نمایه سازی جامع فرمولاسیون های ترشحی از سلول های بنیادی مایع آمنیوتیک انسانی جنینی و پری ناتال قسمت 1

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

خلاصه:قبلاً گزارش دادیم که سلول‌های بنیادی مشتق شده از مایع آمنیوتیک c-KIT به همراه htaman به‌دست‌آمده از نمونه‌های باقی‌مانده از تشخیص معمول قبل از تولد در سه ماهه Ⅱ (hAFS جنینی) دارای پتانسیل پاراکرین احیاکننده هستند که باعث بقا، ضد فیبروتیک و اثرات تکثیری می‌شوند. همچنین ممکن است از نمونه‌های ضایعات بالینی سه ماهه سوم در طول سزارین برنامه‌ریزی‌شده (hAFS پری ناتال) جدا شود، بنابراین در مقایسه با hAFS جنینی، جایگزین آسان‌تری ارائه می‌دهد. با این وجود، اطلاعات کمی در مورد مشخصات پاراکرین hAFS پری ناتال وجود دارد. در اینجا ما توصیف دقیقی از ترشح کل hAFS (یعنی کل فاکتورهای پاراکرین محلول آزاد شده توسط سلول ها در محیط شرطی شده، hAFS-CM) و وزیکول های خارج سلولی ارائه می دهیم. hAFS-EVs) درون آن، از Ⅱسه ماهه جنینی در مقابل سلول های پری ناتال سه ماهه سوم. hAFS جنینی و پری ناتال مشخص شد و در معرض پیش‌شرطی‌سازی هیپوکسیک برای افزایش پتانسیل پاراکرین آنها قرار گرفت. فرمول‌های hAFS-CM و hAFS-EV برای محتوای پروتئین و کموکاین/سیتوکین مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند و محموله EV بیشتر با توالی‌یابی RNA مورد بررسی قرار گرفت. فنوتیپ hAFS جنینی و پری ناتال، همراه با فرمول‌های ترشحی مربوط به آن‌ها، همپوشانی دارند. با این حال، hAFS جنینی فعالیت فسفوریلاسیون اکسیداتیو نابالغ را در مقایسه با آنهایی که در دوران بارداری نشان دادند. پروفایل محموله پاراکرین آنها تفاوت هایی را با توجه به مرحله حاملگی و پیش شرط هیپوکسیک نشان داد. هر دو منبع سلولی فرمول‌های غنی‌شده با عوامل نوروتروفیک، تعدیل‌کننده ایمنی، ضد فیبروتیک و محرک اندوتلیال را ارائه کردند و ترشح hAFS جنین نابالغ با نمایه‌ای برجسته‌تر پروواسکولوژنیک، احیاکننده، حل‌کننده و ضد پیری مشخص شد. پروفایل RNA کوچک، غنی‌سازی microRNA را در محموله hAFS-EV جنینی و پری ناتال، با یک هسته حل‌کننده با بیان پایدار به عنوان امضای مولکولی مرجع نشان داد. در اینجا ما تأیید می کنیم که hAFS منبع جذابی از عوامل پاراکرین احیا کننده است. انتخاب فرمولاسیون ترشحی hAFS جنینی یا پری ناتال برای درمان پاراکرین در آینده باید با توجه به سناریوی بالینی خاص ارزیابی شود.

کلید واژه ها:مایع آمنیوتیک؛ سلولهای بنیادی؛ اثرات پاراکرین؛ وزیکول های خارج سلولی؛ محیط مطبوع سلولی؛ کموکاین؛ سیتوکینها؛ پروتئومیکس; تعیین توالی RNA؛ microRNA

