Cao و همکاران، Spike Protein of SARS-CoV-2 ماکروفاژها را فعال می‌کند و به القای التهاب حاد ریه در موش‌ها کمک می‌کند، 2020 bioRxiv.

[11] TE Angel، و همکاران، پروتئومیکس مبتنی بر طیف‌سنجی جرمی: قابلیت‌های موجود و جهت‌های آینده، شیمی. Soc. 41 (10) (2012) 3912-3928.

[12] T. Wang، و همکاران، مشخصات پروتئومی و متابولومیک cynomolgus macaque آلوده به SARS-CoV-2-در مراحل اولیه، Front. ایمونول. 13 (2022)، 954121.

[13] X. Nie, et al., Multi-organ proteomic landscape of COVID{2}} کالبد شکافی، Cell 184 (3) (2021) 775-791 e14.

[14] دی گوردون، و همکاران، نقشه تعامل پروتئین SARS-CoV{2}} اهدافی را برای استفاده مجدد از دارو نشان می‌دهد، Nature 583 (7816) (2020) 459-468.

[15] julian.knight@well.ox.ac.uk، CO-M.-oBACEa و کنسرسیوم CO-M.-oBA، اطلس خون COVID-19 مشخصه های شدت و ویژگی بیماری را تعریف می کند، سلول 185 (5) (2022) 916–938 e58.

[16] Y. Mohammed، و همکاران، تجزیه و تحلیل پروتئومیکس طولی پلاسما نشانگرهای زیستی نامزد جدیدی را در COVID حاد نشان می‌دهد-19، J. Proteome Res. 21 (4) (2022) 975-992.

[17] TM کیسی، و همکاران، تجزیه و تحلیل تکرارپذیری پوشش پروتئوم و کمی سازی با استفاده از برچسب های جرم ایزوباریک (iTRAQ و TMT)، J. Proteome Res. 16 (2) (2017) 384-392.

[18] T. Shu، و همکاران، پروتئومیک پلاسما نشانگرهای زیستی و پاتوژنز COVID{1}} را شناسایی می‌کند، Immunity 53 (5) (2020) 1108-1122 e5.

[19] GY Chen، G. Nunez، التهاب استریل: احساس و واکنش به آسیب، Nat. کشیش ایمونول. 10 (12) (2010) 826-837.

[20] CT Esmon، J. Xu، F. Lupu، ایمنی ذاتی و انعقاد، J. Thromb. Hemostasis 9 (Suppl 1) (2011) 182-188.

[21] J. Park، و همکاران، تجزیه و تحلیل پروفایل پروتئوم خون عمیق، ویژگی‌های عملکردی متمایز پروتئین‌های پلاسما را بین بیماران شدید و غیر شدید COVID-19، Sci نشان داد. 10 (1) (2020)، 22418.

[22] CB Messner، و همکاران، پروتئومیکس بالینی فوق‌العاده بالا، طبقه‌بندی‌کننده‌های عفونت COVID{3}} را نشان می‌دهد، Cell Syst 11 (1) (2020) 11-24 e4.

[23] C. Huang و همکاران، ویژگی‌های بالینی بیماران مبتلا به کروناویروس جدید 2019 در ووهان، چین، Lancet 395 (10223) (2020) 497-506.

[24] DM Del Valle، و همکاران، یک امضای سیتوکین التهابی شدت و بقای کووید-19 را پیش‌بینی می‌کند، Nat. پزشکی 26 (10) (2020) 1636-1643.

[25] FX Danlos، و همکاران، سطوح بالای TNF-alpha در بیماران مبتلا به COVID{2}} مقاوم به توسیلیزوماب، Eur. J. Cancer 149 (2021) 102-104.

[26] H. Li، و همکاران، مشخصات پروتئومی و متابولومیک پلاسما بازماندگان COVID-19 6 ماه پس از ترخیص، مرگ سلولی. 13 (3) (2022) 235.

[27] B. Shen، و همکاران، مشخصات پروتئومی و متابولومیک سرم بیماران COVID{1}}، Cell 182 (1) (2020) 59-72 e15.

[28] J. Sarif و همکاران، گرادیان پلاسمایی گیرنده فعال کننده پلاسمینوژن محلول از نوع اوروکیناز به پروتئوم پلاسما بیماری زا و رونوشت ایمنی مرتبط است و نتایج را در COVID{2}} شدید طبقه بندی می کند. ایمونول. 12 (2021)، 738093.

