سیستانچ دسرتیکولا پلی ساکارید از طریق مهار سیگنال دهی RANKL و تولید گونه های اکسیژن واکنش پذیر، استئوکلاستوژنز و تحلیل استخوان را کاهش می دهد.

مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

دژی سانگ و همکاران

پوکی استخوان یک بیماری متابولیک است که با استئوپنی و تخریب ریزساختار استخوان مشخص می شود. استئوکلاست ها سلول های موثر اولیه هستند که ماتریکس استخوان را تخریب می کنند و عملکرد غیر طبیعی آنها منجر به ایجاد پوکی استخوان می شود. تجمع گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) در طول متابولیسم سلولی باعث تکثیر و تمایز استئوکلاست‌ها می‌شود، بنابراین نقش مهمی در پوکی استخوان بازی می‌کند.سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید(CDP) دارای فعالیت ضد توموری، ضد التهابی و آنتی اکسیدانی است. با این حال، تاثیر CDP بر استئوکلاست ها نامشخص است. در این مطالعه، رنگ آمیزی اسید فسفاتاز مقاوم به تارتارات، ایمونوفلورسانس، واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس، و تجزیه و تحلیل وسترن بلات برای نشان دادن CDP استفاده شد.(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)مهار استئوکلاستوژنز و جذب هیدروکسی آپاتیت. علاوه بر این، CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)همچنین بیان ژن‌های نشانگر استئوکلاست شامل Ctsk، Mmp9 و Acp5 را مهار کرد و تأثیری بر بیان گیرنده‌های فعال کننده فاکتور هسته‌ای κB (RANK) نداشت. تجزیه و تحلیل مکانیکی نشان داد که CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)بیان آنزیم های آنتی اکسیدانی را برای کاهش تولید ROS با واسطه RANKL در استئوکلاست ها افزایش می دهد و فاکتور هسته ای سلول های T فعال و فعال شدن پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن را مهار می کند. این نتایج نشان می دهد که CDP ممکن است یک داروی کاندید برای درمان پوکی استخوان ناشی از فعالیت بیش از حد استئوکلاست باشد.

کلید واژه هاتحلیل استخوان،سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید، MAPK، استئوکلاست، گونه های اکسیژن فعال

بدنسازی سیستانچ

1|مقدمه

تعادل بین تشکیل استخوان، با واسطه استئوبلاست ها، و تحلیل استخوان، با واسطه استئوکلاست ها، نقش حیاتی در حفظ هموستاز متابولیک استخوان ایفا می کند (Manolagas, 2000؛ Zhu et al., 2018). هنگامی که تحلیل استخوان از تشکیل استخوان بیشتر شود، پوکی استخوان رخ می دهد که با کاهش توده استخوانی و آسیب ریزساختاری استخوان مشخص می شود (Ikeda، 2008). پوکی استخوان یک بیماری شایع در افراد مسن و زنان یائسه است و پاتوژنز آن به طور کامل مشخص نشده است (Cooper & Melton, 1992). کمبود استروژن یکی از دلایل اصلی پوکی استخوان است (مانولاگاس، اوبراین و آلمیدا، 2013). علاوه بر این، گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) می‌توانند توسط فعال‌کننده گیرنده لیگاند kB فاکتور هسته‌ای (RANKL) القا شوند و با تشکیل استئوکلاست‌ها مرتبط هستند (Yip et al., 2005)، و بنابراین ممکن است در ایجاد پوکی استخوان نقش داشته باشند (مانولاگاس، 2010). برخی از مطالعات نشان داده اند که کمبود آنتی اکسیدان Nrf2 باعث افزایش سطح ROS و افزایش تمایز استئوکلاست های ناشی از RANKL می شود (هیون، لی، یانگ و جئونگ، 2013). بنابراین، کاهش تولید ROS در طول تمایز استئوکلاست ها باید به عنوان یک استراتژی درمانی برای درمان پوکی استخوان ارزیابی شود.