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

1. مقدمه

پزشکی احیا کننده اخیراً به عنوان یک رشته نوظهور برای ارائه ترمیم عملکردی بافت آسیب دیده با استفاده از چندین استراتژی توسعه یافته است. از آنجایی که رویکردهای مهندسی بافت در سال های اخیر به طور قابل توجهی پیشرفت کرده است، بررسی اثرات پاراکرین سلول های بنیادی به طور همزمان به طور فزاینده ای تشدید شده است. پتانسیل درمانی سلول های بنیادی پیوندی به طور گسترده نشان داده شده است که عمدتاً توسط عوامل محلول ترشح شده آنها واسطه می شود، که می تواند یک ریزمحیط احیاکننده را در بافت میزبان تنظیم کند در حالی که باعث فعال شدن مکانیسم های درون زا برای بازیابی عملکردی می شود [1،2]. بنابراین، سلول‌های بنیادی، کل مولکول‌های تغذیه‌ای پاراکرین آزاد شده از سلول، و همچنین وزیکول‌های خارج سلولی متصل به غشاء را ترشح می‌کنند، به‌طور فزاینده‌ای به‌عنوان یک محصول دارویی درمانی نوآورانه توسط مطالعات پیش‌بالینی مستقل متعددی که هدف آن‌های قلبی عروقی، عصبی و/یا التهابی است، پیشنهاد شده‌اند. مرض. بر این اساس، سلول‌های بنیادی را می‌توان به عنوان کارخانه‌های بیولوژیکی برای بهره‌برداری از ترشحات درمانی خود با ارائه درمان‌های بازسازی‌کننده آماده برای استفاده و خارج از قفسه تصور کرد. با به کارگیری چنین استراتژی مبتنی بر سلول و در عین حال بدون سلول، بسیاری از جنبه های محدود کننده مرتبط با سلول درمانی متعارف ممکن است غلبه کنند، در حالی که هنوز اثرات مفیدی را تضمین می کنند.سیستانچ چیستدر این دیدگاه، سلول های استرومایی مزانشیمی (MSC) به طور گسترده به عنوان کاندیدای سلولی احتمالی آزمایش شده اند؟ در واقع، سلول‌های MSC و بنیادی/پیش‌ساز توسط استراتژی‌های پیش‌شرطی‌سازی مختلف مهندسی و/یا تحریک شده‌اند تا ظرفیت بازسازی و پتانسیل ترشحی خود را تقویت کنند [3،4] با علاقه آشکار به ارتباط بیولوژیکی وزیکول‌های خارج سلولی ترشح‌شده‌شان (EVs).

EV ها ذرات نانویی هستند که توسط یک لایه لیپیدی محدود شده و به طور فعال توسط همه انواع سلول ترشح می شوند. خودروهای الکتریکی بسیار کوچک هستند (<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500 نانومتر)؛ آنها به عنوان نقاله های بیولوژیکی حیاتی سیگنال های بین سلولی با تحویل محموله مولکولی خود از یک سلول والدین به یک پاسخ دهنده/هدف عمل می کنند [5،6]. با توجه به اینکه پتانسیل پاراکرینی خاص آنها در اعمال اثرات مفید با سلول های منشأ آنها قابل مقایسه است، سلول های بنیادی EVs به عنوان گزینه های درمانی جذاب در مدل های پیش بالینی بیماری ها، مانند ایسکمی، التهاب، یا آسیب ظاهر شده اند، همانطور که به طور گسترده در [{3] بررسی شده است. }}]. از منظر ترجمه، علاوه بر پتانسیل تعدیل سلولی، امکان سنجی جداسازی و افزایش خود نوسازی جنبه های کلیدی منبع ایده آل EV های درمانی و عوامل محلول هستند. در چنین سناریویی، سلول های بنیادی مزانشیمی جنینی و پری ناتال با توجه به پتانسیل تکثیر، و مشخصات نابالغ رشدی با ویژگی های متوسط ​​بین اجداد جنینی و جنینی بزرگسالان ممکن است گزینه جالبی را ارائه دهند [10،11]. MSC جنین را می توان از ضمیمه های خارج از جنین در طول بارداری به عنوان نمونه برداری باقیمانده در طول غربالگری قبل از تولد (یعنی پرزهای کوریونی [12-14] و مایع آمنیوتیک [15،16]) جدا کرد یا به عنوان پیش ساز پری ناتال در بدو تولد به دست آورد. از مواد زائد بالینی (یعنی غشای آمنیوتیک و جفت [17-21]، اجزای بند ناف [22-24] و اصطلاح مایع آمنیوتیک [25،26]).

