N-Hydroxycinnamoylphenalkylamides (36H) هر دو توانایی آنتی اکسیدانی و آنتی تیروزیناز را نشان دادند. این ترکیب برای خواص آنتی اکسیدانی آن، با استفاده از آزمایش مهار 1،{3}}دی فنیل-2-پیکریل هیدرازول (DPPH-)، ارزیابی قدرت آنتی اکسیدانی کاهش دهنده یون آهن (FRAP) و ارزیابی فلز مورد مطالعه قرار گرفت. سنجش قدرت کیلیت نتایج نشان داد که 36H دارای قابلیت‌های آنتی اکسیدانی در آزمایش‌های قدرت مهارکننده DPPH و کاهش آهن بود، اما سنجش قدرت کیلیت قابلیت آنتی‌اکسیدانی را نشان نداد. 36H همچنین برای فعالیت مهاری تیروزیناز با استفاده از پلتفرم‌های گونه‌های مختلف، از جمله قارچ in vitro، ملانوم موش B16F10 و سلول‌های ملانوسیت انسانی اندازه‌گیری شد. در شرایط آزمایشگاهی سرکوب تیروزیناز قارچ، 36H فرآیندهای ملانوژنز را مهار کرد. فرض بر این است که 36H سایت فعال تیروزیناز را به عنوان یک بازدارنده رقابتی برای تیروزیناز قارچ مسدود می کند، از این رو زنده ماندن سلولی ملانوسیت طبیعی انسان را کاهش نمی دهد. یک واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در زمان واقعی (qRT-PCR) و وسترن بلات کشف کرد که 36H RNA و پروتئین‌های مرتبط با ملانوژنز، از جمله تولید رنگدانه (MITF، تیروزیناز، TRP{21}}، و TRP{22}}) را کاهش داد. بلوغ ملانوزوم (Rab27a) و انتقال ملانوزوم (Myo5a، MLPH و Mreg). به طور کلی، 36H عملکردهای زیستی آنتی اکسیداسیون و سرکوب ملانین را نشان می دهد، بنابراین امکان استفاده از آن به عنوان یک افزودنی غذایی یا یک عامل سفید کننده پوست وجود دارد.

طبق مطالعات مربوطه،سیستانچیک گیاه رایج است که به عنوان "معجزه" شناخته می شودگیاه داروییکه عمر را طولانی می کند.» جزء اصلی آن استسیستانوزید، که دارای اثرات مختلفی از جملهآنتی اکسیدان, ضد التهاب، وارتقاء عملکرد سیستم ایمنی. مکانیسم بین سیستانچ وپوستسفید کردندر اثر آنتی اکسیدانی نهفته استگلیکوزیدهای سیستانش. ملانین در پوست انسان از اکسیداسیون تولید می شودتیروزینکاتالیز شده توسطتیروزیناز، واکسیداسیونواکنش مستلزم مشارکت اکسیژن است، بنابراین رادیکال های بدون اکسیژن در بدن به عامل مهمی در تولید ملانین تبدیل می شوند. سیستانچ حاویسیستانوزیدکه یک آنتی اکسیدان است و می تواند تولید رادیکال های آزاد را در بدن کاهش دهد، بنابراینمهار تولید ملانین

بر روی مکمل Cistanche Tubulosa کلیک کنید

بیشتر بخواهید:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

1. معرفی

پوست انسان بزرگترین عضو بدن انسان است. عملکردهای بدن را حفظ می کند و از از دست دادن آب، الکترولیت ها و بیومولکول ها جلوگیری می کند. پوست از اپیدرم، درم و هیپودرم تشکیل شده است. اپیدرم به پنج لایه جداگانه تقسیم می شود: لایه شاخی، لایه شفاف، لایه گرانولوزوم، لایه خاردار و لایه پایه [1]. لایه پایه اپیدرم که به درم متصل است لایه پایه است که حاوی ملانوسیت ها است. ملانوسیت ها دارای دندریت هایی برای انتقال ملانین به کراتینوسیت ها هستند که به دلیل محتوای ملانین در این کراتینوسیت ها سطح رنگ پوست را تعیین می کنند [2].