استئوکلاست ها از دودمان خونساز مونوسیت یا ماکروفاژ مشتق می شوند و تنها سلول های چند هسته ای هستند که تحلیل استخوان را انجام می دهند (Teitelbaum، 2000). بنابراین، تحقیقات مربوط به تشکیل استئوکلاست از اهمیت زیادی در ایجاد درمان‌های مؤثر برای بیماری‌های متابولیسم استخوان برخوردار است (لورنزو، 2017). فاکتور تحریک کننده کلنی ماکروفاژ (M-CSF) و RANKL که توسط استئوبلاست ها و سلول های T فعال تولید می شود، سیتوکین های مهمی هستند که استئوکلاستوژنز را تنظیم می کنند (Kim & Kim, 2016؛ Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL بیان فاکتور هسته ای سلول های T فعال (NFATc1) را القا می کند که یک فاکتور رونویسی حیاتی است که در طول تشکیل استئوکلاست فعال است (Ishida et al., 2002). NFATc1 فعال شده بیان ژن‌های نشانگر استئوکلاست مانند اسید فسفاتاز مقاوم به تارتارات (TRAcP) و کاتپسین K (CTSK) را که استئوکلاستوژنز و عملکرد استئوکلاست را تنظیم می‌کنند، ترویج می‌کند (بالکان و همکاران، 2009؛ کروتی و همکاران، 2008).

سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید(CDP) از ساقه های گوشتی جدا شده استسیستانچو دارای تنظیم ایمنی، ضد تومور، ضد پیری و سایر اثرات دارویی است (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo, & Du, 2012). CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)اثر مهاری بر تولید اکسید نیتریک (NO) ناشی از لیپوپلی ساکارید در سلول های میکروگلیال موش داشت (سلول های BV-2؛ نان و همکاران، 2013). علاوه بر این، یک عصاره غنی از فنیل اتانوئید (ECD) ازسیستانچظرفیت شنای موش ها را با کاهش آسیب عضلانی، تاخیر در تجمع اسید لاکتیک و بهبود ذخیره انرژی افزایش داد (Cai et al., 2010). با این حال، اثرات CDP بر عملکرد و فعالیت استئوکلاست ناشناخته باقی مانده است.

در این مطالعه، ما نشان دادیم که CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)تمایز استئوکلاست های ناشی از RANKL و تحلیل استخوان را مهار می کند. مکانیسم اساسی آن CDP بود(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)بیان آنزیم های آنتی اکسیدانی را برای کاهش تولید ROS افزایش می دهد و سپس آبشارهای سیگنالینگ NFAT فعال شده با RANKL و پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن (MAPK) را سرکوب می کند. این نتایج نشان می دهد که CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)ممکن است برای درمان پوکی استخوان ناشی از تحلیل استخوان بیش از حد استئوکلاستیک استفاده شود.

سیستانچ جینسینگ ماکا

2|مواد و روش ها

2.1|مواد

CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)(خلوص > 98 درصد) از Solarbio (پکن، چین) خریداری شد و در غلظت 1 میلی مولار در سالین بافر فسفات (PBS) تهیه شد. آنتی بادی‌ها برای c-Fos، CTSK، GSR، TRX1، NOS2، TRAF6، RANK، NFATc1، ERK، JNK، p38، فسفریله (p)-ERK، p-p38، p-JNK و -اکتین اختصاصی هستند. بیوتکنولوژی کروز (سان خوزه، کالیفرنیا). آنتی بادی های V-ATPase d2 همانطور که قبلا توضیح داده شد تولید شد (H. Feng و همکاران، 2009). سیستم سنجش 3-(4،5-دی متیل تیازول-2-ایل)-5-(3-کربوکسی متوکسی فنیل)-2-(4-سولفوفنیل)-2H-تترازولیوم (MTS) و لوسیفراز از Promega (سیدنی، استرالیا) به دست آمد. . نوترکیب M-CSF از R&D Systems (Minneapolis، MN) خریداری شد. پروتئین نوترکیب GST-rRANKL همانطور که قبلاً توضیح داده شد، بیان و خالص شد (Xu et al., 2000).