سیستانچ می تواند ضد پیری باشد

به طور قابل‌توجهی، سلول‌های بنیادی مایع آمنیوتیک انسانی (hAFS) به عنوان استراتژی‌های درمانی امیدوارکننده در پزشکی احیاکننده برجسته شده‌اند. و نشان داده شده است که به طور گسترده در شرایط آزمایشگاهی و درون تنی چندتوان است [16،27،28]، به دودمان خونساز به دنبال پیوند رحم کمک می کند [29]، و پیوند در اندام های آسیب دیده در حالی که اثرات تعدیل کننده ایمنی را اعمال می کند [26،30] و فعال می کند. پاسخ های ترمیمی درون زا، همانطور که به طور جامع در [31] توضیح داده شده است. تیم ما و سایرین بیشتر نشان داده‌اند که hAFS یک ترشح بسیار غنی شده با مولکول‌های تغذیه‌ای فعال زیستی را آزاد می‌کند که قادر به هدف قرار دادن مکانیسم‌های ترمیمی مختلف هستند. گزارش شده است که فاکتورهای پاراکرین hAFS محرک‌های حامی بقا با فرونشاندن التهاب [32]، محافظت قلبی در برابر ایسکمی طولانی مدت [33.34] و سمیت قلبی [35] و تحریک رگزایی موضعی با ورود مجدد به چرخه سلولی کاردیومیوسیت را فراهم می‌کنند. 34،36]. از آنجایی که نشان داده شده است که بیشتر این اثرات تنها با تجویز hAFS-EV خلاصه می شود، مطالعات مستقل بر روی تشریح مشخصات احیا کننده آنها در برابر زمینه های پاتولوژیک مختلف، از جمله آسیب عضله اسکلتی و قلبی، بیماری کلیوی، استئوآرتریت، پوکی استخوان، انتروکولیت نکروزان و نورودژنراتیو متمرکز شده اند. مدل‌ها [34،{18}}].

در حالی که شواهد ممکن است از ترجمه بالینی hAFS-EVs برای درمان پاراکرین در آینده حمایت کند، مهم است که در نظر بگیریم که اکثر این مطالعات عمدتاً پتانسیل تعدیل‌کننده hAFS جنینی را بررسی کرده‌اند که در طول غربالگری قبل از تولد در سه ماهه Ⅱ به دست آمده است، در واقع، نمایه کامل ترشحات از پری ناتال همتای خود را دارد (یعنی از سه ماهه سوم سزارین) هنوز با جزئیات بررسی نشده است. hAFS پری ناتال سه ماهه سوم خواص تنظیم کننده ایمنی متمایز را در مقایسه با سه ماهه دوم و دوم نشان داده است [26]، در حالی که پتانسیل بازسازی اندوتلیال مربوطه را حفظ می کند [25].چه مقدار سیستانچ مصرف کنیمشایان ذکر است، گزارش اخیر در مورد مورفولوژی ناهمگن hAFS جنینی [45] بینش جدیدی در مورد نمایه بیان ژن و ساقه آنها ارائه کرده است.بیوفلاونوئیدهااین در مجموع نور جدیدی را بر ارزش بازسازی بخش های مختلف سلولی hAFS روشن کرده است[46]. از این رو، توصیف جامع زیرجمعیت های مختلف hAFS توجه فزاینده ای را به خود جلب می کند. قبلاً گزارش دادیم که یک تحریک 24 ساعته هیپوکسیک و بدون سرم نشان‌دهنده یک استراتژی مؤثر برای تقویت پتانسیل پاراکرین hAFS جنین در سه ماهه Ⅱ است [34،35،37]. از آنجایی که اطلاعات کمی در مورد ترکیب سکرتوم از hAFS سه ماهه سوم وجود دارد، در اینجا ما مقایسه جامع hAFS سه ماهه Ⅱ در مقابل Ⅲ و بخش های ترشحی آنها (از جمله کلاه-EVs) را گزارش می کنیم تا تأثیر مرحله بارداری و سلول هایپوکسیک را بررسی کنیم. پیش شرط بر روی ویژگی های سلولی و ترشحی