رادیکال های آزاد از یک اتم یا گروهی از اتم ها تشکیل شده اند که یک یا چند الکترون جفت نشده دارند. آنها در واکنش های فیزیولوژیکی، متابولیک و ایمنی و عملکردهای انتقال سیگنال نقش دارند. اگرچه آنها بخشی از فرآیندهای طبیعی بیوشیمیایی سالم در بدن هستند، اما مسئول آسیب نیز هستند. گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) و رادیکال‌های آزاد مختلف با تولید آنیون‌های سوپراکسید یا پراکسید هیدروژن تحریک می‌شوند. این می تواند باعث پیام رسانی اشتباه، آسیب به غشای سلولی و آسیب به ارتباطات سلولی یونی به دلیل پراکسیداسیون لیپیدی شود. این امر بر مولکول‌های داخل سلولی که دارای گروه‌های SH و پروتئین‌های فعال و DNA هستند تأثیر می‌گذارد [3]. مقدار ROS توسط سیستم‌های دفاع شخصی کنترل می‌شود که در حالت عادی خود با واسطه آنتی‌اکسیدان‌ها، مانند آنتی اکسیدان‌ها، کنترل می‌شود. اینها شامل ویتامین C، ویتامین E یا گلوتاتیون [4] است که رادیکال های آزاد را برای جلوگیری از آسیب سلولی از بین می برد. با این حال، آنها تعادل حالت اکسیداسیون سلولی را مختل می کنند که منجر به ROS بیش از حد می شود. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که بسیاری از بیماری‌های دژنراتیو، مانند پیری و سرطان، توسط گونه‌های فعال اکسیژن یا رادیکال‌های آزاد ایجاد می‌شوند. خواص آنتی اکسیدانی نشان می دهد که پراکسیداسیون لیپیدها در غشاهای ملانوسیت باعث افزایش محتوای گلوتاتیون درون سلولی می شود که ممکن است باعث ایجاد رنگدانه شود [5، 6].

تیره شدن پوست، چشم ها و مو به دلیل سنتز ملانین است که یک بیوپلیمر رنگدانه ای است که در ملانوزوم ملانوسیت ها سنتز می شود. ملانین یک مکانیسم محافظتی در برابر آسیب اشعه ماوراء بنفش است [7]. ژن های مادرزادی می توانند بر رنگ پوست تأثیر بگذارند، اما القای اشعه ماوراء بنفش، التهاب و تغییرات هورمونی باعث می شود ملانوسیت ها ملانین بیشتری را سنتز کنند. با این وجود، تولید بیش از حد ملانین می‌تواند باعث ایجاد اختلالات رنگدانه‌ای مانند ملاسما، لنتیگوی پیری، کک و مک و هیپرپیگمانتاسیون شود [8]. اینها معمولاً با استفاده از مواد آرایشی یا مواد دارویی حاوی اجزای سفیدکننده پوست درمان می شوند. حتی اگر این عناصر از منابع طبیعی هستند، فقط برخی از عوامل در لوازم آرایشی یا داروها به دلیل نگرانی های ایمنی یا نگرانی های مربوط به اثر سفید کننده استفاده می شود. ملانوژنز شامل اتصال هورمون محرک ملانوسیت به ملانوکورتین{5}} است که آدنوزین مونوفسفات حلقوی (cAMP) را افزایش می‌دهد و فاکتورهای رونویسی مرتبط با میکروفتالمیا (MITF) را فعال می‌کند [9]. MITF بیان یک آنزیم ملانوژنیک، تیروزیناز را تنظیم می کند، که نقش مهمی در هیدروکسیلاسیون L-تیروزین به دی هیدروکسی فنیل آلانین (L-DOPA) و اکسیداسیون L-DOPA به دوپاکینون دارد [10]. درمان های پزشکی و زیبایی به طور فزاینده ای از مهارکننده های فعالیت تیروزیناز استفاده می کنند. تولید ملانوژنز و انتقال ملانوزوم ها از ملانوسیت ها به کراتینوسیت ها برای رنگ آمیزی پوست ضروری است [11]. ملانوزوم ها به اسکلت سلولی اکتین در حاشیه ملانوسیت ها از طریق کمپلکس سه بخشی تشکیل شده توسط پروتئین مرتبط با Ras Rab-27 (Rab27a)، ملانوفیلین (MLPH) و میوزین Va (Myo5a) متصل می شوند. Rab27a یک پروتئین متصل به غشاء است که در انتقال پروتئین و انتقال سیگنال کوچک با واسطه GTPase نقش دارد. ملانوفیلین یک کمپلکس سه تایی با Rab27a در محل متصل به GTP با Myo5a که پروتئین حرکتی است تشکیل می دهد. رنگدانه های قابل مشاهده پستانداران در مو و پوست طبق این کمپلکس سه پروتئینی است که اندامک های تولید کننده رنگدانه را به هم متصل می کند. اگر پروتئین پیچیده کمبود داشته باشد، ارتباط بین F-اکتین و ملانوزوم از بین می رود [12].