2.2|کشت سلولی

سلول‌های RAW264.7 (سلول‌های ماکروفاژ موش) از مجموعه کشت نوع آمریکایی (ATCC، Manassas، VA) به‌دست آمد و در محیط حداقل ضروری اصلاح‌شده (Thermo Fisher Scientific، Scoresby، استرالیا) همراه با 10 درصد سرم جنین گاو، 2 میلی‌مولار کشت داده شدند. L-گلوتامین، 100 U/ml پنی سیلین، و 100 ug/ml استرپتومایسین (محیط کامل). مونوسیت‌های مشتق شده از مغز استخوان (BMMs) از موش‌های 6 هفته‌ای C57BL/6J جدا شدند که طبق روش‌های تایید شده توسط کمیته اخلاق حیوانات دانشگاه استرالیای غربی (RA/3/100/1244) کشته شدند. استخوان‌های بلند عاری از بافت‌های نرم تشریح شدند و مغز استخوان از استخوان ران و تیبیا شسته شد و سپس در یک محیط کامل در حضور M-CSF (ng/ml 50) کشت داده شد.

2.3|سنجش استئوکلاستوژنز

BMMها در صفحات کشت 96 چاهی با تراکم 6 × 103 سلول در هر چاهک قرار داده شدند و با محیط کامل حاوی M-CSF (ng/ml 50) و GST-rRANKL (100ng/ml) در حضور یا عدم وجود غلظت های مختلف CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>سه هسته) به عنوان استئوکلاست شناسایی شدند.

2.4|سنجش سمیت سلولی

BMM ها در صفحات 96 چاهی در 6 × 103 سلول در هر چاه کاشته شدند و یک شبه رها شدند تا بچسبند. روز بعد، سلول ها با غلظت های مختلف CDP انکوبه شدند(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید). پس از 48 ساعت دیگر، محلول MTS (20 میکرولیتر در چاه) اضافه شد و به مدت 2 ساعت با سلول ها انکوبه شد. جذب در 490 نانومتر با دستگاه میکروپلیت خوان (Multiscan Spectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA) تعیین شد.

2.5|رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس

BMMها با تراکم 6 × 103 سلول در هر چاهک در حضور M-CSF (ng/ml 50) در طول شب کاشته شدند. سپس سلول ها با M-CSF و GST-rRANKL (100ng/ml) تحریک شدند تا استئوکلاست های بالغ تشکیل شوند. سپس استئوکلاست ها با غلظت های مختلف CDP تحت درمان قرار گرفتند(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)به مدت 48 ساعت قبل از تثبیت با 4 درصد پارافورمالدئید، نفوذپذیری با 0.1 درصد Triton X-100-PBS، و مسدود کردن با آلبومین سرم گاوی 3 درصد در PBS. سلول های آماده شده با فالویدین کونژوگه با رودامین به مدت 45 دقیقه در تاریکی انکوبه شدند تا برای F-actin رنگ آمیزی شوند. سپس سلول‌ها با PBS شسته شدند، هسته‌ها با 4'،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) رنگ آمیزی شدند و با پوشش‌هایی برای میکروسکوپ کانفوکال نصب شدند.

تجربه سیستانچ

2.6|سنجش جذب هیدروکسی آپاتیت

برای اندازه گیری فعالیت استئوکلاست، BMMs (1 × 105 سلول در هر چاه) کشت داده شده روی صفحات پوشش داده شده با کلاژن شش چاهی (BD Biocoat؛ Thermo Fisher Scientific) با GST-rRANKL (100ng/ml) و M-CSF (50ng/ml) تحریک شدند. میلی لیتر) تا زمانی که استئوکلاست های بالغ تولید شوند (ژو و همکاران، 2016). سپس سلول ها با استفاده از محلول تفکیک سلولی (Sigma-Aldrich) به آرامی از صفحه جدا شدند و تعداد مساوی از استئوکلاست های بالغ بر روی چاهک های جداگانه در صفحات 96 چاهی پوشش داده شده با هیدروکسی آپاتیت کاشته شدند (Corning Osteoassay, Corning, NY). استئوکلاست های بالغ در محیطی حاوی GST-rRANKL و M-CSF با یا بدون CDP انکوبه شدند.(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)در غلظت های مشخص شده پس از 48 ساعت، نیمی از چاهک ها برای فعالیت TRAcP رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمیایی شدند، همانطور که در بالا توضیح داده شد، تا تعداد سلول های چند هسته ای در هر چاه ارزیابی شود. چاه‌های باقی‌مانده به مدت 10 دقیقه سفید شدند تا سلول‌ها حذف شوند و امکان اندازه‌گیری نواحی جذب‌شده فراهم شود. از نواحی جذب شده تحت میکروسکوپ نوری استاندارد عکسبرداری شد و از نرم افزار Image J (موسسه ملی بهداشت، Bethesda، MD) برای تعیین کمیت سطح درصد سطح هیدروکسی آپاتیت جذب شده توسط استئوکلاست ها استفاده شد.