2. نتایج

2.1. hAFS پری ناتال یک تطابق فنوتیپی نزدیک به جنین ارائه می کند

هیچ تفاوت آماری مرتبطی در سن اهداکننده بین نمونه‌های مایع آمنیوتیک سه ماهه اول جنین و سه ماهه سوم پری ناتال سه ماهه سوم مشاهده نشد. جنین c-KIT* hAFS (f-hAFS از نمونه های مایع آمنیوتیک سه ماهه دوم) و c-KIT* hAFS پری ناتال (p-hAFS از ضایعات بالینی مایع آمنیوتیک سه ماهه سوم) ویژگی های مشابهی را با مورفولوژی فیبروبلاست مانند و بیضی شکل تایید کردند (شکل 1A) و فنوتیپ استرومایی مزانشیمی (داده ها نشان داده نشده است)، همانطور که قبلاً گزارش شده است [16،25]. هر دو f-hAFS و p-hAFS که در شرایط آزمایشگاهی تا پاساژ 5 کشت شدند، سطوح ناچیزی از پیری ناشی از فعال‌سازی گالاکتوزیداز مرتبط با پیری (SA{14}Gal) را در حدود 4 درصد از سلول‌ها نشان دادند (شکل 1B) . هر دو f-hAFS و p-hAFS سطح بالایی از بیان مشترک نشانگرهای مزانشیمی CD107a و CD146 را ارائه کردند، که اخیراً گزارش شده است که یک فنوتیپ بسیار ترشحی را تعریف می کند[47]. سلول‌های CD107at CD146* اکثریت جمعیت f-hAFS را تشکیل می‌دهند (تقریباً 64 درصد، * p<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">

شکل 1. جنین دارای و پری ناتال دارای ارزیابی فنوتیپی هستند. (الف) تصاویری از hAFS جنینی (f-hAFS، پانل چپ) و hAFS پری ناتال (p-hAFS، پانل سمت راست) در شرایط آزمایشگاهی کشت داده شده اند. نوار مقیاس: 200 um. (B) تجزیه و تحلیل نشانگر پیر بتا گالاکتوزیداز (SA{5}}Gal، به رنگ آبی) از طریق رنگ‌آمیزی سیتوشیمی روی f-hAFS و p-hAFS پس از 5 پاساژ در کشت. تصاویر نماینده در پانل سمت چپ، نوار مقیاس: 200 um گزارش شده است. درصد متناظر سلول ها/میدان -Gal-مثبت در نمودار در پانل سمت راست گزارش شده است (f-hAFS:4.12±0.58 درصد و p-hAFS:3.88±2.10 درصد ;p{22}}.1424,n{ {24}} آزمایش).(C)ایمونوفنوتیپ hAFS بیانگر نشانگرهای مزانشیمی CD146 و CD107a. نمودارهای فلوسیتومتری نماینده f-hAFS و p-hAFS (پانل سمت چپ) و مقادیر متناظر به سلول‌های CD107a مثبت مضاعف به همراه CD146 پلاس اشاره کرد. CD107a به علاوه CD146* f-hAFS:63.68±5.82 درصد،*p{38}}.016در مقایسه با باقیماندهg36.32±5.82 درصد f-hAFS (سایر);CD107در CD146 به علاوه p-hAFS:52.07±6.76 درصد باقیمانده 93±56.76 درصد p-hAFS (سایر)؛ CD107a به علاوه CD146 به علاوه f-hAFS در مقابل CD107a به علاوه CD146 به علاوه p-hAFS p{63}}.2403، n=4 آزمایش‌ها. سایر موارد: مقدار کل باقیمانده CD107a-CD146~hAFS,CD107a~CD146*hAFS و CD107at CD{72}}hAFS. همه مقادیر به صورت میانگین ± سم آزمایش‌های مستقل بیان می‌شوند. SA{73}}گال: گالاکتوزیداز مرتبط با پیری{{75}.