در ترکیبات پتانسیل درمانی مثبت، N-hydroxycinnamoylphenalkylamides (36H) گزارش شده است که یک اثر مهاری بر بیان ماتریکس متالوپروتئیناز- (MMP-) 9 در THP-1، یک رده سلولی مونوسیتی لوسمی انسانی، که تحریک می شود، دارند. توسط فاکتور نکروز تومور (TNF-) [7]. یک مطالعه قبلی نشان داد که بیان TNF- القایی MMP{10}} برای هر دو سطح پروتئین و mRNA به طور کامل به روشی وابسته به غلظت (1-20 میکرومولار) مهار شد. مشخص شده است که 36H بطور قابل توجهی تقویت کننده ژن پلی پپتیدی نور فاکتور هسته ای-κ را در سیگنال دهی سلول B (NF-kB) همانطور که توسط سنجش ژن گزارشگر NF-kB شناسایی شد، سرکوب کرد، اما هیچ تاثیری بر تخریب (عامل هسته ای پلی پپتید نوری κ) نداشت. تقویت کننده ژن در بازدارنده سلول B (IκB) یا جابجایی NF-κB. داده های ایمونوفریزی کروماتین نشان داد که وابستگی بین MMP{19}} و ژن پروموتر زیرواحد p65 NF-kB (p65) به طور کامل توسط phosphory و phosphory نفی شد. به طور کلی، یک گزارش قبلی نشان داد که 36H ترشح MMP{26}} را با کاهش هدفمند هسته‌ای مکانیسم‌های مسیر NF-kB در THP سرکوب می‌کند. 36H آنالوگ اسید کافئین است. فن اتیل استر (CAPE)، که یک سرکوب کننده شناخته شده متاستاز و تهاجم سرطان است [14]. فعالیت های آنتی اکسیدانی و حذف رادیکال های آزاد برخی از آنالوگ های CAPE مورد مطالعه قرار گرفته است، و نتایج آن مطالعات این مطالعه را بر آن داشت تا مشخص کند که آیا 36H کاهش می یابد یا خیر. فعالیت تیروزیناز و کاهش RNA و پروتئین های مرتبط با ملانوژنز. این مطالعه نشان می دهد که 36H یک آنتی اکسیدان بالقوه و مثبت و یک عامل سفید کننده پوست است.

2. مواد و روشها

2.1. معرف ها و مواد.دی متیل سولفوکسید (DMSO) و L-تیروزین از شرکت سیگما آلدریچ شیمیایی (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد. محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM) و سرم جنین گاوی (FBS) از Gibco-BRL (Gaithersburg، MD، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. تمام معرف ها و بافرهای جایگزین در بالاترین خلوص تجاری به دست آمدند.

2.2. سنتز شیمیایی 36H.36H توسط پروفسور Yueh-Hsiung Kuo ارائه شد، که از روش‌های بعدی از جفت‌شوندگی با آمید برای بدست آوردن ترکیبات استفاده کرد. بنزوتریازول{3}}ایلوکسی‌تریس (دی‌متیل آمینو)-فسفونیوم هگزافلوئوروفسفات (BOP) با مخلوطی از R{5}}NH2، R{7}}COOH و تری اتیلامین (Et3N) در دی‌متیل فرمامید (DMF) ترکیب شد. محلول واکنش به مدت 3{{{{3{3{35}}}}}} دقیقه در دمای 0 درجه سانتیگراد مخلوط شد و سپس در دمای 25 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت مخلوط شد. هنگامی که مایع شیمیایی تبخیر شد، باقیمانده بین H2O و اتیل استات (AcOEt) تقسیم شد. سپس باقیمانده با استفاده از کروماتوگرافی ستونی با محلول شستشو (AcOEt-CH2Cl2، 1: 1، v/v) روی سیلیکاژل (70-230 و مش 230-400، Merck 7734) فیلتر و خالص شد. محصولات از AcOEt برای به دست آوردن بهترین داروی اکسیداتیو و طول عمر سلولی و ایده آل ترین کریستال ها تبلور مجدد شدند. یک طیف‌سنج جرمی Finnigan TSQ{23}}C برای طیف‌سنجی جرمی ضربه الکترون (EIMS) استفاده شد. طیف 1H و 13C NMR با استفاده از طیف سنج Bruker Avance 500 به دست آمد. اسپکتروفتومتر Nicolet Magna-IR 550 طیف IR را ثبت کرد. 36H ابتدا قبل از مطالعات زیر در محلول DMSO حل شد. برای هر سنجش از DMSO با غلظت ثابت و نهایی 0.2 درصد (v/v) استفاده شد. این ترکیب به عنوان یک آنتی اکسیدان یا سفید کننده پوست شناخته نشده است [7، 13] و ساختار آن در شکل 1 نشان داده شده است. نمونه ها در DMSO حل شدند و غلظت های مختلف با غلظت نهایی DMSO کمتر از 0.5 درصد تهیه شد.

2.3. سنجش ظرفیت حذف رادیکال DPPH.DPPH 2،2-دی فنیل-1-پیکریل هیدرازیل است که وقتی رادیکال آزاد داشته باشد، بنفش تیره می شود. هنگامی که آنتی اکسیدان رادیکال را از DPPH˙ حذف می کند، DPPH˙ را به یک DPPH پایدار کاهش می دهد که دارای رنگ زرد روشن است [14]. دوزهای مختلف 36H (2 میکرولیتر در حجم کل) در 98 میکرولیتر از مخلوط DPPH (60 میکرومولار) ترکیب شدند و صفحه با استفاده از یک دستگاه طیف سنجی 517 نانومتر سنجش ایمونوسوربنت (ELISA) مورد بررسی قرار گرفت. اسید ال اسکوربیک به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. نسبت DPPH باقیمانده در کنار نمونه برای تعیین مقدار آنتی اکسیدانی که غلظت DPPH قبلی را کاهش می دهد، نقشه برداری شد. خاصیت مهار (درصد) به صورت تعیین شد