2.7|ارزیابی خبرنگار لوسیفراز

برای بررسی فعال‌سازی رونویسی NFATc1، سلول‌های RAW264.7 به‌طور پایدار با ساختار گزارشگر لوسیفراز پاسخ‌دهنده به NFATc1 ترانسفکت شدند (چنگ و همکاران، 2018؛ واندر کران و همکاران، 2013). سلول های ترانسفکت شده در صفحات 48 چاهی با تراکم 1.5 × 105 سلول در هر چاهک کشت و با غلظت های مختلف CDP پیش تیمار شدند.(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)به مدت 1 ساعت پس از پیش تیمار، سلول ها با GST-rRANKL (100 نانوگرم در میلی لیتر) به مدت 24 ساعت تحریک شدند و فعالیت لوسیفراز با استفاده از سیستم سنجش گزارشگر لوسیفراز طبق پروتکل سازنده (Promega) اندازه گیری شد.

2.8|تجزیه و تحلیل کمی واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس (RT-PCR).

RNA کل با استفاده از معرف Trizol طبق پروتکل سازنده (Thermo Fisher Scientific) از سلول ها جدا شد. DNA مکمل با استفاده از رونوشت معکوس ویروس لوسمی موش مولونی با 1 میکروگرم الگوی RNA و پرایمرهای oligo-dT سنتز شد. تقویت واکنش زنجیره ای پلیمراز توالی های خاص با استفاده از برنامه زیر انجام شد: 94 درجه به مدت 5 دقیقه، به دنبال آن 30 چرخه 94 درجه برای 40 ثانیه، 60 درجه برای 40 ثانیه، و 72 درجه برای 40 ثانیه، و مرحله نهایی گسترش 5 دقیقه در 72 درجه اطلاعات دقیق پرایمرهای خاص در جدول 1 نشان داده شده است. سطوح RNA پیام رسان نسبی با عادی سازی بیان ژن خانه داری Hmbs محاسبه شد.

2.9|تجزیه و تحلیل وسترن بلات

BMMها در محیط کامل با M-CSF در صفحات شش چاهی کشت و با GST-rRANKL (100 نانوگرم در میلی لیتر) برای زمان های اعلام شده تحریک شدند. سلول ها در بافر لیز رادیوایمنو رسوبی لیز شدند و پروتئین ها با الکتروفورز ژل سدیم دودسیل سولفات-پلی آکریل آمید حل و فصل شدند و به غشاهای پلی (وینیلیدین فلوراید) (GE Healthcare، Silverwater، استرالیا) منتقل شدند. غشاها به مدت 1 ساعت در شیر بدون چربی 5 درصد مسدود شدند و سپس با آنتی بادی های اولیه اختصاصی مختلف با تکان دادن ملایم در طول شب در دمای 4 درجه کاوش شدند. غشاها شسته شدند و متعاقبا با آنتی بادی های ثانویه کونژوگه ترب کوهی پراکسیداز انکوبه شدند. سپس واکنش‌پذیری آنتی‌بادی با معرف شیمی‌لومینسانس تقویت‌شده (Amersham Pharmacia Biotech، Piscataway، NJ) شناسایی شد و با Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare) تجسم شد.

2.10|تشخیص ROS داخل سلولی

سطوح ROS درون سلولی با استفاده از کیت سنجش ROS سلولی 2'،7'-dichlorofluorescein diacetate شناسایی شد (Abcam، ملبورن، استرالیا). BMMs (5 × 103 سلول در هر چاه) در صفحات 96 چاهک کشت داده شدند و با RANKL (100 نانوگرم در میلی لیتر)، M-CSF (50 نانوگرم در میلی لیتر)، و CDP به مدت 72 ساعت تیمار شدند. سطوح ROS داخل سلولی با استفاده از دی استات 2'،7'-دی کلروفلورسین اندازه گیری شد که در حضور ROS به DCF فلورسنت اکسید می شود. سلول ها در بافر Hank شسته شدند و در تاریکی به مدت 30 دقیقه با 10 میکرومولار DCFH-DA انکوبه شدند. تصاویر با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال به دست آمد.

