اثر حساس به سن محدودیت کالری بر بیوژنز میتوکندری و آسیب MtDNA در کبد موش صحرایی 2

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

2.4. تأثیر سن و CR بر محتوای mtDNA و آسیب

از آنجایی که دینامیک میتوکندری ارتباط نزدیکی با حفظ mtDNA دارد [16،18]، ما محتوای mtDNA را در تمام موش‌ها با واکنش زنجیره‌ای پلیمراز کمی (qPCR) تعیین کردیم (شکل 8).

کاهش وابسته به سن در محتوای mtDNA در موش‌های AL-28(-27 درصد )و AL-32 (-23 درصد) در مقایسه با AL{{{{ 5}} حیوانات، در حالی که هیچ تفاوت آماری بین گروه های AL{-28 و AL-32 وجود نداشت. CR در جلوگیری از کاهش وابسته به سن در محتوای mtDNA تنها در 28 ماهگی بسیار مؤثر بود که منجر به افزایش (به علاوه 19 درصد) ارزش در گروه CR{11}} در مقایسه با همتای همسان با سن تغذیه شده با AL شد. علاوه بر این، تفاوت آماری بین مقدار AL-18 و گروه CR-28 وجود نداشت. همانطور که برای نشانگرهای دیگر در کار حاضر مشاهده شد، CR در 32 ماهگی چندان مؤثر نبود زیرا هیچ تفاوتی بین مقدار AL{17}} و همتای CR-32 وجود نداشت. به منظور تعمیق تجزیه و تحلیل در سطح آسیب mtDNA، ما محتوای نسبی 4.8 Kb "حذف رایج" را با qPCR اندازه گیری کردیم (شکل 9).

هیچ تغییر قابل توجهی با سن و یا با CR در محتوای نسبی حذف 4.8 کیلوبایت در همه گروه‌های مورد آزمایش مشاهده نشد.

در نهایت، ما سه ناحیه خاص از mtDNA را برای بروز پورین‌های اکسید شده، عمدتاً 8-oxo-deoxyguanosine (8- اکسید)، با استفاده از آنزیم حساس به پورین‌های اکسید شده فرمیدوپیریمیدین DNA گلیکوزیلاز (Fpg) غربال کردیم. این سه ناحیه به ترتیب شامل حلقه جابجایی (حلقه D)، منشأ تکثیر رشته نور (Ori-L) و بخش‌هایی از هر دو زیرواحد NADH دهیدروژناز (ND) 1 و 2 (ND1/ND2) بودند. شکل 10).

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

همانطور که در شکل 10 نشان داده شده است، درصد بروز 8- اکسید به طور قابل توجهی بین گروه های موش در هر منطقه تجزیه و تحلیل شده متفاوت بود، اگرچه با الگوی مشابه. آزمون پس‌دکتر اهمیت کاهش حضور 8-اکسید در موش‌های صحرایی CR-28 را در مقایسه با هر دو گروه AL-18 و AL{-28 نشان داد ({{7} } درصد CR-28 در مقابل AL-18 و-43 درصد CR-28 در مقابل AL-28 در حلقه D;-48 درصد CR -28 در مقابل AL-18و-49 درصد CR-28 در مقابل.عصاره سیستانچ ضد تشعشعAL-28 در Ori-L؛-54 درصد CR-28 در مقابل AL-18 و-56 درصد CR-28 در مقابل AL{{{ 7}} در ND1/ND2).CR نشان داد که در جلوگیری از آسیب اکسیداتیو mtDNA تا 28 ماه موثر است، در حالی که بروز همان آسیب بین AL{11}} و CR موش ها پورین‌های اکسید شده قبلاً در موش‌های AL{13}} بدون نشان دادن افزایش وابسته به سن در حیوانات AL-28 شناسایی شدند. مقایسه بین گروه AL-32 و CR-32 تفاوت معناداری را نشان نداد. با توجه به مقادیر منطقه خاص، جالب است که مشخص شود بروز حلقه D در بین مقادیر از مناطق آزمایش شده در هر گروه بالاترین بود، بنابراین از یافته‌های قبلی حمایت می‌کند که این منطقه را به عنوان یک نقطه داغ برای آسیب اکسیداتیو نشان می‌دهد [17،{{ 20}}].