2.4. سنجش قدرت کاهش دهندهسنجش قدرت آنتی اکسیدانی کاهش دهنده یون آهن (FRAP) اغلب برای ارزیابی قابلیت آنتی اکسیدانی نوشیدنی ها، غذاها، میوه ها و مکمل های غذایی از جمله فلاونوئیدها یا پلی فنول ها استفاده می شود. دوزهای مختلف 36H به یک مخلوط بافر فسفات 67 میلی مولار ({3}}. 85 میلی‌لیتر، pH 6.8) و 20 درصد فریسیانید پتاسیم [K3Fe(CN)6، 2.5 میکرولیتر» وارد شد. محلول به مدت 20 دقیقه در دمای 50 درجه سانتیگراد واکنش نشان داد و سپس اسید تری کلرواستیک (10 درصد، 0.16 میلی لیتر) قبل از سانتریفیوژ شدن در 3000 گرم به مدت 10 دقیقه به محلول اضافه شد [14]. مایع رویی محلول (75 میکرولیتر) با 2 درصد FeCl3 (25 میکرولیتر) ترکیب شد و سپس یک دستگاه طیف سنجی ELISA جذب حاصل را در 700 نانومتر برای یک صفحه چاه اندازه گیری کرد. هیدروکسی آنیزول بوتیله (BHA) به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. هر چه صلاحیت کاهشی بیشتر باشد، جذب قوی تر است.

2.5. سنجش فعالیت کیلیت فلزی.پتانسیل آهنی کلروفیل یونی با استفاده از تکنیک Chen و همکاران اندازه گیری شد. [14]. به طور خلاصه، دوزهای مشخصی از نمونه‌ها در DMSO حل شد و به مخلوط FeCl2·4H2O (2.0 میلی‌مولار، 0.{10}}5 میلی‌لیتر) وارد شد. افزودن فروزین (5 میلی‌مولار، 0.2 میلی‌لیتر) هنگامی که محلول به شدت تکان داده شد، واکنش را آغاز کرد و سپس به مدت 10 دقیقه در دمای 25 درجه سانتی‌گراد باقی ماند. هنگامی که واکنش به تعادل رسید، مقادیر جذب برای محلول با استفاده از 560 نانومتر تعیین شد. یک وسیله نقلیه خالی EDTA به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. فرمول محاسبه برای فعالیت کیلیت با (1) یکسان بود.

2.6. سنجش فعالیت تیروزیناز قارچ.هم سرکوب فعالیت تیروزیناز قارچ و هم مهار تیروزیناز سلولی به روش اسپکتروفتومتری با استفاده از روش قبلی و با تغییرات جزئی تعیین شدند [2]. اسید کوجیک به عنوان کنترل مثبت برای سنجش فعالیت تیروزیناز استفاده شد. مواد ابتدا در DMSO آبی حل شده و در L-تیروزین (2.5 میلی گرم در میلی لیتر) با بافر فسفات (50 میلی متر، pH 6.8) کشت داده شدند. همه مدل‌ها از DMSO استفاده می‌کردند، که وقتی DMSO تشکیل می‌شود به فعالیت تیروزیناز بی‌ربط است.<0.5% of the total volume. Subsequently, 25 U/mL of mushroom tyrosinase with an identical buffer was then added, and the solution was incubated at 37° C for 30 min. An ELISA spectroscopic reader was used to conduct the absorbance measurements for the assays at 475 nm, using 96-well microplates (Molecular Devices, CA, USA).

2.7. کشت سلول های ملانوسیت انسانی (HMC).ملانوسیت های اپیدرمی اولیه انسان از پوست ختنه گاه نوزادان از Cascade Biologics به دست آمد. این نیز توسط وانگ و همکاران اعمال شد. [2]. این در محیط 254 (M-254- 500؛ Cascade Biologics، Portland، OR، USA) کشت و با مکمل رشد ملانوسیت انسانی (HMGS، cat. number S{3}}) تقویت شد. Medium 254 یک محیط پایه با برخی ویتامین های غیر ضروری و ضروری، ترکیبات آلی، اسیدهای آمینه، نمک های معدنی و مواد معدنی است. مکمل رشد ملانوسیت انسانی شامل سرم جنین گاوی، انسولین گاوی، عصاره هیپوفیز گاوی، ترانسفرین گاوی، هیدروکورتیزون، فاکتور رشد فیبروبلاست پایه، فوربول 12-میریستات 13-استات، و هپارین بود. تمام سلول ها در دمای 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور مرطوب شده با اتمسفر CO2 5 درصد انکوبه شدند.