2.11|تحلیل های آماری

همه داده ها نماینده حداقل سه آزمایش هستند که در سه تکرار انجام شده است مگر اینکه خلاف آن مشخص شده باشد. داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان می شوند. تجزیه و تحلیل واریانس یک طرفه و به دنبال آن آزمون تعقیبی Student–Newman–Keuls برای تعیین معنی‌داری تفاوت‌های بین نتایج استفاده شد که P <{0}}.05 معنی‌دار="" در="" نظر="" گرفته="">

3|نتایج

3.1|CDP از استئوکلاستوژنز و همجوشی استئوکلاست های ناشی از RANKL جلوگیری می کند

برای تعیین اینکه آیا CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)می تواند تشکیل استئوکلاست ناشی از RANKL را سرکوب کند، ما ابتدا یک سنجش استئوکلاستوژنز را با استفاده از BMMهای موش انجام دادیم (لیو و همکاران، 2013؛ سونگ و همکاران، 2016). BMMها با RANKL و M-CSF به مدت 5 روز با افزایش غلظت CDP تحت درمان قرار گرفتند. با غلظت CDP، CDP تعداد سلول های چند هسته ای مثبت TRAcP را کاهش داد(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)به 5 میکرومولار یا بیشتر رسید (شکل 1a,b). برای ارزیابی CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)سمیت و تأیید اینکه این نتایج بازتابی از مرگ یا تعداد سلولی نبود، ما یک سنجش MTS را انجام دادیم. BMM ها با RANKL و M-CSF به مدت 48 ساعت با دوزهای مختلف CDP تحت درمان قرار گرفتند.(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید). CDP هیچ تاثیری بر تکثیر BMM در غلظت 15 میکرومولار یا کمتر نداشت (شکل 1c).

برای آزمایش اثرات CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)در پیوند استئوکلاست ها، استئوکلاست ها با درمان RANKL و M-CSF، با یا بدون دوزهای مختلف CDP القا شدند.(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید). استئوکلاست ها برای ارزیابی تعداد هسته در هر استئوکلاست با رودامین-فالویدین و DAPI رنگ آمیزی شدند (شکل 2a). تعداد استئوکلاست ها و میانگین تعداد هسته ها در هر استئوکلاست به دنبال CDP کاهش یافت(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)درمان (5-10 میکرومولار؛ شکل 2b,c). بنابراین، CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)اثرات مهاری بر استئوکلاستوژنز و همجوشی استئوکلاست‌های ناشی از RANKL به روشی وابسته به دوز داشت.

3.2|CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)فعالیت جذب هیدروکسی آپاتیت استئوکلاستیک ناشی از RANKL را کاهش می دهد

یک سنجش جذب هیدروکسی آپاتیت برای تشخیص اثر CDP انجام شد(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)بر روی عملکرد استئوکلاست (شکل 3a). پس از انکوباسیون 24 ساعته، تعداد استئوکلاست ها در هر چاه تغییری نکرد در حالی که ناحیه جذب هیدروکسی آپاتیت به طور قابل توجهی با تیمار با 5 و 10 میکرومولار CDP در مقایسه با گروه های کنترل کاهش یافت (شکل 3b,c). این نتایج نشان می دهد که CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)دارای اثرات مهاری قوی بر روی تشکیل استئوکلاست و فعالیت تحلیل استئوکلاست بدون هیچ گونه اثرات سیتوتوکسیک است.

3.3|CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)بیان ژن نشانگر استئوکلاست را مهار می کند

برای بررسی بیشتر اثرات بازدارندگی CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)در مورد استئوکلاستوژنز و تحلیل استخوان استئوکلاستیک، BMM ها با RANKL و M-CSF به مدت 5 روز با غلظت های مختلف CDP تحت درمان قرار گرفتند.(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید). سپس RT-PCR برای تشخیص بیان ژن‌های نشانگر استئوکلاست انجام شد. بیان Nfatc1، یک فاکتور رونویسی مهم در طول استئوکلاستوژنز، توسط CDP مهار شد.(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)به روشی وابسته به دوز (شکل 4a). علاوه بر این، CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)(5 و 10 میکرومولار) بیان ژن‌های مرتبط با تحلیل استخوان، از جمله Mmp9، Ctsk، و Acp5 را کاهش دادند (شکل 4b-d).

3.4|CDP فعالیت NFATc1 و بیان پروتئین پایین دست را سرکوب می کند

برای بررسی اثر CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)در مورد فعالیت NFATc1 ناشی از RANKL، یک سنجش گزارشگر لوسیفراز انجام شد. درمان با CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)در غلظت های 5 میکرومولار و بالاتر، به طور قابل توجهی فعالیت NFATc1 ناشی از RANKL را مهار کرد (شکل 5a). علاوه بر این، تجزیه و تحلیل وسترن بلات نشان داد که CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)به طور قابل توجهی بیان پروتئین NFATc1 و c-Fos را در BMMهای تیمار شده با RANKL و M-CSF به مدت 3 و 5 روز سرکوب کرد (شکل 5b). علاوه بر این، بیان پروتئین‌های مرتبط با عملکرد استئوکلاست، مانند V-ATPase-d2 و CTSK، در حضور CDP کاهش یافت.(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)در مقایسه با گروه های کنترل با این حال، CDP هیچ تاثیری بر بیان RANK نداشت (شکل 5b).

3.5|CDP بیان آنزیم های آنتی اکسیدانی را برای از بین بردن تولید ROS در طول استئوکلاستوژنز ناشی از RANKL ترویج می کند.

برای بررسی مکانیسم اساسی مهار استئوکلاستوژنز وابسته به CDP، BMM ها با RANKL (100 نانوگرم در میلی لیتر) و M-CSF (50 نانوگرم در میلی لیتر) همراه با PBS یا CDP درمان شدند.(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)به مدت 72 ساعت ما اثر CDP را بر تولید ROS درون سلولی تحریک شده توسط RANKL بررسی کردیم. سطوح ROS داخل سلولی با تیمار RANKL افزایش یافت که توسط CDP کاهش یافت (5 و 10 میکرومولار؛ شکل 6a). هم تعداد سلول های ROS مثبت و هم شدت رنگ آمیزی ROS با درمان CDP به روشی وابسته به دوز کاهش یافت (شکل 6b,c). تجزیه و تحلیل وسترن بلات نشان داد که CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)بیان تیوردوکسین (TRX1) و گلوتاتیون ردوکتاز (GSR) را در حالی که بیان نیتریک اکساید سنتاز القایی (NOS2) را در BMMهایی که با RANKL و M-CSF به مدت 3 روز تحت درمان قرار گرفتند، سرکوب کرد (شکل 6d).

برای بررسی بیشتر اگر CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)تمایز استئوکلاست ها را با کاهش تولید ROS سرکوب کردیم، سپس BMM ها را با پراکسید (10 میکرومولار) برای تقلید از وضعیت ROS بالا در سلول ها درمان کردیم. BMMها توسط RANKL و M-CSF به مدت 3 روز القا شدند و نتایج تجزیه و تحلیل وسترن بلات و RT-PCR نشان داد که پراکسید بیان NFATc1 و c-Fos را در مقایسه با گروه‌های کنترل افزایش می‌دهد. مطابق با نتایج در شکل 5، بیان NFATc1 و c-Fos توسط CDP سرکوب شد.(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)در حالی که پراکسید اثر مهاری CDP را نجات داد (شکل 6e,f). این داده ها نشان داد که CDP بیان NFATc1 و c-Fos را با مهار تولید ROS سرکوب می کند.

3.6|CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)مسیرهای MAPK را در طول استئوکلاستوژنز ناشی از RANKL سرکوب می کند

بعد، ما اثر CDP را بررسی کردیم(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)درمان بر بیان TRAF6 با واسطه RANKL و فعال سازی مسیر MAPK. پس از انکوباسیون در محیط بدون سرم به مدت 2 ساعت، BMMها با RANKL، با یا بدون CDP، به مدت 60 دقیقه تحریک شدند. تحریک با CDP (10 میکرومولار) تأثیری بر بیان TRAF6 نداشت و فسفوریلاسیون JNK2 و ERK1/2 را در 10 و 20 دقیقه کاهش داد (شکل 7). علاوه بر این، فسفوریلاسیون p38 به طور قابل توجهی توسط CDP مهار شد(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)درمان 60 دقیقه ای در مقایسه با گروه های کنترل (شکل 7). این داده ها نشان می دهد که CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)مسیرهای سیگنالینگ MAPK ناشی از RANKL را سرکوب می کند، مطابق با اثر مهاری آن بر تشکیل و فعالیت استئوکلاست.

