چگونه پروتئین های ترمیم کننده غشای سلولی، انتقال سیگنال فاکتور رونویسی را برای کنترل فیبروز کلیه تنظیم می کنند

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

هایچانگ لی

کلیهفیبروز با پیشرفت حاد همراه استکلیهآسیب به بیماری مزمن کلیه MG53، یک پروتئین ترمیم کننده غشای سلولی، نشان داده شده است که از آسیب به سلول های اپیتلیال کلیه و آسیب حاد کلیه محافظت می کند. در اینجا، نقش MG53 را در مدولاسیون ارزیابی کردیمکلیهفیبروز در موش های پیر و در موش های مبتلا به انسداد حالب یک طرفه (UUO) یک مدل شناخته شده از فیبروز پیشرونده کلیه است. موش‌های دارای ابلیشن MG53 نسبت به موش‌های MG53-دست‌نخورده همسن، با افزایش سن، فیبروز بینابینی بیشتری داشتند. به طور مشابه، در غیاب MG53،کلیهفیبروز در مقایسه با موش‌های دارای MG53 دست‌نخورده در کلیه انسداد در مقایسه با کلیه بدون انسداد طرف مقابل یا کلیه‌های موش‌هایی که تحت عمل شم قرار گرفتند، اغراق‌آمیز بود. حالب انسداد کردکلیه هادر موش‌های دارای کمبود MG53 نیز التهاب به‌طور قابل‌توجهی بیشتر از کلیه‌های انسداد حالب از موش‌های سالم MG53 بود. آزمایش‌های آزمایشگاهی نشان داد که MG53 می‌تواند به هسته‌های سلول‌های اپیتلیال لوله‌ای پروگزیمال وارد شود و مستقیماً با مؤلفه p65 فاکتور رونویسی NF-kB تعامل داشته باشد و توضیح احتمالی التهاب افزایش یافته در غیاب MG53 را ارائه دهد. برای آزمایش این، بیان MG53 افزایش یافته از طریق سلول های مهندسی شده یا تحویل مستقیم پروتئین نوترکیب به موش هایی که در معرض UUO قرار داشتند داده شد. این باعث کاهش فعال شدن و التهاب NF-kB و کاهش فیبروز کلیه شد. بنابراین، MG53 ممکن است نقش درمانی در درمان التهاب مزمن کلیه داشته باشد و در نتیجه محافظت در برابر آن ایجاد کندفیبروزکه منجر به فنوتیپ بیماری مزمن کلیه می شود.

Cistanche tubulosa از بیماری کلیوی جلوگیری می کند، برای دریافت نمونه اینجا را کلیک کنید

بیانیه ترجمه التهاب مزمن منجر به بازسازی فیبروتیک می شود که همچنین ممکن است زمینه ساز انتقال از آسیب حاد کلیه به بیماری مزمن کلیه باشد. فعال شدن فاکتور رونویسی پروتئین- التهابی فاکتور هسته ای-kB (NF-kB) در پاتوژنز التهاب کلیه نقش دارد. در اینجا، ما شواهدی ارائه می‌کنیم که نشان می‌دهد MG53، یک پروتئین ترمیم کننده غشای سلولی که قبلاً شناسایی شده بود، مستقیماً با NF-kB تعامل می‌کند و فعالیت رونویسی آن را کاهش می‌دهد. همزمان، تجویز اگزوژن MG53 می تواند بازسازی فیبروتیک کلیه ملتهب را کاهش دهد. این یافته ها به یک تعامل محافظتی بین MG53 و NF-kB برای کاهش توسعه فیبروز کلیه با واسطه التهاب اشاره دارد. تجویز دارویی MG53 ممکن است یک رویکرد امیدوارکننده برای درمان فیبروز پیشرونده کلیه باشد.

اختلال عملکرد کلیه، که می تواند به عنوان آسیب حاد کلیه (AKI) یا بیماری مزمن کلیوی (CKD) طبقه بندی شود، در جمعیت های مسن تر به یک اپیدمی تبدیل شده است. در سال 2017، شیوع بیماری مزمن کلیه به 14.5 درصد از افراد 65 سال و بالاتر رسید که منجر به هزینه بیش از 84 میلیارد دلاری مدیکر برای درمان شد.^1,2AKI و CKD در افراد مسن شایع تر است، که عمدتا به دلیل افزایش حساسیت به آسیب و کاهش توانایی در ترمیم کلیه پیری است. مطالعات بالینی نشان داده‌اند که CKD یک عامل خطر اصلی برای AKI است و برعکس، دوره‌های AKI می‌توانند پیشرفت CKD را به سمت مرحله نهایی بیماری کلیوی تسریع کنند. در حال حاضر، درمان AKI عمدتاً حمایتی است و درمان CKD ایجاد شده بر کاهش پیشرفت از طریق مهار سیستم رنین-آنژیوتانسین-آلدوسترون و در حال حاضر احتمالاً از طریق مهار هم‌ترانسپورتر{4}} سدیم-گلوکز متمرکز است.^3,4

بسته به شدت آسیب، سلول‌های لوله‌ای پروگزیمال، هدف اصلی آسیب حاد، ممکن است در پیشرفت چرخه سلولی، متابولیسم 5،6، 7 ترشح سیتوکین‌های التهابی و پروفیبروتیک پروتئینی، یا انتقال جزئی اپیتلیال به مزانشیمی دچار تغییراتی شوند. که تعیین می کند که آیا بازسازی/ترمیم موفقیت آمیز یا ناسازگار خواهد بود و منجر به فیبروز کلیه می شود، که مشخصه CKD است.