2.8. تعیین زنده ماندن سلولی HMC.زنده ماندن سلول با استفاده از روش MTT [3] تعیین شد. هنگامی که یک تترازول زرد با دهیدروژناز میتوکندری (ubiquinone) در سلول‌های زنده ترکیب می‌شود، حلقه‌های تترازولیوم MTT می‌شکنند و به فرمازان بنفش تبدیل می‌شوند. سلول ها با تراکم 9 × 103 سلول/چاه در صفحات {3}چاهی کاشته شدند. هنگامی که سلول ها به مدت یک روز کشت داده شدند، محیط کشت تغییر کرد و غلظت های مختلف 36H به حجم نهایی محیط 100 میکرولیتری اضافه شد. پس از انکوبه شدن آنها به مدت 48 ساعت، محیط با یک محیط تازه (100 میکرولیتر)، از جمله MTT (0.5 میلی گرم در میلی لیتر) جایگزین شد. سپس پلیت در انکوباتور در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت با 5 درصد CO2 کشت داده شد. سپس DMSO (100 میکرولیتر) به هر چاهک اضافه شد تا کریستال های فورمازان بنفش حل شود. برای اطمینان از اینکه ظروف به حداکثر انحلال دست می یابند، ظروف به آرامی تکان داده شده و به مدت 10 دقیقه در تاریکی مخلوط شدند و در 595 نانومتر اندازه گیری شدند. رشد سلولی به صورت محاسبه شد

2.9. اندازه گیری فعالیت تیروزیناز از HMC.برای تعیین فعالیت تیروزیناز در سلول‌های ملانوسیت انسانی (HMC) (5 × 104 سلول در هر چاه)، آنها در 12-صفحه‌های چاهک در 1000 میکرولیتر محیط با دوزهای مختلف 36H قرار گرفتند و به مدت 48 ساعت کشت داده شدند [2] . بافر PBS برای شستشوی سلول های تیمار شده با نمونه استفاده شد و سپس با 1 درصد Triton X{9}}/PBS لیز شدند. سپس عصاره آنزیمی از لیزات سلولی حاصل جمع آوری شد و با 50 میکرولیتر L-تیروزین 2 میلی مولار ترکیب شد. سپس عصاره ها به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد در تاریکی انکوبه شدند. سپس از اسپکتروفتومتر برای تعیین میزان جذب آنها در 490 نانومتر استفاده شد.

2.10. تعیین محتوای ملانین در HMC.با برخی تغییرات جزئی، از تکنیک قبلی نیز برای این آزمایش استفاده شد [2]. گلوله های سلولی در 2.{2}} N NaOH با 10 درصد DMSO حل شده و به مدت 1 ساعت تا دمای 90 درجه سانتیگراد حرارت داده شدند. سوسپانسیون ها با سانتریفیوژ کردن به مدت 10 دقیقه در 10،{8}} گرم جدا شدند. با استفاده از اسپکتروفتومتر، محتوای ملانین از طریق داده های تولید شده در سطح جذب 475 نانومتر تعیین شد.

2.11. واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی در زمان واقعی.برای qRT-PCR، یک واکنش 20 میکرولیتری حاوی یک مخلوط 0.4 میلی لیتری از دو ترانس کریپتاز معکوس بود: 10 میکرولیتر از 2 × QuantiTect SYBR Green Master Mix (QIAGEN، والنسیا , CA, USA) با پلیمراز Taq start داغ، 0.8 میلی‌لیتر پرایمر، و 0}.5 میلی‌لیتر (10 نانوگرم در میلی‌لیتر) از الگو. توالی های پرایمر در جدول 1 فهرست شده اند. سیستم StepOnePlus™ برای تمام سنجش های PCR بلادرنگ استفاده کرده است. واکنش با انجام واکنش RT در دمای 42 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه و سپس فعال کردن FastStart Taq DNA پلیمراز در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه تکمیل شد. سپس برای 40 یا 50 سیکل در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 ثانیه برای دناتوراسیون، بازپخت و جذب در 60 درجه سانتیگراد به مدت 5 ثانیه تقویت شد. در نهایت در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 15 ثانیه کشیده شد. فلورسانس را می توان بعد از مرحله ازدیاد طول نیز اندازه گیری کرد، اما برای این آزمایش، پس از مرحله بازپخت اندازه گیری شد. با یک صفحه چاه، 9 میکرولیتر از لیزات به 11 میکرولیتر از مخلوط واکنش اضافه شد، که شامل 10.6 میکرولیتر MasterMix از کیت هسته Eurogentec qPCR برای SYBR Green I (1.4 میکرولیتر 50 میلی‌مولار MgCl2، 2 بود. میکرولیتر بافر واکنش 10x، 0.8 میکرولیتر از مخلوط dNTP 5 میلی‌مولار، 0.6 میکرولیتر SYBR Green I، 5.7 میکرولیتر آب بدون هسته، و 0.1 میکرولیتر گلداستار تاک پلیمراز داغ)، 0.1 میکرولیتر MS2 RNA، 0.1 میکرولیتر 10 RNA و رقیق‌شده 0.1 میکرولیتر از پرایمر REV (100 میکرومولار)، و همچنین MS2 FWD برای سنجش SG-PERT در سیستم ABI 7300 qPCR. واکنش qRTPCR، فعال‌سازی آنزیم GoldStar Taq داغ، 40-تقویت چرخه، بازپخت و اکتساب، دناتوراسیون در 95 درجه سانتی‌گراد، و افزایش طول در 72 درجه سانتی‌گراد از ابزار ABI 7300 استفاده کرد. برای آماده سازی روش، همه معرف ها یا روی یک بلوک خنک کننده یا روی یخ نگهداری شدند. واکنش‌های تکراری SGPERT روی هر نمونه لیزات انجام شد. با استفاده از نرم افزار و ابزار qPCR، یک ABI 7300 با آستانه تعیین شده به صورت دستی، و یک LightCycler® 480 با حداکثر روش مشتق دوم خود، چرخه مقادیر کمی (Cq) را تولید کردند. با استفاده از نرم افزار یکسان برای هر دو ابزار، پیک ذوب نیز به صورت خودکار محاسبه شد.