[29] M. Villar، و همکاران، مشخص کردن پروتئومیکس کمی سرم نشانگرهای زیستی پیش آگهی مرتبط با ایمنی برای علائم COVID{2}}، جلو. ایمونول. 12 (2021)، 730710.

[30] H. Wang، AE Sama، نقش ضد التهابی fetuin-A در آسیب و عفونت، Curr. مول. پزشکی 12 (5) (2012) 625-633.

[31] W. Li، و همکاران، یک پروتئین کبدی، fetuin-A، نقش محافظتی در التهاب سیستمیک کشنده ایفا می کند، PLoS One 6 (2) (2011)، e16945.

[32] M. Zhang، H. Wang، KJ Tracey، تنظیم فعال شدن ماکروفاژها و التهاب توسط اسپرمین: فصل جدیدی در یک داستان قدیمی، Crit. مراقبت پزشکی. 28 (4 Suppl) (2000) N60–N66.

[33] H. Wang، و همکاران، Fetuin از جنین در برابر TNF محافظت می‌کند، Lancet 350 (9081) (1997) 861–862.

[34] M. Ketteler، و همکاران، ارتباط غلظت پایین fetuin-A (AHSG) در سرم با مرگ و میر قلبی عروقی در بیماران تحت دیالیز: یک مطالعه مقطعی، Lancet 361 (9360) (2003) 827-833.

[35] K. Caglar، و همکاران، سرم fetuin-یک غلظت و اختلال عملکرد اندوتلیال در بیماری مزمن کلیه، Nephron Clin. تمرین کنید. 108 (3) (2008) c233-c240.

[36] NF El-Malkey، و همکاران، Fetuin-A با سرکوب مرگ سلولی اتوفاژیک، یک اثر محافظتی در برابر ایسکمی/خونرسانی مجدد روده ای ناشی از تجربی اعمال می کند. Biol. پزشکی (Maywood) 246 (11) (2021) 1307–1317.

[37] IK Poon، و همکاران، پاکسازی سلولی آپوپتوز: بیولوژی پایه و پتانسیل درمانی، Nat. کشیش ایمونول. 14 (3) (2014) 166-180.

[38] HP Jersmann، I. Dransfield، SP Hart، Fetuin/alpha2-گلیکوپروتئین HS فاگوسیتوز سلول های آپوپتوز و ماکروپینوسیتوز توسط ماکروفاژهای انسانی را افزایش می دهد، Clin. علمی (Land.) 105 (3) (2003) 273-278.

[39] JL Reynolds، و همکاران، نقش های چند منظوره برای پروتئین سرم fetuin-a در مهار کلسیفیکاسیون سلول های ماهیچه صاف عروق انسان، J. Am. Soc. نفرول. 16 (10) (2005) 2920-2930.

[40] S. Rudloff، و همکاران، Fetuin-A یک هدف HIF است که از یکپارچگی بافت در طول استرس هیپوکسیک محافظت می کند، Nat. اشتراک. 12 (1) (2021) 549.

[41] تی. برهومی، و همکاران، آپوپتوز، پاسخ‌های استرس اکسیداتیو و التهابی ناشی از پروتئین SARS-CoV{2}} در ماکروفاژهای THP{4}: نقش بالقوه آنزیم تبدیل کننده آنژیوتانسین مهارکننده (پریندوپریل)، جلو. ایمونول. 12 (2021)، 728896.

[42] C. de Roquetaillade، و همکاران، زمان‌بندی و علل مرگ در بیماران شدید COVID{1}}، Crit. مراقبت 25 (1) (2021) 224.

[43] CS Zhu، و همکاران، تنظیم درون زا و مدولاسیون دارویی انتشار و عملکرد HMGB1 ناشی از سپسیس: مروری به روز شده، سلول 10 (9) (2021).

[44] H. Yang، H. Wang، U. Andersson، هدف قرار دادن التهاب هدایت شده توسط HMGB1، جلو. ایمونول. 11 (2020) 484.

[45] N. Kamiya، HK Kim، افزایش سیتوکین HMGB1 پیش التهابی در مایع سینوویال بیماران مبتلا به بیماری Legg-calve-perthes و ارتباط با IL-6، JBMR Plus 5 (2) (2021)، e10429.

For more information:1950477648nn@gmail.com