2.2. hAFS جنینی متابولیسمی متفاوت از hAFS پری ناتال نشان می دهد

برای ارزیابی اینکه آیا مرحله بارداری ممکن است متابولیسم میتوکندری را تحت تأثیر قرار دهد، f-hAFS و p-hAFS در شرایط استاندارد کشت آزمایشگاهی با تجزیه و تحلیل بیوشیمیایی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. ارزیابی متابولیسم هوازی نشان داد که میزان مصرف اکسیژن (OCR) و سنتز ATP در f-hAFS با توجه به p-hAFS کمتر بود، هر دو در هنگام تحریک با پیروات به علاوه مالات (P/M; ***p<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">

2.3. آماده سازی هیپوکسیک بر روی جنین و پری ناتال تأثیر نمی گذارد و فعالیت ترشحی آنها را حفظ می کند.

به منظور تعریف فرمولاسیون ترشح hAFS، سلول ها در شرایط بدون سرم برای جلوگیری از هرگونه آلودگی از FBS کشت داده شدند. ما قبلاً نشان دادیم که شرایط کشت هیپوکسیک 24 ساعته بدون سرم (SF) و 1 درصد O2 به طور قابل‌توجهی زنده‌مانی hAFS جنینی Ⅱ سه ماهه (f-hope) را تغییر نداد، در حالی که آنها از انتشار فاکتورهای پاراکرین احیاکننده در محیط مطبوع سلولی خود حمایت کردند. (hAFS-CM) و در وزیکول های خارج سلولی (hAFS. EVs) [34،35،37،49]. در اینجا، علاوه بر نمایه سازی فراکسیون های ترشحی p-hAFS برای اولین بار، ارزیابی کردیم که آیا p- رفتار مشابهی را تحت یک رژیم پیش شرطی مشابه با استفاده از شرایط کشت نرموکسیک به عنوان کنترل ارائه کرده است یا خیر. زنده ماندن f-hAFS و p-hAFS پس از 24 ساعت در تنظیمات زیر آنالیز شد: شرایط نرموکسیک (20 درصد O2) در محیط کشت کنترل کامل (Ctrl) (Ctrlf-hAFSnormo و Ctrl p-hAFSnormo)، یک وضعیت نرموکسیک در محیط کشت SF (SF f-hAFSnormo و SF p-hAFSnormo)، شرایط هیپوکسیک (1 درصد O2) در محیط کنترل کامل (Ctrlf-has hypo و Ctrl p-hAFSnypo)، و شرایط هیپوکسیک در محیط SF (SF f-has hypo و SF p -دارای هیپو، شکل 3A). ما تأیید کردیم که زنده ماندن f-has در هر دو شرایط Ctrl و SF و تحت تحریک هیپوکسیک بدون تغییر بود، با بیش از 80 درصد (تا تقریبا 88 درصد) از کل سلول‌ها بی‌تأثیر. سلول های آپوپتوز اولیه و اواخر از حدود. 13 تا 18 درصد در شرایط SF، بدون هیچ ارتباط آماری معنی‌داری. به همین ترتیب، زنده ماندن پری ناتال در محدوده {35}} درصد بود و سلول‌های آپوپتوز زودرس و دیررس تا 18 درصد در شرایط SF را نشان دادند. P-hAFS در حاشیه تنها تحت شرایط هیپوکسیک و SF ترکیبی تحت تاثیر قرار گرفتند. در واقع، در حالی که پیش شرطی کردن بقای سلول را تحت تاثیر قرار نمی دهد زمانی که p-hAFS در یک محیط کامل کشت شد، شرایط SF مربوطه افزایش حدود نشان داد. 4-fold (* p<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">

شکل 2. مشخصات متابولیک جنینی و پری ناتالhAFS. (الف) نرخ مصرف اکسیژن (OCR)، سنتز ATP از طریق F{2}}F.ATP سنتاز، و نسبت P/O در f-have و-have در حضور پیروات به علاوه مالات (P/M) یا سوکسینات (Succ);***p=0.0005,**p=0.0012,****p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>cistanche استرالیامقایسه درصد مهار سنتز OCR و ATP در f-and-hAFS به دلیل مهارکننده های نشان داده شده در بالا در پانل پایین B گزارش شده است. برای آزمایش OCR: hAFS به علاوه Etomoxir**** p<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">