2.12. وسترن بلاتینگ.در مجموع 1 × 105 سلول به مدت دو روز با گروه های نمونه یا کنترل وسیله نقلیه خالی تیمار شدند. سلول‌ها جمع‌آوری و با بافر لیز (5{29}} میلی‌مولار Tris-HCl، pH 7.5، 137 میلی‌مولار کلرید سدیم، 50 میلی‌مولار سدیم L فلوراید، 10 میلی‌مولار سدیم پیروفسفات، 20 میلی‌مولار - گلیسروفسفاتیل متیل‌فلوفرید، 20 میلی‌مولار - گلیسروفسفاتیل‌میل‌فلوورید، گلیسروفسفاتیل‌میل‌فلوورید، 137 میلی‌مولار کلرید سدیم، 137 میلی‌مولار، بافر لیز، لیز شدند. 1 میلی‌مولار EDTA، 10 درصد گلیسرول، 1 درصد Nonidet P{15}}، 2 میکرومولار لوپپتین، 0.1 میلی‌مولار سدیم ارتووانادات، و 2 ug/mL آپروتینین) [14]. لیزها در 20،{22}} × گرم به مدت 30 دقیقه سانتریفیوژ شدند و غلظت پروتئین در محلول رویی با کیت سنجش پروتئین بیسینکونیک اسید (BCA) تعیین شد (Pierce, Rockford, IL, USA). مقادیر مساوی پروتئین با الکتروفورز ژل دودسیل سولفات-پلی آکریل آمید سدیم (SDS-PAGE) جدا شد و سپس به یک غشای نیتروسلولزی (PALL Life Science، Ann Arbor، MI، ایالات متحده آمریکا) انتقال الکتریکی داده شد. غشاء به مدت 1 ساعت با 5 درصد شیر بدون چربی در بافر PBS-T (PBS حاوی 0.1 درصد Tween 20) مسدود شد. فیلم انتقال به دقت از مخزن انتقال مرطوب و شکاف انتقال نیمه خشک خارج شد و در جعبه ای قرار داده شد که حاوی 5 درصد شیر بدون چربی در 1 x TBST به مدت 1 ساعت در دمای اتاق بود. سپس به آرامی با 1x TBST شسته شد تا آثار شیر بدون چربی از بین برود. غشاء سپس با آنتی بادی های اولیه مربوطه انکوبه شد. در هر مورد، غشاها با آنتی بادی ضد خرگوش یا موش کونژوگه با پراکسیداز ترب کوهی انکوبه شدند و سپس با معرف‌های تشخیص ECL تیمار شدند (PerkinElmer, ECL1: ECL{38}}: 1). یک سیستم تصویربرداری نورتابی شیمیایی کوچک از Life Science برای اندازه‌گیری برای تشخیص باندها استفاده شد [14].

2.13. تحلیل آماری.از هر غلظت 3 عدد برای استاندارد و نمونه ها استفاده شد. نتایج با استفاده از آزمون t-student مورد مقایسه آماری قرار گرفت و با استفاده از میانگین مقادیر میانگین ± انحراف معیار (SD) بیان شد.

3. نتایج

3.1. فعالیت پاکسازی رادیکال آزاد DPPH.وقتی تعادل بین رادیکال‌های آزاد و آنتی‌اکسیدان‌های ذاتی مختل شود، ROS می‌تواند پراکسیدهای لیپیدی، آسیب DNA، بیان پروتئین، پیری بافت و پیدایش سرطان تولید کند. واکنش‌های زنجیره‌ای رادیکال‌های آزاد با خنثی کردن اهدا یا پذیرش الکترون و کیل کردن جفت‌های تنها آزاد مسدود می‌شوند. کاهش استرس اکسیداتیو از جنبه های درونی و بیرونی یکی از راه های افزایش سلامت است. این مطالعه ویژگی‌های آنتی‌اکسیدانی را با تعیین قدرت کاهش آهن، ظرفیت حذف رادیکال‌های آزاد DPPH و قدرت کیل کردن فلز مورد بررسی قرار داد. افزایش تولید و تجمع ROS باعث اکسیداسیون لیپید در مواد غذایی و لوازم آرایشی و فعالیت آنتی اکسیدانی طبیعی می شود. به طور خاص، خواص حذف رادیکال های آزاد در افزودنی های تغذیه ای کاربردی و محصولات مراقبت از پوست حیاتی است.