کاهش عرضه عروقی و تولید پروتئین‌های ماتریکس خارج سلولی (ECM) و شامل از دست دادن سلول‌های اپیتلیال و تجمع کلاژن‌ها، اکتین ماهیچه صاف و فیبرونکتین است. همچنین ارتباط بالایی با بدتر شدن عملکرد کلیه دارد.

التهاب مزمن منجر به بازسازی فیبروتیک می شود که همچنین ممکن است زمینه ساز انتقال از AKI به CKD باشد. تحقیقات تجمعی نشان می دهد که فاکتور رونویسی فاکتور هسته ای kB (NF-kB) در پاتوژنز التهاب کلیه ناشی از عفونت، آسیب، دخالت دارد. فعال شدن مسیر متعارف NF-kB با فعال شدن مهارکننده کیناز NF-kB (IkB) شروع می شود که منجر به فسفوریلاسیون و تخریب IkBa و جابجایی هسته ای هترودیمرهای NF-kB می شود. فعال‌سازی سیگنال‌دهی NF-kB در سلول‌های اپیتلیال کلیه و نفوذ سلول‌های ایمنی می‌تواند توسط محرک‌های پاتوفیزیولوژیکی مانند قرار گرفتن در معرض لیپوپلی‌ساکاریدها (LPSs) یا آسیب ایسکمی-پرفیوژن مجدد ایجاد شود.¹⁷علاوه بر سلول‌های لوله‌ای کلیه، سلول‌های ایمنی ذاتی مانند ماکروفاژها و سلول‌های دندریتیک نیز به آسیب کلیه، التهاب و بازسازی فیبروتیک کمک می‌کنند.^13,18–20

سیستانچ در درمان اختلال عملکرد کلیه موثر است

شواهد رو به رشد نشان می دهد که عوامل ترشحی مشتق از عضله (یعنی میوکین ها) فیزیولوژی سیستمیک را از طریق تداخل بافتی تعدیل می کنند تا بر پیشرفت بیماری های کلیوی تأثیر بگذارند.²¹MG53 (همچنین TRIM72 نامیده می شود) یک پروتئین موتیف سه جانبه (TRIM) غنی شده با عضله با عملکردی حیاتی در ترمیم غشای سلولی است. پروتئین های خانواده TRIM عملکردهای متنوعی از تنظیم سیگنال های ایمنی گرفته تا ترمیم بافت دارند.²⁴ترمیم غشاء با واسطه MG53-در کاهش آسیب حاد عضله اسکلتی نقش دارد،²⁵کلیه ها،²⁶قلب،²⁷ ریه، 28 مغز،^29,30و پوست³¹مطالعات قبلی ما سطح پایینی از بیان MG53 را در کلیه، که یک جزء کلیدی در محافظت از AKI است، شناسایی کرد و موش‌هایی که کمبود MG53 (mg53 / ) داشتند، بیشتر مستعد ابتلا به AKI ناشی از استرس بودند.²⁶ما همچنین اخیراً نشان دادیم که افزایش مداوم MG53 در گردش خون، ترمیم آسیب بافتی و بازسازی را افزایش می‌دهد. نقش نسبی MG53 در گردش خاص و بیرونی در تنظیم فیبروز کلیه در طول CKD پیشرونده هنوز ناشناخته است.

اخیراً، نقش نوظهور MG53 در تعدیل حفاظت بافت از طریق مهار التهاب، به ویژه از طریق مدولاسیون سیگنال دهی NF-kB، تکامل یافته است. برای مثال، MG53 سمیت عصبی و التهاب عصبی ناشی از LPS را با مهار مسیر TLR4/NF-kB کاهش می‌دهد، و MG53 قلبی بیان KChIP2 را برای کنترل بازسازی الکتروفیزیولوژیک در طول هیپرتروفی قلبی تنظیم می‌کند. جلوگیری از یک پاسخ بیش التهابی ناسازگار در طول عفونت ویروس آنفولانزای A تحت کشنده، که با تولید بیش از حد اینترفرون-b مشخص می شود، از طریق سرکوب فعال سازی IRF3/NF-kB و مهار سیگنال دهی ناهنجار Ca2þ داخل سلولی در ماکروفاژها. نشان داده شد که عفونت ویروسی، MG53 از مرگ و میر و آسیب ریه جلوگیری می کند، نه با تأثیر مستقیم بر تیترهای ویروسی به خودی خود، بلکه با کاهش طوفان سیتوکین (اینترفرون-b، اینترلوکین{19}}، و اینترلوکین-1b) از طریق تنظیم منفی. از التهاب NLRP3 و پیشگیری از پیروپتوز ریه.36 علاوه بر این، درمان مزمن با دوز بالا MG53 اگزوژن با سرکوب NF-kB مرتبط بود. - التهاب واسطه در قلب سالخورده.37 این مطالعات نشان می دهد که MG53 می تواند سیگنال دهی ناهنجار NF-kB را در طول التهاب تعدیل کند، اما اینکه آیا این در زمینه التهاب کلیه رخ می دهد، مطالعه نشده است.

ما فرض کردیم که MG53 با تعدیل فعالیت رونویسی NF-kB التهاب کلیه را تنظیم می کند و با انجام این کار می تواند فیبروز کلیه را که در نتیجه التهاب مزمن رخ می دهد، کاهش دهد. این مطالعه برای پرداختن به این فرضیه انجام شد.