ما سپس بازده بخش‌های ترشحی به‌دست‌آمده از f-hAFS در مقابل p-hAFS را بر اساس غنی‌سازی پروتئین ارزیابی کردیم. کل دارای سکرتوم است، زیرا کل عوامل پاراکرین ترشح شده از سلول، در اینجا با hAFS-CM نشان داده می شود. غلظت پروتئین f-hAFS-CM و p-hAFS-CM در محیط SF به دنبال پیش شرطی سازی سلول هایپوکسیک در مقابل شرایط نرموکسیک کنترل به عنوان پایه (یعنی f-hAFS-CMnormo، f-hAFS-CMNypo، P has-CMnormo، و p -hAFS-CMHypo،) با روش BCA مورد ارزیابی قرار گرفت و به ازای سلول های 10 § اندازه گیری شد.سیستانچنتایج به‌دست‌آمده نشان داد که f-has-CM و p-hAFS-CM روند مثبت یکسانی را در غنی‌سازی پروتئین به دنبال پرایمینگ هیپوکسیک نشان دادند (f-hAFS-CMnypo'166.1{51}±22.13 ug/1{58}} سلول های درجه؛ p-hAFS-CMNypo∶182.30± 29.71 میکروگرم/1{72}} درجه سلول) نسبت به همتایان عادی خود (f-hAFS-CMnormo: 19.89±105.50 ug/10 درجه سلول؛ p- hAFS-CMhypoi 24.39±91.12 ug/10 درجه سلول) به همین ترتیب، غلظت پروتئین سطحی hAFS-EVs در f-have-EVSnormo، f-hAFS-EVShypo، p-hAFS-EVSnormo، و p-hAFS-EVShy اندازه گیری شد. EVها بازده قابل مقایسه ای را نشان دادند که از f-hAFS یا p-hAFS به دست آمد. همانطور که برای فرمولاسیون hAFS-CM، روند مثبت در افزایش محتوای پروتئین در f-hAFS-EVs و p-hAFS. EVs پس از تحریک هیپوکسیک بیش از شرایط نرموکسیک متناظر (f-hAFS-EVSHypo∶2.03±0.67 ug/10 سلول و p-hAFS-EVSHypo∶ 0.47±1.85 ug/10 درجه سلول؛ f-have-EVsnormo∶1.28±0.36ug/10 درجه سلول -hAFS-EVsnormo∶1.19±0.31 ug/10 درجه سلول، شکل 3C).

2.4. EVهای رهاسازی hAFS جنینی و پری ناتال با مورفولوژی مشابه و توزیع اندازه

تجزیه و تحلیل مورفولوژیکی توسط میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) رشد ترشحی EV بالای هر دو f-hAFS و p-hAFS را افزایش داد (شکل 4). ما اندازه و مساحت f-hAFS-EVs و p-hAFS-EVs (شکل 4B) را به دنبال پیش شرطی سازی هیپوکسیک در مقایسه با پایه نرموکسیک بررسی کردیم. جنینی و پری ناتال EV های ناهمگن را در اندازه 40-250 نانومتر آزاد کرده اند، بنابراین شامل هر دو اگزوزوم/EVs کوچک و میکرووزیکول/وزیکول های در حال ریزش است. اندازه متوسط ​​EVs/میدان در گروه‌های مختلف قابل مقایسه بود، hAFS-EVs جنین 90-100 نانومتر اندازه‌گیری شد (f-hAFS-EVsnormo:104.00 ±3.00 nm;f. -have-EVSHvpo:97.10±10.10 نانومتر)و پری ناتال با اندازه‌گیری 70-114 نانومتر (p-hAFS-EVsnormo:94.60±19.53 نانومتر؛ p-hAFS-EVShypo: 4±76.43.{37}} nm 4B، پانل سمت چپ). در مورد بازده، hAFS تحریک شده تحت هیپوکسی روند مثبتی را در افزایش مقدار EV های کوچک نشان داد، اگرچه این افزایش از نظر آماری معنی دار نبود. f-hAFS-EVStypo 40-70 نانومتر اندازه‌گیری شد که تقریباً دو برابر بیشتر از همتای نرموکسیک آنها بود. Perinatal-has-EVSHypo که 40-70 نانومتر،70-100 نانومتر و 100-130 نانومتر اندازه‌گیری شد تقریباً سه برابر مقدار به‌دست‌آمده در کشت نرموکسیک بود (شکل 4B).