اولین روش مهار اکسیداسیون، آزمایش مهار رادیکال آزاد DPPH بود. این یک پلت فرم آزمایشی ساده و اقتصادی است که در آن آنتی اکسیدان ها برای جلوگیری از اکسیداسیون محصولات عمل می کنند. آنتی اکسیدان ها رنگ معرف رادیکال پایدار DPPH را از بنفش به زرد روشن دی فنیل-پیکریل هیدرازین تغییر می دهند. برای تعیین خواص آنتی اکسیدانی 36H، دوز 100 میکرومولار برای تعیین توانایی مهار استفاده شد. جدول 2 نشان می دهد که 36H توانایی بسیار خوبی در مهار رادیکال های آزاد دارد و 60 درصد از رادیکال آزاد DPPH و ویتامین C را در همان غلظت (100 میکرومولار) 85.3 درصد از بین می برد.

3.2. قدرت آنتی اکسیدانی کاهش دهنده آهندومین روش بازدارنده اکسیداسیون، تست توان کاهش دهنده آهن است که یک روش متداول و قابل اعتماد برای اندازه گیری سنتز کمپلکس Fe(III)-ferricyanide است. یک عامل عملکردی کمپلکس های Fe3 به علاوه /فری سیانید را به شکل آهنی کاهش می دهد. این ترکیب یک رنگ آبی در 7{{{{{0}}}0 نانومتر داشت زیرا K4Fe(CN)6 با Fe3 plus واکنش نشان داد و Fe[Fe(CN)6]3 را تشکیل داد. در آزمایش، رنگ محلول از زرد روشن به سایه های مختلف آبی و سبز، بسته به قدرت کاهشی ترکیب مورد نظر، تغییر کرد. جدول 2 نشان می دهد که BHA در 100 میکرومولار دارای مقدار توان کاهنده 0.95 و 36H در 100 میکرومولار دارای مقدار توان کاهشی 0.85 در مقایسه با BHA است. بنابراین، 36H نشان داده شد که قدرت آنتی اکسیدانی خوبی برای کاهش آهن دارد.

3.3. ظرفیت کیل کردن یون آهن.فعالیت کیلیت برای یون های آهن 36H در جدول 2 نشان داده شده است. EDTA (100 میکرومولار) به عنوان یک کنترل مثبت استفاده شد. Fe2 پلاس و فروزین از نظر کمی کمپلکس تشکیل می دهند. تشکیل کمپلکس های معرف اغلب به دلیل عوامل کیلیت مختل می شود که منجر به کاهش رنگ قرمز کمپلکس می شود. 36H در دوز 10 میکرومولار تأثیر معنی‌داری بر ظرفیت مهار Fe2 بعلاوه نداشت و در غلظت 100 میکرومولار، 2/43 درصد مهار را نشان داد. کنترل مثبت، EDTA، تقریباً 80 درصد ظرفیت کیلیت یونی در 100 میکرومولار داشت.

3.4. اثر 36H بر فعالیت تیروزیناز قارچ.مهار فعالیت تیروزیناز در گزارش های متعددی توضیح داده شده است که اکثر آنها از تیروزیناز قارچ به عنوان مدل استفاده می کنند. این مزایا به خوبی توسط دانشمندان توسعه یافته است، روش‌های آسان، هزینه کم، فرآیند رنگدانه‌سازی سریع، ویژگی‌های ساختاری و عملکردی مشابه پستانداران، و راحتی در مشاهده رشد ملانین. مهار فعالیت تیروزیناز قارچ توسط 36H مورد مطالعه قرار گرفت و توانایی مهاری با غلظت 36H همبستگی مثبت داشت (شکل 2(a)). در دقیقه پانزدهم مشاهده شد که 36H در غلظت های مختلف (1، 5 و 10 میلی مولار) نسبت به شاهد باعث کاهش مقادیر OD می شود. فعالیت آنزیم حدود 10 درصد در 1 میلی مولار، 30 درصد در 5 میلی مولار و 40 درصد در 10 میلی مولار در مقایسه با کنترل وسیله نقلیه کاهش می یابد (شکل 2 (ب)). ارتباط بین فعالیت تیروزیناز و غلظت آن در 36H مورد مطالعه قرار گرفت. غلظت های مختلف بازدارنده، گروهی از خطوط را ایجاد می کند که همگی از مبدا عبور می کنند. مهار فعالیت تیروزیناز توسط 36H بر میزان آنزیم تأثیری نمی گذارد، که نشان می دهد 36H یک مهار کننده برگشت پذیر است (شکل 2(c)). نوع مهار تیروزیناز توسط 36H با استفاده از طرح دوطرفه Lineweaver-Burk تایید شد. نمودارهای 1/v در مقابل 1/[s] یک خانواده از خطوط مستقیم را از طریق مبدأ نشان می‌دهد که نشان می‌دهد 36H یک مجموعه رقابتی است. سینتیک آنزیم در شکل 2 (d) ارائه شده است.

3.5. اثر زنده ماندن سلولی، تیروزیناز سلولی و محتوای ملانین بر 36H در HMC.به عنوان یک ترکیب قوی روشن کننده پوست، این جزء باید بی ضرر و بدون عوارض جانبی سیتوتوکسیک نامطلوب باشد. برخی از مهارکننده های معروف سنتز ملانین از جمله اسید کوجیک، آربوتین، PTU یا هیدروکینون وجود دارند که در حال حاضر در سطح جهانی به عنوان مواد آرایشی مورد استفاده قرار می گیرند. ما همچنین کشف کردیم که این مهارکننده های ملانوژن ممکن است در دوزهای با غلظت بالا یا استفاده مکرر باعث ایجاد تومورزایی پوست انسان شوند [2]. HMC در 36H به مدت 48 ساعت در غلظت های مختلف 1، 5، 10 و 25 میکرومولار کشت داده شد و زنده ماندن سلول برای نشان دادن سمیت سلولی کم در شکل 3 (a) تعیین شد. هنگام در نظر گرفتن عامل برای استفاده درمانی یا آرایشی در انسان، متوجه شدیم که عواقب سیتوتوکسیک بر قابلیت‌های سلولی پوست انسان ناچیز است. برای درک اثر مهاری 36H بر ملانوژنز، ما فعالیت تیروزیناز داخل سلولی را در HMC ارزیابی کردیم. نتایج برای فعالیت تیروزیناز در HMC نشان داد که با افزایش غلظت، یک تغییر آشکار وجود دارد، و فعالیت تیروزیناز برای سمیت سلولی کم کاهش یافت. پس از درمان، فعالیت تیروزیناز به صورت وابسته به دوز به 2.2 ± 39 درصد در 25 میکرومولار کاهش یافت (شکل 3 (b)). این نتایج نشان داد که 36H فعالیت تیروزیناز داخل سلولی را مهار می کند. نتایج سنجش ملانین به وضوح نشان داد که 36H محتوای ملانین را در HMC به روشی وابسته به دوز کاهش می دهد (شکل 3(c)). درصد کنترل نشان دهنده محتوای ملانین است. پس از درمان، محتوای ملانین 77 درصد در 25 میکرومولار، 84 درصد در 10 میکرومولار، 88 درصد در 5 میکرومولار، و 90 درصد در 1 میکرومولار بود. این نتایج نشان داد که 36H اثر مهاری قابل توجهی بر سنتز ملانین در HMC در 25 میکرومولار دارد.

3.6. mRNA و پروتئین های مرتبط با بیوسنتز ملانین تحت تأثیر 36H در HMC قرار گرفتند.بیوسنتز ملانین در ملانوزوم ها اتفاق می افتد و سوبسترای اسید آمینه اولیه تیروزین است. تیروزین ابتدا از طریق تیروزیناز به L-DOPA کاتالیز می شود و با استفاده از همان آنزیم تیروزیناز، DOPA به دوپاکینون کاتالیز می شود. دوپاکینون توسط دوپاکروم توتومراز (پروتئین مربوط به تیروزیناز- 2، TRP-2)، TRP-1 و تیروزیناز کاتالیز می‌شود تا اوملانین را تشکیل دهد. در HMC، 36H RNA ها و پروتئین های مرتبط با ملانوژنز سلولی را کاهش داد همانطور که در شکل 4 نشان داده شده است.

3.7. اثر 36H بر بلوغ ملانوزوم.ملانوزوم اندامکی است که به سنتز ملانین در ملانوسیت ها متکی است. هر چه ملانوزوم ها بالغ تر شوند، ملانین بیشتری تشکیل می شود. بنابراین بلوغ ملانوزوم در مکانیسم سفید شدن پوست مهم است. پروتئین پرملانوزوم 17 (Pmel17) برای پیش سازهای اندامک رنگدانه، ملانوزوم، هدف قرار می گیرد، جایی که به صورت پروتئولیتیک به چندین قطعه کوچک پردازش می شود. برخی از این قطعات، آمیلوئیدهای غیرپاتولوژیک را تشکیل می دهند که به صورت ورقه ها جمع می شوند و الگوی مخطط را تشکیل می دهند که زیر بنای فراساختار ملانوما قرار دارد. این مطالعه نشان داد که 36H بیان Pmel17 RNA و پروتئین را در HMC کاهش داد (شکل 5).

3.8. اثر 36H بر انتقال ملانوزوم.Rab27a، MLPH و Myo5a یک کمپلکس سه پروتئینی را برای اتصال ملانوزوم ها در حاشیه ملانوسیت تشکیل می دهند. در فرآیند انتقال ملانوزوم، کمپلکس سه تایی ارتباط بین اسکلت سلولی اکتین و ملانوزوم است. کمبود این پروتئین ها بر حمل و نقل تأثیر می گذارد و ملانورگولین (Mreg) از طریق یک مکانیسم ریزش تنظیم شده، انتقال ملانوزوم را از ملانوسیت ها به کراتینوسیت ها هدایت می کند. این مطالعه نشان داد که 36H با تأثیر بر این RNA و پروتئین های مرتبط، انتقال ملانوزوم را کاهش داد (شکل 6).

بیشتر بخواهید: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501