4|بحث

سیستانچ که به نام "جین سینگ صحرا" شناخته می شود، اخیراً به دلیل توانایی آن در تعدیل ایمنی و عملکرد محافظتی در طول پیری و استرس اکسیداتیو توجه زیادی را به خود جلب کرده است (جیا و همکاران، 2012؛ اسنیتنیکوا و همکاران، 2012). گلیکوزیدهای جایگزین شده با فنیل پروپانوئید، اجزای اصلی فعال سیستانچ، نشان داده شده است که فعالیت NO را در ماکروفاژها مهار می کنند (Ahn، Chae، Chin و Kim، 2017). علاوه بر این، الفسیستانچعصاره استرس اکسیداتیو را در میوکارد خونرسانی مجدد به دنبال ایسکمی کاهش داد و نقش مهمی در مهار مسیرهای آپوپتوز منجر به محافظت قلبی ایفا کرد (Yu, Li, & Cao, 2016). به عنوان یک جزء مهم از Cistanche، CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)دارای عملکردهای دارویی متنوعی است. مطالعه فعلی ما نشان داد که CDP تمایز و فعال‌سازی استئوکلاست‌های فعال شده با RANKL را با کاهش تولید ROS و همچنین فعال‌سازی NFAT و MAPK سرکوب می‌کند.

به عنوان یک اسید فسفاتاز، TRAcP در انواع سلول ها وجود دارد و در استئوکلاست ها و ماکروفاژهای آلوئولی به وفور یافت می شود (Snipes, Lam, Dodd, Gray, & Cohen, 1986). TRAcP یک آنزیم مشخصه استئوکلاست ها است و بیان آن ارتباط نزدیکی با عملکرد استئوکلاست دارد و به عنوان شاخصی از فعالیت استئوکلاست ها و تحلیل استخوان در نظر گرفته می شود (Minkin, 1982). در مطالعه ما، CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)تعداد سلول های TRAcP مثبت را مهار کرد، که نشان می دهد استئوکلاستوژنز ناشی از RANKL توسط CDP مسدود شده است.(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید). تخریب ماتریکس استخوان توسط استئوکلاست ها به کاتپسین K (CTSK) و MMP ها بستگی دارد (گروبر، 2015). در اینجا، CDP به طور قابل توجهی بیان ژن های عملکردی استئوکلاست مانند Mmp9، Ctsk و Acp5 را کاهش داد.

تمایز و عملکرد استئوکلاست توسط مسیرهای سیگنال دهی متعدد تنظیم می شود (بویل، سیمونت و لیسی، 2003). پس از اتصال به RANK، RANKL پروتئین آداپتور TRAF6 را به کار می گیرد تا بیان NFATc1 را فعال کند، که یک فاکتور رونویسی مهم برای تشکیل استئوکلاست است و بر بیان ژن اختصاصی استئوکلاست، از جمله TRAcP و CTSK تأثیر می گذارد (X. Feng، 2005؛ Takayanagi et al., 2002). در این مطالعه متوجه شدیم که CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)هیچ تاثیری بر بیان رتبه و TRAF6 در استئوکلاست ها نداشت. با این حال، CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)مهار فعال سازی NFATc1 ناشی از RANKL در طول استئوکلاستوژنز BMMs. علاوه بر این، نشان داده شد که ROS، تولید شده توسط میتوکندری در فرآیند تحویل الکترون‌ها، تکثیر و تمایز استئوکلاست‌ها را افزایش داده و تخریب ماتریکس استخوان را تنظیم می‌کند (Ha et al., 2004). یک مطالعه اخیر نشان داد که RANKL باعث واردات هسته ای Bach1 و کاهش تولید آنزیم آنتی اکسیدانی Nrf2 می شود، در نتیجه بیان ROS داخل سلولی و استئوکلاستوژنز را در موش افزایش می دهد (Kanzaki et al., 2017). علاوه بر این، افزایش تولید ROS داخل سلولی توسط هموسیستئین، تشکیل و فعالیت استئوکلاست را افزایش داد (Koh et al., 2006). مطالعه ما نشان داد که CDP با مهار بیان NOS2 و ترویج بیان آنزیم های آنتی اکسیدانی مانند TRX1 و گلوتاتیون ردوکتاز، تجمع ROS را در استئوکلاست ها کاهش می دهد. وقتی BMMها را با پراکسید درمان کردیم تا تجمع ROS درون سلولی را افزایش دهیم، نتایجی که افزایش ROS می‌تواند بیان NFATc1 را بهبود بخشد نشان داد که ROS در بالادست NFATc1 است. ما همچنین دریافتیم که پراکسید اثر مهاری CDP بر بیان NFATc1 را نجات داد. بنابراین، داده‌های ما نشان می‌دهد که CDP تجمع ROS را سرکوب می‌کند تا بیان NFATc1 را مهار کند، سپس تشکیل و عملکرد استئوکلاست را سرکوب کند.

ERK، JNK و p38 متعلق به خانواده MAPK هستند که در تنظیم تمایز استئوکلاست ها نیز نقش دارند (Seger & Krebs, 1995). RANKL مسیر MAPK را با افزایش فسفوریلاسیون ERK، JNK و p38 فعال می کند (Mizukami et al., 2002). ما آن CDP را نشان دادیم(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)فسفوریلاسیون پروتئین های کلیدی با واسطه RANKL را در مسیر MAPK سرکوب کرد و در نتیجه به اثر مهاری CDP بر بیان ژن های نشانگر استئوکلاست کمک کرد. طبق دانش ما، این اولین مطالعه ای است که اثرات بازدارندگی CDP را نشان می دهد(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)در تولید ROS، NFAT، و فعال سازی MAPK، نشان دهنده مکانیسم های جدید عمل CDP در شرایط آزمایشگاهی است.

به طور خلاصه، ما نشان دادیم که CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)استئوکلاستوژنز و جذب هیدروکسی آپاتیت و بیان ژن های نشانگر استئوکلاست شامل Ctsk، Mmp9 و Acp5 را کاهش می دهد. CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)توانست تولید ROS با واسطه RANKL و همچنین فعال سازی NFAT و MAPK را سرکوب کند (شکل 8). در مجموع، نتایج ما نشان می دهد که CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)ممکن است یک داروی کاندید برای درمان شرایط مرتبط با استئوکلاست همراه با تولید بیش از حد ROS باشد.

شکل 8 نمودار شماتیک CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)عملکرد در تمایز استئوکلاست ها CDP(سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید)تولید ROS ناشی از RANKL و همچنین فعال سازی NFATc1 و MAPK را سرکوب می کند و از این رو استئوکلاستوژنز را مهار می کند. CDP،سیستانچدسرتیکولاپلی ساکارید; MAPK، پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن؛ NFATc1، فاکتور هسته ای سلول T فعال. RANKL، فعال کننده گیرنده لیگاند kB فاکتور هسته ای. ROS، گونه های فعال اکسیژن [شکل رنگی را می توان در wileyonlinelibrary.com مشاهده کرد]

قدردانی

این مطالعه توسط بنیاد علوم طبیعت چین (81572164)، برنامه تحقیق و توسعه فناوری کلید ملی چین (2017YFC1103300)، بنیاد علوم طبیعی استان گوانگشی (2016GXNSFAA380295) و پروژه تحقیقاتی علم و فناوری دانشگاه گوانگشی پشتیبانی شده است. استان (KY2015YB054). همچنین تا حدی توسط پروژه طرح توسعه تحقیقات علمی و فناوری گوانگشی (GKG13349003، 1598013-15)، صندوق زیرساخت تحقیقات پزشکی و سلامت استرالیای غربی، بنیاد آرتریت استرالیا، جوایز همکاری پژوهشی دانشگاه استرالیای غربی (UWA) و شورای تحقیقات بهداشت و پزشکی استرالیا (NHMRC، شماره های 1107828 و 1027932).

تضاد علاقه

نویسندگان اعلام می کنند که هیچ تضاد منافع وجود ندارد

از جانب: 'سیستانچدسرتیکولاپلی ساکاریداستئوکلاستوژنز و تحلیل استخوان را از طریق مهار سیگنالینگ RANKL و تولید گونه های اکسیژن فعال توسط Dezhi Song و همکارانش کاهش می دهد.

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018؛ 233: 9674–9684