تجزیه و تحلیل ردیابی نانوذرات (NTA) تعداد بالایی از ذرات را در هر دو آماده‌سازی f-hAFS-EV و p-hAFS-EV نشان داد و افزایش EVs را در نمونه‌های هیپوکسیک تأیید کرد، همانطور که از آنالیزهای قبلی نیز مشاهده شد (f-hAFS- EVsnormo:182±0.10'partiles/10 سلول درجه؛ f-have-EVshypo: 3.30±0.22×10 درجه ذرات/10 درجه سلول ;p-hAFS-EVsnormo: ذرات 0.80×2.43±2.43 درجه/سلول های 10 درجه؛ p-hAFS-EVshypo: ذرات 0.62×3.05±10 درجه / سلول های 10 درجه، شکل 4C).

شکل 4. مشخصات مورفولوژیکی EVهای جنینی و پری ناتال. (الف) تصاویری از میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) f-hAFS و p-hAFS (به ترتیب پانل سمت چپ بالا و پایین، با فلش‌های سیاه که اجسام چند وزیکولی داخل سیتوپلاسمی را نشان می‌دهند با EVs/اگزوزوم‌های کوچک درون آنها)، و f -hAFS-EV و p-hAFS-EVs (به ترتیب پانل سمت راست بالا و پایین) در شرایط بدون سرم و تحت پیش شرطی نرموکسیک در مقابل هیپوکسیک (f-hAFS-EVSnormo؛ f-have-EVSHypoi p-hAFS-EVSnormo؛ و f-hAFS-EVshypo، به ترتیب)، میله های مقیاس: 200 نانومتر. (ب) پانل سمت چپ: تجزیه و تحلیل TEM توزیع اندازه hAFS-EVs. پانل سمت راست: توزیع تعداد f-hAFS-EV و p-hAFS-EVs در فواصل اندازه میدان از 40 نانومتر تا 250 نانومتر در نظر گرفته شد. مقادیر به صورت میانگین±معادل n{27}} آزمایش مستقل بیان می‌شوند. (C) تجزیه و تحلیل ردیابی نانوذرات برای اندازه و توزیع hAFS. پانل سمت چپ: تصویر نماینده خروجی گرافیکی. پانل سمت راست: غلظت hAFS-EVs به عنوان ذرات 10 درجه در هر سلول ترشح کننده 10 درجه اندازه گیری شد. نانومتر: نانومتر؛ میلی لیتر: میلی لیتر

2.5. خصوصیات پروتئومی جنین در مقابل hAFS پری ناتال تفاوت در ترکیب ترشحی آنها را بر اساس سن حاملگی و پیش شرط هیپوکسیک برجسته می کند.

خصوصیات پروتئومی هر دو فرمول سکرتوم f-hAFS و p-hAFS با استفاده از یک پلت فرم بدون برچسب تفنگ ساچمه ای، بر اساس جفت کروماتوگرافی مایع نانو و طیف سنجی جرمی با وضوح بالا (nLC-HRMS) انجام شد. چهل و هشت پروفایل پروتئومی با تجزیه و تحلیل تکراری سه تکرار بیولوژیکی hAFS-CM و have-EVs از f-hAFS و p-hAFS که تحت پیش‌شرط سلولی هیپوکسیک در مقایسه با شرایط عادی به عنوان یک کنترل قرار داشتند، به دست آمد. در مجموع 4179 گروه پروتئینی متمایز با حداقل یک پپتید منحصر به فرد و با وزن مولکولی از 2 تا 3900 کیلو دالتون و نقاط ایزوالکتریک از 3.6 تا 13 شناسایی شدند. میانگین بیان پروتئین بالاتر در hAFS-EVs در مقایسه با hAFS-CM مشاهده شد. . تراز همه لیست های پروتئین به دست آمده بر اساس پروتئین های شناسایی شده انجام شد. برای هر شرایط آزمایشی، یک لیست منحصر به فرد ایجاد شد که به طور عادی و میانگین [50] مقادیر تطابق طیف پپتیدی (PSMs) نسبت داده شده به پروتئین ها را نشان می دهد، که تعداد طیف های جرمی اختصاص داده شده به هر یک را نشان می دهد و به طور غیرمستقیم فراوانی آنها را در نمونه ها نشان می دهد. لیست کامل پروتئین های شناسایی شده در فرمولاسیون hAFS-CM و have-EV در جدول S1 گزارش شده است.