سیستانچ در درمان بیماری های کلیوی موثر است

مواد و روش ها

مطالعات حیوانی

همه آزمایش‌ها با حیوانات مطابق با راهنمای مؤسسه ملی بهداشت برای مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی و از پروتکل‌های تأیید شده توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات نهادی دانشگاه ایالتی اوهایو پیروی کردند. نوع وحشی همسان با سن (WT) یا mg53^-/-برای تعیین نقش MG53 در مدولاسیون فیبروز کلیه ناشی از انسداد حالب (UUO) وابسته به سن و انسداد یک طرفه حالب استفاده شد. موش های C57B6/J (9 تا 10 هفته) از آزمایشگاه جکسون خریداری شدند.

برای مطالعات آسیب کلیه، موش‌ها (9 تا 12 هفته) برای القای فیبروز کلیه تحت UUO قرار گرفتند. موش ها از طریق ایزوفلوران (1.5 درصد - 2.{5}} درصد) بیهوش شدند تا از سطح عمیق بیهوشی اطمینان حاصل شود. عمل UUO با بستن حالب چپ با 5-0 ابریشم جراحی دو بار طبق پروتکل‌های منتشر شده انجام شد. 38 موش شم فقط یک برش پوستی شکم داشتند. برای ارزیابی اثر rhMG53 بر آسیب انسدادی کلیه، 1 گروه از موش‌های UUO rhMG53 (2 میلی‌گرم/کیلوگرم) را از طریق تزریق ورید دم بلافاصله پس از جراحی UUO (روز 0) و سپس روزانه به مدت 7 روز، با 2 بار دریافت کردند. دوزهای اضافی در روزهای 9 و 11. یک گروه کنترل از موش های UUO طبق برنامه مشابه، تزریق سالین دریافت کردند. موش ها در روز 12 پس از جراحی UUO کشته شدند، کلیه ها در محل با سالین بافر فسفات پرفیوژن شدند و نمونه های بافتی از کلیه UUO و کلیه طرف مقابل برای بافت شناسی و تجزیه و تحلیل وسترن بلات جمع آوری شد.

در مطالعات جداگانه، WT و mg53^-/-موش ها تحت عمل جراحی UUO یا ساختگی قرار گرفتند و در روز هفتم پس از عمل کشته شدند. MG53 با استفاده از روش درمانی مبتنی بر سلول به موش ها داده شد. 39 ماکروفاژ RAW 264.7 با ذرات ویروسی Ad tPA-MG53-گیلاس وابسته به داکسی سایکلین (DOX) به مدت 24 ساعت آلوده شدند. سلول‌های آلوده (با غلظت {{1{12}}}}/100 میلی‌لیتر سالین در هر موش) بلافاصله پس از جراحی (روز صفر تزریق) به موش‌ها تزریق شد. موش‌ها 4 تزریق از سلول‌های RAW تبدیل‌شده Ad-tPA-MG53 را در روزهای 0، 1، 3 و 6 دریافت کردند. بلافاصله پس از روز صفر تزریق سلول‌ها، موش‌ها به طور تصادفی به گروهی که دریافت کردند و گروهی که DOX دریافت نکردند، تقسیم شدند. mg/ml در محلول ساکارز 5 درصد) در آب آشامیدنی آنها به مدت 7 روز و سپس کشته شدند. نمونه‌های بافتی از کلیه UUO و کلیه طرف مقابل برای بافت‌شناسی، RNA و آنالیز پروتئین جمع‌آوری شد.

تجزیه و تحلیل آماری داده ها به صورت میانگین -SD بیان می شوند. مقایسه درون گروهی با استفاده از آزمون t Student هنگام مقایسه 2 تحقیق پایه تجربی H Li و همکاران انجام شد: MG53 NF-kB را در فیبروز کلیه تعدیل می‌کند. و 1-تحلیل روشی واریانس برای بیش از 2 گروه (Graphpad Prism 8.2؛ GraphPad) و به دنبال آن آزمون مقایسه چندگانه Bonferroni یا Holm-Sidak ad hoc. مقدار P <0.05 از="" نظر="" آماری="" معنی="" دار="" در="" نظر="" گرفته="">

روش‌های تکمیلی روش‌های کامل شامل ارزیابی بافت‌شناسی، اندازه‌گیری کراتینین سرم، سازه‌های پلاسمیدی، کشت سلولی و جداسازی سلول‌های اپیتلیال لوله‌ای اولیه، آماده‌سازی آدنوویروس و عفونت سلولی، سنجش انتقال هسته‌ای NF kB p65، ایمونوهیستوشیمی و تصاویر کانفوکال، NF-kB گزارشر به عنوان لوکسیفراز سنجش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم، شکنش بافت، ایمونوبلات، رسوب همزمان، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز کمّی بلادرنگ (جدول S1) و تولید rhMG53 در روش‌های تکمیلی هستند.

عصاره cistanche tubulosa: درمان بیماری کلیوی

نتایج

موش هایی که دارای ابلیشن MG53 هستند دچار فیبروز کلیه وابسته به سن می شوند

ما تأثیر پیری را بر عملکرد کلیه و فیبروز در mg53 مقایسه کردیم^-/-و موش های WT ما مشاهدات قبلی خود را تأیید کردیم که اگرچه سطح کراتینین سرم موش‌های جوان (2 ماهه) با و بدون MG53 تفاوت معنی‌داری نداشت، اما مسن‌تر (16 تا 20 ماه) mg53-/-موش‌ها کراتینین سرم به طور قابل‌توجهی بالاتر از گروه کنترل WT هم‌سن با سن نشان دادند (شکل 1a). بر اساس رنگ آمیزی تری کروم، ما دریافتیم که mg53-/-موش‌ها در مقایسه با موش‌های WT فیبروز کلیه بیشتری داشتند که از سن 5 ماهگی شروع شد و تا 20 ماهگی ادامه داشت (شکل 1b و c). رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی برای ارزیابی تأثیر فرسایش MG53 بر نفوذ لکوسیت‌ها، مونوسیت‌ها و ماکروفاژها در کلیه‌های موش {{4} ماه و {{5} ماهه استفاده شد (شکل 1d و e). کلیه‌های موش‌های WT و mg{8}}/- جوان دارای سطوح مشابهی از لکوسیت‌های داخل کلیوی بودند، اما سلول‌های التهابی به‌طور قابل‌توجهی در mg53/کلیه‌ها نسبت به کلیه‌های WT در موش‌های 5- ماهه یافت شد.

علاوه بر این، ایمونوهیستوشیمی برای اکتین و فیبرونکتین عضله صاف، 2 پروتئین ماتریکس خارج سلولی که معمولاً در نواحی فیبروز کلیه یافت می‌شوند، افزایش رنگ‌آمیزی (3- تا 8- برابری) در گلومرول‌ها و لوله‌های بینابینی کلیه‌ها را نشان داد. {4}}موش ماهانه میلی‌گرم53-/- در مقایسه با 10-موش WT ماهه (شکل S1 تکمیلی).

UUO باعث التهاب و فیبروز تشدید کلیه در mg{0}}/- موش می شود سطوح MG53 کلیه شناسایی شده توسط ایمونوبلات به طور قابل توجهی 7 روز پس از UUO افزایش یافت (شکل 2a). کلیه‌های mg53- /- UUO فیبروز اغراق‌آمیز را با 30 درصد ناحیه رنگ‌آمیزی تری کروم اضافی نسبت به کلیه‌های WT UUO نشان دادند (شکل 2b).

MG53 فعال سازی NF-kB و محلی سازی هسته ای p65 را تعدیل می کند

فعالیت NF-kB (p65) در مدل UUO ارزیابی شد. تعداد p65 کل (t-p65) به طور قابل توجهی در کلیه های UUO از WT و mg53 / موش افزایش یافت، اما فعال سازی NF-kB که به عنوان فسفوریلاسیون p65 ارزیابی شد، در mg53 / UUO بیشتر ({8} برابر) بود. کلیه نسبت به کلیه WT UUO (2-برابر) در مقایسه با حیواناتی که تحت عمل جراحی قرار می‌گیرند (شکل 3a). ما سطوح RNA نسبی فاکتور رشد تبدیل کننده b1 (TGF-b1)، مهارکننده فعال کننده پلاسمینوژن{16}} (PAI-1)، و کلاژن نوع I آلفا 1 (Col1a1) را در کلیه انسداد مورد تجزیه و تحلیل قرار دادیم. سطوح پایین بیان ژن را در حیوانات شم و القای مشابه (TGF-b1، w10 برابر؛ PAI{25}}، w40 برابر؛ Col1a1، w40 برابر) در کلیه UUO از WT و mg53 / (شکل 3b) شناسایی کرد. برای بررسی توزیع فضایی MG53 در قشر کلیه در شرایط عادی، بخش‌های بافت کلیه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. ما مرتباً 10-برابر کل پروتئین هسته‌ای استخراج‌شده، پروتئین کل سیتوزول به دست می‌آوریم. سطوح t-p65 در بخش سیتوزولی بین WT و mg{36}}/- موش قابل مقایسه بود، اما در بخش هسته ای mg53-/- موش بیشتر بود (شکل 3c). MG53 در بخش سیتوزول (با توبولین به عنوان نشانگر سیتوزول) شناسایی شد. به طور غیر منتظره، مقدار قابل توجهی از MG53 در بخش هسته ای (با هیستون H3 به عنوان نشانگر کسر هسته ای) شناسایی شد.

برای تأیید این یافته، ما همچنین محلی‌سازی MG53 را در بخش‌های عضلانی اسکلتی بررسی کردیم (شکل S2 تکمیلی). ما مطالعات قبلی خود را که در آن MG53 به سیتوزول و غشای سارکولم (سدیم-پتاسیم آدنوزین تری فسفاتاز به عنوان نشانگر کسر غشاء) 22،23،25 موضعی شده است، بومی سازی کردیم، اما MG53 هسته ای غنی شده را از عضله اسکلتی نیز شناسایی کردیم.

MG53 با p65 تعامل دارد تا فعالیت رونویسی ناشی از فاکتور نکروز تومور a-a را کنترل کند. ما مطالعات ایمونوهیستوشیمی زیر را انجام دادیم. در سلول های اپیتلیال لوله پروگزیمال WT کشت شده، p65 عمدتاً در سیتوزول یافت شد اما در غیاب MG53 در هسته ها موضعی شد (شکل 4a). هنگامی که این سلول ها با LPS (5 میلی گرم) به مدت 8 ساعت تحت درمان قرار گرفتند، ترشح سیتوکین های پیش التهابی به طور قابل توجهی در سلول های mg53 بیشتر از سلول های WT بود (شکل 4b).

از آنجایی که این داده‌ها نشان می‌دهند که MG53 ممکن است با p65 برای تنظیم بیان سیتوکین‌های التهابی تعامل داشته باشد، برهم‌کنش مستقیم بین p65 و MG53 توسط سنجش‌های رسوب همزمان با استفاده از سلول‌های HEK293 که با Flag-p65 و HA-MG53 هم ترانسفکت شده‌اند، ارزیابی شد. ما یک تعامل ضعیف را نشان دادیم (شکل 4c). هم ترانسفکشن پلاسمیدهای GFP-p65 و RFP-MG53 و آنالیز کانفوکال کولوکالیزاسیون p65 و MG53 را تأیید کرد (شکل 4d). سپس با اندازه‌گیری فعالیت لوسیفراز از یک رده سلولی گزارشگر رونویسی NF-kB/{22}}GFP-Luc پایدار که به‌طور گذرا با هر یک از وکتورهای pHM6 ترانسفکت شده بود، تعیین کردیم که آیا MG53 بر فعالیت رونویسی NF-kB (p65) بعد از تحریک TNF تأثیر می‌گذارد یا خیر. یا HA-MG53. سلول‌های گزارشگر حاوی یک گزارش‌گر لوسیفراز بیان لنتی‌ویروس تبدیل‌شده هستند که توسط یک پروموتر سیتومگالوویروس حداقل در ارتباط با 4 نسخه از عناصر پاسخ رونویسی NF-kB (محل kB) در بالادست هدایت می‌شود. در غیاب TNF-a، فعالیت لوسیفراز ذاتی بسیار پایین در سلول های گزارشگر بیان کننده پروتئین های MG53 شناسایی شد. MG53 فعالیت رونویسی NF-kB (p65) ناشی از TNF-a را تا حدود 40 درصد سرکوب کرد (شکل 4e).

بیان بیش از حد MG53 از انتقال هسته‌ای NF-kB p65 پس از درمان با TNF-a جلوگیری کرد. با تحریک TNF-a، ما MG53 را در سلول‌های HKC{13}} از طریق انتقال ویروسی Ad-tPA-MG53 وابسته به DOX یا از طریق درمان با MG53 نوترکیب انسانی (rhMG53) بیان کردیم. با استفاده از یک آنتی بادی مونوکلونال اختصاصی MG، پس از القای وابسته به DOX، MG53 توسط ایمونوبلات شناسایی شد. MG53 در سطح بسیار بالایی در سلول‌های HKC{27}} انتقال یافته Ad-tPA-MG53 وجود داشت،

معادل 1 نانوگرم rhMG53/mg لیزات سلولی. در مقابل، HKC{2}} مقدار بسیار کمتری از rhMG53 را گرفت و بیان کرد (شکل 5a). جذب rhMG53 نشاندار شده با فلورسنت FL توسط HKC{7}} توسط میکروسکوپ کانفوکال تأیید شد (شکل تکمیلی S3). پس از درمان TNF-a، زمان حداکثر فعال سازی p65 15 تا 30 دقیقه بود (شکل 5b). در شرایط پایه، NF-kB p65 عمدتاً در سیتوزول قرار داشت و بیان بیش از حد MG53 این تغییر را تغییر نداد (شکل 5c و d). با این حال، پس از تحریک TNF-a، p65 به هسته‌های سلول‌های HKC{20}} که MG53 بیش از حد بیان نمی‌کنند منتقل شد. در مقایسه، جابه‌جایی هسته‌ای p65 در سلول‌هایی که MG53 را بیش از حد بیان می‌کنند، 33 درصد (سلول‌هایی که rhMG53 داده شده‌اند) به 50 درصد (سلول‌های ترانسدود شده داده شده DOX) کاهش یافت (شکل 5c و d).

انتقال اقتباسی سلول‌های RAW مهندسی شده به مدل UUOmouse با سلول‌های 1 - 106 که از طریق تزریق ورید دم بلافاصله پس از جراحی UUO انجام شد. موش ها به طور تصادفی به گروهی که آب آشامیدنی معمولی (-DOX) دریافت کردند و گروهی که DOX (2 میلی گرم بر میلی لیتر) در آب آشامیدنی دریافت کردند، تقسیم شدند. موش‌های UUO یک روز دیگر RAW را برای مجموع 4 تزریق دریافت کردند. کلیه ها 7 روز پس از جراحی برداشت شدند.

موش‌هایی که با RAW مهندسی شده و به دنبال آن القای DOX تزریق می‌شوند در مقایسه با موش‌هایی که هیچ سلولی دریافت نکرده‌اند یا با سلول‌های RAW مهندسی شده اما بدون القای Dox تزریق شده‌اند (66 درصد ناحیه فیبروتیک؛ شکل 6a و b) به طور قابل‌توجهی کاهش (30 درصد) فیفیبروز کلیه را نشان دادند.

تنها یک جمعیت کوچک RAW/Ad-tPA-MG53 از نظارت سیستم رتیکولواندوتلیال تا پایان آزمایش ها جان سالم به در بردند. رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی تایید کرد که DOX بیان MG53 با واسطه RAW را در کلیه القا می کند (شکل 6c). جالب اینجاست که کلیه‌های UUO از موش‌های تزریق‌شده با RAW و MG53 القا شده با DOX نسبت p{10}}/t-p65 کمتری (حدود 40 درصد) نسبت به آن‌هایی که RAW دریافت نکرده‌اند یا آن‌هایی که RAW بدون DOX دریافت کرده‌اند نشان دادند (شکل 6d و e). کاهش سطح p-p65 با رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی p-p65 (S536) کلیه‌های UUO تأیید شد (شکل 6f). ما فکر می کنیم گردش MG53 تحویل شده توسط Raw/Ad-tPA-MG53/þDOX و جذب توسط سلول های لوله پروگزیمال کلیه می تواند در کاهش p-p65 (S536) و کاهش التهاب کلیه UUO شرکت کند. در مقایسه با کلیه‌های فقط UUO، بیان TGF-b1، PAI{31}} و Col1a1 در کلیه‌های UUO موش‌های تزریق شده با RAW بدون DOX (بدون القای MG53) به طور قابل‌توجهی افزایش یافت. افزایش این ژن‌های پروفیبروتیک را می‌توان به القای واکنش آلوگرافت قوی از سلول‌های تزریق شده به موش‌های دارای قابلیت ایمنی نسبت داد. با این حال، کلیه‌های UUO از موش‌های تزریق شده با RAW و DOX (القای MG53) نسبت به موش‌های بدون درمان با DOX به‌طور قابل‌توجهی کمتر (60-72 درصد کاهش) PAI{38}} و سطوح نسبتاً پایین‌تری از TGF-b1 و Col1a1 نشان دادند (شکل 6 گرم).

تجویز سیستمیک rhMG53 فعال‌سازی NF-kB و توسعه فیبروز را در موش‌های تحت UUO کاهش می‌دهد.

ما آزمایش کردیم که آیا rhMG53 یک اثر ضد فیبروتیک مشابه با سلول درمانی مهندسی شده RAW که قبلا توضیح داده شد را نشان می دهد یا خیر. داده های فارماکوکینتیک قبلی ما نشان داد که نیمه عمر کوتاه و در گردش (حدود 90 دقیقه در جوندگان) rhMG53.42 موش ها تجویز مزمن 2 تا 6 میلی گرم بر کیلوگرم را تحمل کردند.

rhMG5326,37 خوب، بنابراین استراتژی مدیریت نشان داده شده در شکل 7a استفاده شد. به موش‌های UUO به‌طور تصادفی به‌مدت 7 روز اول پس از جراحی و سپس یک روز در میان تا زمانی که در روز 12 کشته شدند روزانه وسیله نقلیه (سالین) یا rhMG53 (2 میلی‌گرم بر کیلوگرم) داده شد. کلیه‌های شم و طرف مقابل تقریباً t-p65 معادل را نشان دادند. و سطح بیان فیبرونکتین، با سطح p-p65 کمی در کلیه های طرف مقابل در مقایسه با کلیه های شم افزایش یافته است. پس از UUO، t-p65 کلیه افزایش یافت. در مقایسه با حیوانات تحت درمان با نمک، نسبت p{15}}/t-p65 در کلیه‌های UUO حیوانات تحت درمان با rhMG حدود 37 درصد کاهش یافت، در حالی که IkBa حدود 27 درصد افزایش یافت (شکل 7b و ج). علاوه بر این، فیبرونکتین حدود 33 درصد کاهش یافت (شکل 7b و c). ایمونوهیستوشیمی تایید کرد rhMG53 پس از درمان در کلیه های UUO وجود دارد (شکل 7d). فیبروز کل در کلیه‌های UUO تحت درمان با rhMG کاهش یافت (شکل 7e). با این حال، بیان RNA TGF-b1، PAI{30}}، و Col1a1 در موش‌های تحت درمان با سالین یا rhMG53 مشابه بود (شکل 7f).

سیستانچ در درمان اختلال عملکرد کلیه موثر است

بحث

MG53 یک پروتئین TRIM غنی شده با ماهیچه است که در ابتدا به عنوان یک جزء برجسته در ماشین آلات ترمیم غشای پلاسما شناسایی شد. با این حال، اعمال MG53 محدود به ماهیچه های اسکلتی نیست و MG53 می تواند به عنوان یک ماده در گردش خون آزاد شود. myokine.32 ما قبلاً نشان داده‌ایم که MG53 می‌تواند التهاب را در طول آسیب بافتی در اندام‌های دوردست کنترل کند.27،29،33،35-37. بررسی حاضر دامنه حفاظت از اندام با واسطه MG{15}}را به کلیه گسترش می‌دهد. نتیجه می‌گیریم که MG53 می‌تواند التهاب داخل کلیوی و فیبروز کلیه را با مسدود کردن فعال‌سازی ناشی از سیتوکین فاکتور رونویسی NF-kB کاهش دهد. این نتیجه گیری بر اساس مشاهدات زیر است: (من) حذف ژنتیکی MG53 در موش های طبیعی.

منجر به کاهش عملکرد کلیه با افزایش سن موش ها شد که با افزایش فیبروز کلیه و انفیلتراسیون کلیه توسط لکوسیت ها و ماکروفاژها همراه بود. (ب) در یک مدل آسیب کلیوی UUO موش، کلیه‌های انسدادی موش‌های دارای کمبود MG53-فیبروز و التهاب بیشتری نسبت به موش‌های مملو از MG نشان دادند. (iii) تولید TNF-a و اینترلوکین توسط سلولهای اپیتلیال لوله پروگزیمال تحت درمان با LPS در حضور MG53 ضعیف شد. (IV) درمان با یا بیان بیش از حد MG53 در یک رده سلولی اپیتلیال لوله‌ای پروگزیمال، فعال‌سازی NF-kB ناشی از TNFa را با مسدود کردن جابه‌جایی هسته‌ای جزء p65 kB کاهش داد (MG53 مستقیماً به p65 متصل می‌شود، البته ضعیف). و (V) فسفوریلاسیون p65، یک مرحله ضروری در فعال سازی NF-kB، در کلیه های مسدود موش UUO تحت درمان با MG53 نوترکیب ناشی از بیان بیش از حد MG53 در ماکروفاژها کاهش یافت. علاوه بر این، بازدارنده فعال‌سازی NF-kB، IkBa، در کلیه‌های انسدادی موش‌های UUO که با MG53 نوترکیب تزریق شده بودند، افزایش یافت.

حذف ژنتیکی MG53 در موش‌های سالم برای اثرات نامطلوب پیری بر کلیه‌ها قابل قبول بود. این نشان می دهد که وجود MG53 درون زا سطح پایه ای از محافظت را در طول پیری فراهم می کند. به طور مشابه، از دست دادن MG53 درون زا باعث بدتر شدن AKI به دلیل انسداد شد. کلیه UUO MG53 را انباشته کرد، که احتمالاً منعکس کننده فعالیت میوکین از راه دور از عضلات اسکلتی است. هنوز مشخص نیست که چگونه عضله MG53 ممکن است در هنگام آسیب به کلیه وارد شود. با این حال، کلیه آسیب دیده اغلب دچار هیپوکسی می شود و تحت استرس اکسیداتیو قرار می گیرد.^44,45سیگنال هایی که می توانند برای استخدام MG53 استفاده کنند. اگر چنین است، این محور «عضله-کلیه-سلول ایمنی» می تواند برای کاهش آسیب کلیه مورد استفاده قرار گیرد.²⁶و در طول آسیب حاد یا مزمن، تولید MG53 می تواند تنظیم شود.

NF-kB یک محرک رونویسی برجسته التهاب و فیبروز در آسیب کلیه و پیری است.^14,17,47,48از ما خواسته شد تا بررسی کنیم که آیا اثرات MG53 می تواند از طریق NF-kB واسطه شود، زیرا حضور MG53 در محفظه هسته ای هموژنه های کلیه پتانسیل تداخل رونویسی را پیشنهاد می کند. بومی سازی هسته ای MG53 بی سابقه نیست. در یک مدل تراریخته با بیان بیش از حد MG53 میوکارد، MG53 هسته ای بیان گیرنده آلفا فعال شده توسط پراکسی زوم را در سطح رونویسی تنظیم کرد و متابولیسم لیپید قلبی را تحت تاثیر قرار داد. از طریق کاهش سیتوکین های پیش التهابی، آپوپتوز و استرس اکسیداتیو در کاردیومیوسیت های مسن.³⁷

مکانیسم مولکولی چگونگی تعدیل MG53 بسیج هسته ای / سیتوپلاسمی p65 نامشخص است. MG53 حاوی سیگنال محلی سازی هسته ای نیست، اما حاوی 3 سیگنال صادرات هسته ای غنی از لوسین در ترمینال N است، یک موتیف که توسط صادرات پروتئین صادراتی هسته ای به رسمیت شناخته شده است.⁵⁰تعامل مستقیم بین MG53 و p65 به عنوان تنها یا اصلی اثر مخرب MG53 در فعال سازی NF-kB نسبتا ضعیف بود. اگرچه به نظر می رسد که MG53 بر جابجایی نوکلئوسیتوپلاسمی پویا اجزای حیاتی NF-kB تأثیر می گذارد، مکانیسم های دقیق هنوز تعیین نشده است.

به نظر می رسد که نتیجه حیاتی محافظت مجدد با واسطه MG، کاهش بازسازی فیبروتیک از طریق تضعیف التهاب ناشی از NF-kB باشد. فیفیبروز کلیه فرآیند پیچیده ای است که شامل رسوب پاتولوژیک پروتئین های مختلف ECM می شود. به نظر می رسید MG53 51 اثرات واضحی بر فیبرونکتین پروتئین ECM دارد. فیبرونکتین در کلیه های UUO کمبود MG53 افزایش و در موش UUO تحت درمان با MG53 کاهش یافت. درک بیان سایر پروتئین های ECM در حضور و عدم حضور MG53 دشوارتر است. ما قبلاً نشان دادیم که rhMG53 سیگنال‌دهی TGF-b1/Smad را به طور منفی تنظیم می‌کند و سنتز پروتئین‌های ECM را در یک مطالعه آزمایشگاهی سرکوب می‌کند. mg53 / حیوانات کمبود. این رونوشت ها در حیوانات UUO که از طریق تجویز موش ناشی از ویروس به بیان بیش از حد MG53 القا شده بودند، کاهش یافت.

ماکروفاژها، اما زمانی که MG53 نوترکیب داده شد، هیچ اثری مشاهده نشد. این ممکن است به سادگی یک مورد از دوز کافی باشد زیرا سطوح MG53 داخل کلیوی به دست آمده در حیوانات با توجه به ناقل ماکروفاژ در مقایسه با MG53 نوترکیب بسیار بیشتر بود. علاوه بر این، سطح پروتئین اندازه‌گیری نشد و رویدادهای پس از رونویسی می‌توانند ECM را در UUO تغییر دهند. تحقیقات بیشتری برای روشن شدن نقش در حال ظهور MG53 در تعدیل پروتئین های خاص ECM مورد نیاز است. در نتیجه، این مطالعه نشان داده است که میوکین ممکن است به تنظیم التهاب پایه در اندامی دوردست مانند کلیه کمک کند و در شرایط آسیب کلیه، ممکن است به کاهش و کنترل التهاب کمک کند. شکل 8 یک مدل کاری از نقش MG53 در حفاظت مجدد را نشان می دهد. در طول تحریک الگوهای مولکولی مرتبط با آسیب (DAMP، مانند TNF-a) و الگوهای مولکولی مرتبط با پاتوژن (PAMP، مانند LPS) و استرس ایسکمیک، سیگنالوزوم NF-kB در کلیه فعال می شود. MG53 با مهار فسفوریلاسیون و فعال سازی سیگنال دهی NF-kB، تثبیت IkBa و کاهش تحرک هسته ای p65 از کلیه محافظت می کند و از فعال سازی برنامه های پیش التهابی جلوگیری می کند. اگرچه MG53 درون زا ممکن است این اثرات را واسطه کند، ما پیشنهاد می‌کنیم که حفاظت قوی‌تری ممکن است با استفاده از MG53 به صورت درمانی انجام شود، که بر اساس توانایی MG53 اگزوژن برای کاهش آسیب در UUO امکان‌پذیر است. تحقیقات بیشتر برای درک چگونگی استفاده بالینی از این میوکین ضروری است.

فواید سیستانچ: محافظت از کبد و ضد فیبروز

افشای

JM در شرکت TRIM-edicine، که rhMG53 را برای درمان بیماری های انسانی توسعه می دهد، سهام دارد. پتنت استفاده از MG53 توسط دانشگاه راتگرز و دانشگاه ایالتی اوهایو نگهداری می شود. همه نویسندگان دیگر هیچ علاقه رقیبی را اعلام نکردند.

قدردانی

این کار توسط مؤسسه ملی بهداشت (NIH) R01-DK106394 (JM، BHR، و P-HL) و NIH R01-AG062896 (P-HL andBHR) پشتیبانی شد. این پروژه همچنین تا حدی توسط یک صندوق داخلی Lockwood از دانشگاه ایالتی اوهایو (P-HL) و یک جایزه از مرکز ملی پیشرفت علوم ترجمه (NCATS؛ P-HL، شماره جایزه UL1TR002733) پشتیبانی شد. مسئولیت محتوا صرفاً بر عهده نویسندگان است و لزوماً نمایانگر دیدگاه‌های رسمی NCATS یا NIH نیست.

مشارکت نویسنده،

PD، P-HL، JM، و BHR این مطالعات را تصور و/یا طراحی کردند. HL، PD، P-HL، ZL، و XZ آزمایش ها را انجام دادند، داده ها را به دست آوردند و تجزیه و تحلیل داده ها را انجام دادند. PD، P-HL، و BHR نتایج را تفسیر کردند. و P-HL و BHR نسخه خطی را پیش نویس، اصلاح و تأیید کردند. همه نویسندگان نسخه نهایی را خوانده و تایید کردند.

مواد تکمیلی

فایل تکمیلی (PDF) روشهای تکمیلی.

جدول S1.دنباله های پرایمر شکل S1. mg53-/- موش رسوب پروتئین ECM را افزایش داده است. بافت های کلیه با سن (1{15}} ماهگی) نوع وحشی (WT) و میلی گرم{6}} /- با 40 6-دیامیدینو-2- فنیلندول (DAPI؛ آبی، پانل های چپ)، الف- اکتین عضلات صاف (SMA؛ سبز، پانل های دوم)، فیبرونکتین (قرمز، پانل های سوم)، و ادغام شده (پانل های سمت راست). میله ¼ 25 میلی متر. کمی کردن ناحیه فیبروز کلیوی (n ¼ 3 در هر گروه). داده ها به صورت میانگین -SD ارائه می شوند. آزمون تی دانشجویی. ***P <>

شکل S2.توزیع MG53 ماهیچه اسکلتی بین هسته و سیتوپلاسم. عضله اسکلتی مشتق شده از نوع وحشی (WT) موش ormg{3}}/- با یک آنتی بادی ضد MG53 سفارشی (3 میلی گرم لیزات) و نشانگرهای محفظه سلولی (20 میلی گرم لیزات) تکه تکه و ایمونو بلات شدند. آدنوزین تری فسفاتازهای سدیم پتاسیم به عنوان نشانگر غشای سلولی، هیستون H3 به عنوان نشانگر هسته ای و توبولین به عنوان نشانگر سیتوزول استفاده می شود.

شکل S3.سلول های لوله پروگزیمال کلیه HKC{0} به طور خاص rhMG53 نشاندار شده با AlexaFluor 647 را جذب می کنند. rhMG53 (Trimedicine) و آلبومین سرم گاوی (BSA؛ ThermoFisher Scientific) با کیت های برچسب گذاری آنتی بادی Alexa Fluor(AF) (Life Technologies) طبق پروتکل سازنده برچسب گذاری شدند. سلول های HKC{4}} روی ظرف ته شیشه ای Delta TPG (Bioptechs Inc.) در محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM) با 10 درصد سرم جنین گاو (FBS) در حضور پروتئین های نشاندار BSA-AF647 (سمت چپ) کشت داده شدند. ) و rhMG53-AF647 (راست)، به مدت 24 ساعت. تصاویر پشته Z از یک میکروسکوپ کانفوکال LSM780 (Zeiss) گرفته شد. تصاویر سلول هایی را در پایین ظروف نشان می دهند. میله ¼ 25 میلی متر.

شکل S4.مهندسی سلول های RAW برای واسطه در ترشح القایی MG53. (الف) سلول های RAW به مدت 24 ساعت با Ad-tPA-MG53 آلوده شدند و بدون (داکسی سایکلین [Dox]) یا با Dox (þDox، 1 میلی گرم در میلی لیتر) به مدت 24 ساعت دیگر برای القای بیان tPA-MG53 تحت درمان قرار گرفتند. تصاویر هم کانونی القای بیان MG53 (آنتی بادی ضد MG53 سفارشی، قرمز، پانل‌های پایین‌تر) را از سلول‌های RAW ماکروفاژ مانند (رنگ‌آمیزی F4/80، سبز، پانل‌های بالایی) نشان دادند. میله ¼ 25 میلی متر. (B, C) تجزیه و تحلیل وسترن بلات لیزات سلولی (به مقدار 0.6، 3 و 6 میلی گرم) برای بیان القایی tPA-MG53 و MG53 از سلول های RAW آلوده (B) و کشت مربوطه کنسانتره های رسانه ای (در حجم های 2، 5، و 10 میلی لیتر) (C). مقادیر مختلفی از rhMG53 (به مقدار 0.2، 1، 0.05 و 0.025 نانوگرم) به عنوان استاندارد بارگیری شد. Mw، نشانگرهای وزن مولکولی.