شکل 10. بروز آسیب پورین های اکسید شده در ناحیه D-loop، Ori-L، و mtDNA ND1/ND2 در کبد از AL-18، AL-28، CR-28، AL موش‌های -32 و CR-32- ماهه. (آ). میله‌ها داده‌های به‌دست‌آمده از دو آزمایش مستقل انجام‌شده در سه تکرار را نشان می‌دهند و با استفاده از آزمون ANOVA یک طرفه و آزمون مقایسه چندگانه توکی تجزیه و تحلیل شدند. در نمایش گرافیکی، داده‌ها در برابر مقدار موش‌های AL{12}} نرمال‌سازی شده‌اند، به صورت 1 ثابت شده‌اند و به‌عنوان مقدار میانگین و SD نشان داده شده‌اند.*p<0.05 versus=""><0.05versus al-28="" rats.n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" (a)d-loop;(b)ori-l;(c)="" nd1/nd2.(b).representative="" gel="" of="" formamidopyrimidine="" dna="" glycosylase="" (fpg)-treated="" and="" untreated="" total="" dna="" from="" one="" cr-28="" and="" one="" al-28="" rat;="" 5="" ng="" total="" dna="" were="" amplified="" using="" the="" d-loop="" primers.="">گیاه سیستانچمقدار کمی از هر تکثیر PCR بر روی ژل آگارز اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی شده قرار گرفت و برای شدت باند آنالیز شد.

تمام یافته های گزارش شده در مورد اثربخشی CR در گروه های هم سن و سال در جدول 1 خلاصه شده است.

3. بحث

در جستجوی طولانی مدت برای رویکردهایی که قادر به مقابله با کاهش تدریجی پیری هستند، CR به دلیل تأثیرات مثبت آن که در مجموعه گسترده ای از ارگانیسم ها از مخمر گرفته تا انسان گزارش شده است، اهمیت بسیار زیادی پیدا کرده است [22]. ثابت شده است که CR بر تعداد زیادی از مسیرهای مولکولی تأثیر می گذارد. در این میان، برخی به ویژه در تعدیل بیوژنز و فعالیت میتوکندری موثر هستند، مانند آنهایی که مواد مغذی و/یا سطوح انرژی مانند کیناز وابسته به AMP (AMPK) و سیرتوئین‌ها را که در آنها با برنامه‌ریزی مجدد میتوکندری ناشی از CR همکاری می‌کنند، موثر هستند. متابولیسم [23]. با بهبود متابولیسم اکسیداتیو، CR تولید میتوکندریایی ROS و آسیب های مولکولی ناشی از افزایش وابسته به سن این گونه های فعال را کاهش می دهد [8-10]. اگرچه چندین مطالعه اثرات CR را در سطح میتوکندری بررسی کردند [3,{8}},24]، کار جامعی در مورد اثرات این مداخله تغذیه ای بر اندامک ها هنوز وجود ندارد. بنابراین، این مطالعه به دنبال آزمایش وجود مرزهایی برای اثربخشی CRs در مجموعه بزرگی از نشانگرهای میتوکندری بود. به طور خاص، ما بر مقایسه بین اثرات ناشی از این رژیم غذایی در موش‌های مسن ({10}}ماهه) و بسیار مسن (32-ماهه) تمرکز کردیم تا بررسی کنیم که آیا تداخلی بین CR وجود دارد یا خیر. و پیشرفت پیری تجزیه و تحلیل نتایج تصویر پیچیده ای از اثربخشی CR بر بیوژنز میتوکندری و آسیب mtDNA را نشان داد که در جدول 1 خلاصه شده است.

سیستانچ می تواند ضد پیری باشد

3.1. نشانگرهای میتوکندری در 28-موش صحرایی یک ماهه

تعداد زیادی از نشانگرهای میتوکندری به طور مثبت تحت تأثیر CR در موش‌های 28- ماهه قرار گرفتند. یعنی، کاهش مرتبط با سن در فعالیت سیترات سنتاز، در مقادیر پروتئین TFAM، MFN2 و DRP1، و در محتوای mtDNA در مقایسه گروه کنترل AL-18 با گروه AL-28 گزارش شد. . همه این تغییرات توسط CR در 28-موش‌های یک ماهه (CR-28) جلوگیری شد. این نتایج از اثر ضد پیری CR تا این سن در کبد موش حمایت می کند. به طور مشابه، کاهش بروز پورین های اکسید شده در هر سه ناحیه mtDNA مورد سنجش، ناشی از CR، این دیدگاه را بیشتر تقویت می کند. قابل توجه، این آسیب اکسیداتیو قبلاً در حیوانات AL-18 بدون افزایش وابسته به سن در موش‌های AL-28 وجود داشت که نشان می‌دهد ظاهر آن ممکن است به عنوان نشانگر اولیه پیری شناخته شود. توجه ویژه باید به پنج نشانگر میتوکندریایی که تحت تأثیر CR در موش‌های 28- ماهه قرار نگرفته‌اند، یعنی مقادیر پروتئین LonP1، داده شود. Cvt c، OGGl، و APE1 و محتوای حذف ۴.۸ کیلوبایتی. در واقع، همانطور که برای LonP1 و Cyt c، CR از کاهش مرتبط با افزایش سن در حیوانات AL{22}} جلوگیری نکرد، در حالی که مقادیر پروتئین OGG1 و APE1 و همچنین محتوای حذف 4.8 کیلوبایت، مانع از کاهش مربوط به سن نشد. تحت تاثیر سن و یا CR. LonP1 مسئول تخریب TFAM خسته [25-27] است و گزارش شده است که با افزایش سن [28] در کبد موش [29] تا سن 27 ماهگی کاهش می یابد. ما قبلاً پیشنهاد کردیم که چنین بیان کاهش یافته LonP1 [16] در اثر افزایش سن ممکن است به فعالیت آن در حذف TFAM متصل به mtDNA مربوط باشد [26]. به عنوان یک توضیح احتمالی برای ناکارآمدی CR برای جلوگیری از کاهش ناشی از افزایش سن در بیان LonP1، علیرغم بیان ترمیم شده TFAM و اتصال TFAM به مناطق خاص mtDNA (داده های حاضر و Picca و همکاران [15])، CR است. فعال‌سازی با واسطه Sirt3 [30] که ممکن است بر مقدار پروتئین LonP1 از طریق داستیلاسیون القایی نیز تأثیر بگذارد. یک فرضیه متفاوت را می توان برای توضیح ناکارآمدی CR برای جلوگیری از کاهش وابسته به سن در مقدار Cyt c ارائه کرد. این پروتئین محرک اصلی مسیر آپوپتوز میتوکندری از طریق رهاسازی آن به سیتوزول است، بنابراین کاهش مقدار داخل میتوکندریایی آن در موش‌های صحرایی AL{47}} با توجه به مقدار AL{48}} نشان دهنده افزایش در فرآیند آپوپتوز ذاتی با پیری [16،31]. علاوه بر این، همانطور که برای LonP1، مقدار Cytc در موش‌های CR-28 همچنان به طور قابل‌توجهی کمتر از مقدار در حیوانات AL-18 بود، که نشان می‌دهد CR به طور قابل‌توجهی بر تنظیم نهایی بیان Cytc تأثیری ندارد. / انتشار به سیتوزول و احتمالاً افزایش وابسته به سن در مسیر آپوپتوز میتوکندری. این در توافق با ارتقاء آپوپتوز گزارش شده قبلی با واسطه CR [23] است.رشد آلت تناسلی سیستانچیاز آنجایی که مسیر آپوپتوز را می توان با تجمع آسیب DNA نیز تحریک کرد [32،33]، ما بیان پروتئین دو آنزیم BER میتوکندری اصلی یعنی OGG1 و APE1 را تعیین کردیم. میزان پروتئین هر دو با افزایش سن و CR از 18 تا 28 ماهگی تحت تاثیر قرار نگرفت. توضیح احتمالی این است که بیان دو آنزیم BER قبلاً در موش‌های AL{6}} افزایش یافته و برای مقابله با آسیب افزایش یافته مرتبط با افزایش سن به mtDNA کافی بوده است. در واقع، افزایش وابسته به سن در فعالیت OGG1 میتوکندری [34،35] و APE1 میتوکندری [36] در کبد جوندگان گزارش شده است که از حیوانات 3-6-ماهه به 20-23-ماهه منتقل می‌شوند. قدیمی‌ها، احتمالاً برای مقابله مؤثر با افزایش آسیب mtDNA مرتبط با سن ایجاد می‌شوند. همه اینها بیشتر از این فرضیه ما حمایت می کند که آسیب های mtDNA، که توسط OGG1 و APE1 ترمیم شده است، در اوایل زندگی جوندگان ظاهر شد (آنها قبلاً در موش های AL{21}} وجود داشتند) و از طریق یک ارتباط رتروگراد میتوکندری-هسته ایجاد شد. افزایش زودرس در بیان آنزیم های BER. در مورد عدم وجود اثر CR روی OGG1 و APE1، ما نشان می‌دهیم که حضور کاهش‌یافته ROS و آسیب‌های اکسیداتیو مرتبط با بیان هر دو آنزیم متفاوت از بیان هر دو آنزیم که با حیوانات AL-حیوانات همسان سنی متفاوت نبود، به طور مؤثری خنثی شد. در مورد محتوای حذف 4.8 کیلوبایت، هیچ افزایش مرتبط با سن از حیوانات AL-18 به حیوانات AL{-28 وجود نداشت، گویی که این آسیب mtDNA نیز بسیار زود در طول عمر موش‌ها و سن آن ظاهر شده است. همانطور که در مطالعات دیگر گزارش شده است، افزایش مرتبط تنها در مقایسه با حیوانات جوان قابل تأیید بود [19،{35}}]. ناکارآمدی CR برای کاهش قابل توجه محتوای حذف 4.8 کیلوبایت در موش های صحرایی CR در مقایسه با حیوانات AL{-28 و AL-18 بیشتر نشان می دهد که CR طولانی مدت باعث ایجاد یک کاهش قابل توجهی در حضور ROSin در کبد. این ممکن است منجر به نوعی سطح حالت پایدار حذف 4.8 کیلوبایتی شود که با همتای AL-18 تفاوتی ندارد و با محتوای mtDNA مربوطه سازگار است. اگرچه ترمیم mtDNA با افزایش سن کاهش پیدا نکرد، کاهش مربوط به سن در محتوای mtDNA همچنان هنگام انتقال از موش‌های AL{47}} به موش‌های AL-28 وجود داشت، همانطور که قبلاً در بافت‌های مختلف توضیح داده شد. جوندگان مسن [3،15،19،{52}}]. این ممکن است با افزایش پیوند TFAM مرتبط با سن در مناطق خاصی از mtDNA که همچنین نقاط داغ آسیب دیده بودند توضیح داده شود [19]. بنابراین این فرضیه از دست دادن mtDNA مربوط به سن را با بیان و فعالیت بدون تغییر آنزیم های ترمیم کننده آشتی می دهد. در حمایت بیشتر از این فرضیه، عدم از دست دادن mtDNA در موش‌های صحرایی CR{56}} است. در واقع، ما قبلاً نشان دادیم که CR از افزایش وابسته به سن در اتصال به TFAM در مناطق خاص mtDNA جلوگیری می‌کند [15]. بنابراین، با توجه به داده‌های کنونی و قبلی ما، مدولاسیون اتصال TFAM ممکن است یکی از مکانیسم‌های مولکولی درگیر در تنظیم بیوژنز میتوکندری با واسطه پیری و CR باشد. این تنظیم توسط پیری و CR همچنین نشان داده شده است که از طریق تعادل دینامیک میتوکندریایی که تحت تأثیر پیری قرار می‌گیرد دنبال می‌شود [43] و منجر به شیوع همجوشی بر شکافت می‌شود [44،45]. بنابراین، ما شاخص همجوشی (FI) را در همه حیوانات مورد سنجش محاسبه کردیم (شکل 6) و مقادیری را یافتیم که نتایج قبلی ما را تأیید و گسترش داد [16].فواید سالسا سیستانچبرخی از نشانه‌های جدید را می‌توان توسط مطالعه حاضر جمع‌آوری کرد، یعنی در موش‌های AL-18 مقادیر FI محدوده کوچکی را پوشش می‌داد، در حالی که در AL-28 محدوده FI بسیار بزرگ‌تر بود، با علامت مشخص افزایش وابسته به سن در مقادیر فردی، در موش‌های CR-28 محدوده کوچک مقادیر نشان‌دهنده اثر مثبت CR در القای شکافت است، با افزایش کلی در مقادیر فردی DRP1 در مقایسه با مقادیر منفرد از گروه AL-28. در حالی که شکافت کارآمد ممکن است اندامک های آسیب دیده را حذف کند، یک همجوشی موجودیت مشابه ممکن است انتشار ماکرومولکول های آسیب دیده در شبکه میتوکندری را تضمین کند، بنابراین اثرات منفی آنها را رقیق کند [46]. بنابراین، بازیابی تعادل دقیق دینامیک میتوکندری با واسطه CR ممکن است پیامدهای مثبتی را بر مدولاسیون بیوژنز میتوکندری القاء کند، و به طور هم افزایی با ارتباط رتروگراد آسیب mtDNA عمل کند. این مطابق با ادبیات موجود است که گزارش می‌دهد وضعیت مواد مغذی و تغییرات متابولیکی می‌تواند تعادل دینامیک میتوکندری را تعدیل کند [47] و بنابراین، بر بیوژنز اندامک‌ها نیز تأثیر می‌گذارد. به طور خاص، تنظیم حساس به ROS بیوژنز میتوکندری می تواند تنها با افزایش محدود ROS از طریق افزایش تعداد اندامک ها مواجه شود [48] و حضور ROS با کاهش CR [15] ممکن است از غلبه بر سطح آستانه ای که ممکن است منجر شود جلوگیری کند. به از دست دادن میتوکندری اثربخشی CR در کاهش حضور ROS در مطالعه حاضر با کاهش تجمع پورین‌های اکسیده شده در مناطق تجزیه‌شده mtDNA در موش‌های CR{15}} که از بهبود کلی متابولیسم میتوکندری پشتیبانی می‌کند و قادر به مقابله با سن است، اثبات شد. -کاهش مرتبط در واقع، حضور ROS با کاهش CR به طور گسترده ای در سطح پروتئین ها و لیپیدهای میتوکندری نیز نشان داده شده است. به طور خاص نشان داده شده است که CR تغییرات اکسیداتیو پروتئین های میتوکندری را در قلب موش کاهش می دهد |49] و شاخص اشباع/غیر اشباع را در غشاهای میتوکندری اصلاح می کند و از آسیب اکسیداتیو جلوگیری می کند و سیالیت غشاء را حفظ می کند [8]. علاوه بر این، نشان داده شده است که CR باعث کاهش تولید ROS توسط کمپلکس های تنفسی میتوکندری در هر دو عضله اسکلتی موش و کبد می شود [8]. اثرات مفید CR در سطح ROS همچنین شامل خنثی سازی بهبود یافته ROS و افزایش ترمیم مولکول های آسیب دیده ROS است [10]. علاوه بر این اثر، تغییرات در عملکرد میتوکندری با فعال‌سازی AMPK حساس به CR و سیرتوئین‌ها تعدیل می‌شوند که فعالیت فاکتورهای رونویسی را تنظیم می‌کنند. و جعبه چنگال (FoxO)، که دومی در بیوژنز، متابولیسم اکسیداتیو و گردش میتوکندری نقش دارد [23]. بنابراین، تأثیر مثبت واسطه CR بر متابولیسم میتوکندری باید با سایر مسیرها تعامل داشته باشد تا محرک نهایی بیوژنز میتوکندری را تعدیل کند، طبق مدل ارتباط رتروگراد با هسته [50].

3.2. نشانگرهای میتوکندری در 32-موش‌های یک ماهه

در مورد مقایسه بین موش‌های AL-32 و CR-32، داده‌های ما فقدان کلی تفاوت‌های معنی‌دار را نشان می‌دهد. این ممکن است نشان دهنده یک محدودیت سنی برای اثربخشی CR در مقابله با کاهش مربوط به سن در گذر از 28 به 32 ماهگی باشد. با توجه به اثر سن، هر چند، بسته به نشانگر تجزیه و تحلیل شده، می توان نتیجه گیری های متفاوتی را انجام داد. در واقع، در هر دو گروه 32- ماهه، کاهش وابسته به سن در فعالیت سیترات سنتاز، مقادیر TFAM، LonP1، OGG1، APE1، محتوای mtDNA و حذف 4.8 کیلوبایت در یک سطح حفظ شد. که مشابه آن چیزی بود که در موش‌های AL{13}} مشاهده شد یا به طور نسبی/کاملاً مانند مقادیر Cytc، MFN2، DRP1 و بروز پورین‌های اکسید شده در مناطق خاص mtDNA جلوگیری شد. این رفتارهای مختلف ممکن است به دلیل تأثیر متقابل مسیرهای مختلف شامل نشانگرهای تحلیل شده باشد. نتیجه‌گیری دیگر را می‌توان با مقایسه هر دو گروه 32-ماهانه با گروه‌های AL-18 و AL-28 برای مقادیر MFN2 و DRP1 برجسته کرد. در واقع، کاهش مربوط به سن از گروه AL-18 به هر دو گروه AL{-32 و CR-32 برای دو پروتئین پویا وجود نداشت. با توجه به اینکه در مقایسه بین گروه AL-18 و هر دو گروه 32-ماهه مانند سایر نشانگرها، کاهش مربوط به سن مشابه یا کوچکتر از اندازه بین AL{{{ گروه‌های 30}} و AL-28، می‌توانیم عواقبی را در پی داشته باشیم. این ممکن است نشان دهد که تغییرات مربوط به سن نشانگرها ممکن است در 18 ماهگی شروع شده باشد یا قبلاً وجود داشته باشد، و سپس به پایین‌ترین/بالاترین مقدار خود در حیوانات مسن،{34}}ماهه با «سرعت» رسیده باشد. معمولی فرآیند پیری برعکس، در حیوانات بسیار مسن ({36}}ماهه)، به نظر می‌رسد که «سرعت» این فرآیند کند می‌شود، زیرا مقادیر کمتر یا برابر با مقادیر همتایان AL-18 هستند، اما نه کمتر. /higher from the AL-28، علیرغم مدت زمان طولانی سپری شده، پیدا شد. فرضیه دو سرعت متفاوت در فرآیند پیری [16] نشان می‌دهد که آسیب‌ها، به دلایل مختلف، شروع به تأثیر بر فعالیت‌های فیزیکی و متابولیک در دوران بزرگسالی در هر موش می‌کنند. چنین آسیب‌هایی به‌طور مؤثری با مکانیسم‌های جبرانی مقابله می‌شوند و آسیب‌ها آشکارا ظاهر نمی‌شوند، که مصادف با یک دوره میانسالی پایدار است که با هموستاز موفق مشخص می‌شود. در این مطالعه، ما موش‌هایی را شناسایی کردیم که «سریع» پیر می‌شوند که در آن‌ها تعادل بین آسیب‌های مداخله‌گر و مکانیسم‌های جبرانی بعداً در زندگی از بین می‌رود.دوز cistanche tubulosa redditدر این حیوانات، که بخش بزرگ‌تری از گروه AL-28 را تشکیل می‌دهند، آسیب‌ها از آستانه سازگار با فعالیت‌های عادی فراتر رفته و یک وضعیت تغییر یافته ظاهر می‌شود. برعکس، بخش کوچکتر باقی مانده از جمعیت سالخورده بررسی شده تعادل هموستاتیک بین آسیب ها و ترمیم را برای مدت طولانی تری حفظ می کند و گروه حیواناتی را تشکیل می دهد که "آهسته" پیر می شوند، از جمله AL-32 و CR{{2} } موش. فرضیه مشابهی در مورد سرعت های مختلف پیری اخیراً برای انسان نیز ارائه شده است [51]. در مجموع، این نتایج نشان می‌دهد که حیوانات بسیار مسن ممکن است بدون تأثیر قابل توجهی توسط CR و احتمالاً به دلیل استعداد ژنتیکی برای مقابله بهتر با اختلال عملکرد میتوکندری مربوط به سن به طول عمر رسیده باشند، اما چنین فرضیه‌ای تحقیقات آینده را تضمین می‌کند. این یافته‌های جدید می‌توانند پاسخی به سؤال اصلی و حیاتی در مورد وجود محدودیت‌هایی برای اثربخشی CR، که توسط اینگرام و دی کابو در مطالعه بسیار عمیق خود در مورد این موضوع l52l مطرح شده است، ارائه دهند و امکان شناسایی چنین محدودیت‌هایی را با سن 28 ماه برای کبد موش. با این وجود، این نتیجه گیری که CR یا هر رژیم غذایی عواقب مفیدی را در موش هایی که به طور طبیعی مستعد طول عمر هستند، به همراه نداشته است، نباید بر اعتماد کلی به اثربخشی این مداخله غذایی تأثیر بگذارد. جلوگیری از بسیاری از تغییرات مربوط به سن در بیوژنز میتوکندری و آسیب mtDNA در کبد موش‌های صحرایی 28- ماهه. این بیشتر CR را به عنوان یک استراتژی مستدل برای مقابله موثر با کاهش پیری در جمعیت عمومی تأیید می کند.

4. مواد و روش ها

4.1. حیوانات

این مطالعه توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات در دانشگاه فلوریدا تایید شد. تمام مراحل مطابق با دستورالعمل های موسسه ملی بهداشت (NIH) برای مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی انجام شد. نمونه‌های کبد از موش‌های صحرایی نر فیشر 344× براون نروژی (F344BNF1) بود که از مستعمره مؤسسه ملی پیری (ایندیاناپولیس، IN، ایالات متحده آمریکا) به‌دست آمد و به صورت جداگانه در دمای (20+ /{5}} درجه) و نور نگهداری شد. محیط کنترل شده (12-ساعت چرخه نور/تاریکی) با غذای منظم موش و آب در دسترس به طور آزاد در بخش تحقیقات پیری و سالمندان، بخش زیست شناسی پیری، کالج پزشکی، دانشگاه فلوریدا، گینزویل، فلوریدا ( ایالات متحده آمریکا). محدودیت کالری از 3.5 ماهگی (محدودیت 10 درصدی) شروع شده بود، در 3.75 ماهگی به محدودیت 25 درصدی افزایش یافت و از 4 ماهگی تا پایان عمر هر حیوان، یعنی در 28 ماهگی، در محدودیت 40 درصدی حفظ شد. {17}}) یا 32 ماه (CR{19}}) سن. حیوانات با کالری محدود با رژیم غذایی غنی شده NIH{21}}NIA تغذیه شدند تا اطمینان حاصل شود که آنها دچار سوءتغذیه نیستند، در حالی که به حیواناتی که به طور آزاد تغذیه می شدند رژیم غذایی موش NIH31 داده شد. حیوانات از گروه‌های زیر تشکیل می‌شدند: 18-ماهیانه به صورت آزادانه (AL-18، n=6)،28-ماهیانه تغذیه آزادانه (AL) -28، n=6)،28-کالری محدود شده در ماه (CR-28، n=6)، 32-تبلیغ ماهانه موش‌های صحرایی تغذیه شده (AL-32، n=6)، و 32-ماهیانه با کالری محدود (CR-32، n =6). حیوانات قبل از قربانی بیهوش شدند و نمونه های کبد بلافاصله خارج شدند، در ایزوپنتان خنک شده توسط نیتروژن مایع منجمد شدند و تا تجزیه و تحلیل بیشتر در نیتروژن مایع ذخیره شدند.

4.2. تعیین فعالیت سیترات سنتاز

تعیین فعالیت سیترات سنتاز مانند [17] انجام شد. به طور خلاصه، 8{2}} میکروگرم از کل پروتئین‌های خالص‌شده از نمونه‌های کبد در بافر واکنش انکوبه شدند (0.31 میلی‌مولار استیل کوآ، 1{11}}0 میلی‌مولار بافر تریس ( pH 8.1)، 0.25 درصد Triton X{10}}، 0.1 میلی‌مولار 550-دیتیول-بیس{15}}نیتروبنزوئیک اسید، و 0.5 میلی‌مولار اگزالواستات (1 میلی‌لیتر) در 30 درجه.

فعالیت سیترات سنتاز (umol×min-I×g بافت) به روش اسپکتروفتومتری با اندازه‌گیری میزان تولید اسید تیونیتروبنزوئیک (TNB) در طول موج ۴۱۲ نانومتر تعیین شد.

4.3. وسترن ایمونوبلات

میتوکندری های کبد در محیطی حاوی 220 میلی مولار مانیتول، 70 میلی مولار ساکارز، 20 میلی مولار Tris-HCl، 1 میلی مولار EDTA و 5 میلی مولار EGTA، pH 7.4، در دمای 4 درجه مطابق با 【16】 جدا شدند. علاوه بر این، 10 میکروگرم از پروتئین های میتوکندری برای تجزیه و تحلیل ایمونوبلات وسترن استفاده شد. Anti-TFAM(1:50،000)، anti-VDAC(1:50،000، Abcam، Cambridge، UK)، anti-OGG1 (1:2500، Abcam، Cambridge، UK) , anti-APE1 (1:5000, Abcam, Cambridge, UK), anti-MFN2 (1:5000, Abnova, Taipei, Taiwan), anti-DRP1 (1:2500, Abnova, Taipei, Taiwan) آنتی سیت c(1:500، فارمینگن، سن دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا)، و آنتی لون پروتئاز (1:10000) به عنوان آنتی بادی های اولیه استفاده شد. آنتی بادی های ضد TFAM و Lon به ترتیب توسط دکتر H. Hinagaki (بخش شیمی، موسسه تحقیقات صنعتی ملی ناگویا، ناگویا-شی، آیچی، ژاپن) و دکتر سی سوزوکی (دپارتمان) به صورت سفارشی ساخته و اهدا شد. بیوشیمی و بیولوژی مولکولی، دانشکده پزشکی نیوجرسی، دانشگاه پزشکی و دندانپزشکی نیوجرسی، نیوآرک، نیوجرسی، ایالات متحده). پروتئین‌ها با نورتابی شیمیایی تشخیص داده شدند و باندهای واکنش‌پذیر با استفاده از نرم‌افزار Image Lab (BioRad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) اندازه‌گیری شدند و در برابر بیان VDAC نرمال شدند.

4.4. تعیین mtDNA و mtDNA 4.8 Kb "حذف رایج" محتوا

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز زمان واقعی کمی (qPCR) برای تعیین محتوای نسبی mtDNA و mtDNA 4.8 Kb "حذف رایج" استفاده شد. واکنش ها از طریق شیمی SYBR Green با استفاده از 3 نانوگرم از DNA کل به عنوان الگو و آغازگرهای زیر انجام شد: MtDNA برای 5-GGTTCTTACTTCAGGGCCATCA-3'(nt 15.785-15.806)، mtDNA rev. 5'-TGATTAGACCCGTTACCATCGA-3'(nt 15,868-15,847); -actin برای 5'-CCCAGCCATGTACGTAGCCA-3'(nt 2181-2200), -actinrev5'-CGTCTCCGGAGTCCATC AC-3'(nt 2266-2248);4.8 del برای {{26} }AAGGACGAACCTGAGCCCTAATA-3'(nt8109-8131), 4.8 del rev 5'-CGAAGTAGATGATGCGTATACTGTA-3'(nt 13,020-12,996). محتوای mtDNA نسبت به هسته همانطور که در [19] گزارش شده است، DNA و محتوای 4.8 Kb "حذف مشترک" نسبت به mtDNA تعیین شد.

4.5. تجزیه و تحلیل پورین های اکسید شده

Formamidopyrimidine DNA glycosylase (Fpg) (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) هضم DNA کل برای تشخیص پورین های اکسید شده استفاده شد [53].

تکثیر PCR نواحی D-loop، Ori-L، و ND1/ND2 mtDNA با استفاده از جفت پرایمرهای مربوطه انجام شد:

D-loop For5'-TCTGGTCTTGTAAACCAAAAATGA-3'(nt 15,302-15,325),D-loop Rev 5'-TGGAATTTTCTGAGGGTAGGC-3'(nt 16,302-16, 282)؛ Ori-L برای 5'-AACCAGACCCAA ACACGAAA-3' (nt 4414-4433),Ori-L Rev 5'-CTATTCCTGCTCAGGCTCCA-3'(nt 5407-5388);ND1 برای 5 '-AGGACCATTCGCCCTATTCT-3'(nt3390-3409)، ND1 Rey 5'-CGCCAAC AAAGACTGATGAA3'(nt 4399-4380) روی 5 نانوگرم DNA کل تیمار شده با Fpg و درمان نشده. شرایط چرخه عبارت بودند از: پیش انکوباسیون 10 دقیقه در دمای 95 درجه، به دنبال آن 18 سیکل در دمای 15 درجه سانتیگراد، 15 درجه سانتیگراد 58 درجه سانتیگراد و 1 دقیقه و 72 درجه سانتیگراد. شدت نوار نوارهای رنگ آمیزی شده با اتیدیوم بروماید توسط نرم افزار Image Lab (BioRad Laboratories Inc., CA, USA) آنالیز شد. برای بهبود تجسم گرافیکی، نسبت بین شدت باند تیمار شده با Fpg و درمان نشده به عنوان درصدی از مکمل به 100 بیان شد.

4.6. آمار

داده ها به صورت میانگین و انحراف معیار (SD) بیان می شوند. از آزمون آنالیز واریانس یک طرفه با آزمون مقایسه چندگانه توکی استفاده شد. برای تمامی آزمون‌ها، معنی‌داری آماری در سطح 5 درصد تعیین شد. آنالیزها با استفاده از یک بسته آماری خاص اجرا شدند (Stata Corp. 2005. Stata Statistical Software: Release. College Station, TX, USA).

این مقاله از Int استخراج شده است. جی. مول. علمی 2021، 22، 1665. https://doi.org/10.3390/ijms22041665 https://www.mdpi.com/journal/ijms