استفاده از تجزیه و تحلیل تفکیک خطی (LDA[51]) در این فهرست اصلی امکان استخراج پروتئین های آماری معنی دار (نسبت بزرگتر یا مساوی 4.5 و ** p<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">1 در فرمولاسیون hAFS-CM و have-EV به طور جداگانه در نظر گرفته شده است. در حالی که حدود 69.5 درصد و 69.9 درصد از پروتئین ها به ترتیب در شرایط hAFS-EV و hAFS-CM مشترک بودند، محتوای باقیمانده در نسبت های مختلف، از 3.7 درصد تا 13.4 درصد، در بین فرمولاسیون ها منحصر به فرد ظاهر شد.

برای بررسی کمی تغییرات پروتئومی، یک آنالیز دیفرانسیل بدون برچسب با استفاده از نرم افزار خانگی MAProMa و به کارگیری دو الگوریتم DAve (میانگین دیفرانسیل) و DCI (شاخص اطمینان دیفرانسیل که نشان دهنده نسبت و اطمینان در بیان دیفرانسیل است، انجام شد. به ترتیب)، روی PSMهای هر پروتئین منفرد بین دو عبارت مقایسه شده. با استفاده از فیلترهای سختگیرانه برای DAve و DCI برای به حداکثر رساندن اطمینان شناسایی و در نظر گرفتن پروتئین‌هایی با تغییر بیشتر از یک تغییر برابری 1.5، مقایسه‌های جفتی f-hAFS-CM در مقابل p-hAFS-CM و f-hAFS-EVs در مقابل p-hAFS-EVs بر اساس مرحله حاملگی سلولی ساخته شدند. در مجموع 58 و 109 پروتئین به‌ترتیب در بخش‌های has-CM و have-EV به طور متفاوت بیان شده‌اند (شکل S1B، C برای جزئیات انتخاب‌شده و جداول S{17}}S3 به شکل توسعه‌یافته). در این میان، 30 پروتئین در f-hAFS-CM و 28 پروتئین در p-hAFS-CM تنظیم شده بودند (شکل S1B). به همین ترتیب، 44 پروتئین متمایز منجر به تنظیم مثبت در f-have-EVs و 65 پروتئین در p-hAFS-EVs تنظیم مثبت شدند (شکل S1C). مشخصاً، پروتئین‌هایی که منجر به تنظیم بالا در f-have می‌شوند باید در p-has با تنظیم پایین در نظر گرفته شوند و بالعکس.

مقادیر گزارش شده است. جدول S2 را برای فهرست کامل و پارامترهای دقیق پروتئین های گزارش شده ببینید. (C) تجزیه و تحلیل غنی‌سازی فرآیندهای بیولوژیکی پروتئین‌های شناسایی شده با فرکانس حداقل 2 در hAFS-CM جنینی (پانل سمت چپ) و دارای-CM پری ناتال (پانل سمت راست) با توجه به پیش‌شرطی کردن هیپوکسیک سلولی. بر اساس ابزار FunRich، اصطلاحات هستی شناسی ژن در نمودارهای میله ای نشان داده شده است که درصد ژن های غنی شده را برای هر دسته گزارش می دهد (نوارهای صورتی برای-have-CMnormo، نوارهای بنفش برای f-hAFS-CMhypor نوارهای آبی روشن برای p-hAFS-CMnormo، و توپ های آبی برای p-hAFS-CMhypo).سیستانچ بخرفقط اصطلاحات هستی شناسی ژن با بونفرونی تصحیح شده با *p<0.05 are="">

این مقاله از Int استخراج شده است. جی. مول. علمی 2021، 22، 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms