چگونه گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید، ماده فعال سیستانچ، نقش محافظت کننده عصبی ایفا می کنند؟

Xue Gong†a، Yan Xu†b، Kai Renc، Xiaorong Baid، Chunhong Zhanga

چکیدهدر این مطالعه هشت مورد را جدا کردیمفنیل اتانوئیدگلیکوزیدهااز Paraboea martini برای اولین بار و مکانیسم زیربنایی آنها را ارزیابی کردمحافظ عصبیاثراتدر برابر آسیب ناشی از H2O2- در سلولهای PC12. برای غربالگری از روش MTS استفاده شدفنیل اتانوئیدگلیکوزیدهابرای توانایی محافظتی سپس برای تشخیص سطوح رونویسی HO{1}} و GCLC که توسط Nrf2 تنظیم می‌شوند، از qRT-PCR و آنالیز وسترن بلات استفاده شد. از بازدارنده ZnPP برای تجزیه و تحلیل دخالت Nrf2 در بیان HO استفاده شد. آنالیزها نشان داد که کالئولاریوزید B، پارابوزید B و پارابوزید II نیز بیان HO{5}} را افزایش دادند، اما هیچ اثر آشکاری بر GCLC نشان ندادند. پیش تیمار با ZnPP به طور قابل توجهی کاهش یافتمحافظ عصبیاثرات. بنابراین، گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید جدا شده از P. مارتینی، سلول‌های PC12 را در برابر آسیب ناشی از H2O با تنظیم مثبت HO-1 محافظت کردند. نتایج شواهدی را ارائه داد که P. مارتینی ممکن است یک عامل درمانی بالقوه برای درمان باشدنورودژنراتیوبیماری ها.

تاریخچه مقالهدریافت 8 آوریل 2019 پذیرش 30 جولای 2019

کلید واژه هاپارابوا مارتینی؛گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی; اثرات محافظت کننده عصبی؛ پروتوپورفیرین روی؛ هو-1

مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

مکانیسم اثر محافظت کننده عصبی سیستانش دسرتیکولا، برای اطلاعات بیشتر اینجا را کلیک کنید

استرس اکسیداتیو نقش اساسی در پاتوژنز چندین بیماری دارد. با علت شناسی مرتبط استبیماری آلزایمر(AD)، بیماری پارکینسون (PD)، صرع، و سایر بیماری ها [1-3]. در حال حاضر، پیشرفت مداوم در مطالعه پاتوژنز AD، PD و سایر بیماری ها انجام شده است. با این حال، به دلیل دانش محدود از مکانیسم‌های مولکولی زیربنای AD، PD، و سایر بیماری‌ها، استراتژی‌های پیشگیرانه یا درمانی مؤثر برای این بیماری‌ها محقق نشده است [4]. H2O2 یک جزء مهم از گونه های اکسیژن فعال (ROS) است. بر این اساس، آسیب سلولی PC12 ناشی از H2O رایج ترین مدل مورد استفاده استرس اکسیداتیو است و به طور گسترده در مطالعات تجربی اثرات محافظت کننده عصبی استفاده می شود [5]. هم اکسیژناز 1 (HO{10}}) و زیرواحد کاتالیزوری لیگاز-گلوتامات سیستئین (GCLC) آنزیم های آنتی اکسیدانی سلولی مهمی هستند و هر دو ژن در پایین دست فاکتور هسته ای اریتروئید 2 (Nrf2) تنظیم می شوند که به عنوان یک درمان امیدوارکننده در حال ظهور است. هدف برای محافظت عصبی [6،7].فنیل اتانوئیدگلیکوزیدها، مشتق شده از واحد C-6-C-3، حاوی بسیاری از گروه های هیدروکسیل فنلی است و فعالیت های آنتی اکسیدانی و ضد پیری قابل توجهی دارد. در چند سال گذشته، مطالعات نشان داده اند که بسیاری از گیاهان دارویی حاوی گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی هستند که فعالیت آنتی اکسیدانی قابل توجهی از خود نشان می دهند. به عنوان مثال، گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید مشتق شده از Herba cistanche شناخته شده است که اثرات محافظتی بر نقص های شناختی در AD اعمال می کند. آن مطالعه مکانیسم حفاظتی مرتبط را با استفاده از مدل موش مستعد 8 (SAMP8) با تسریع پیری AD بررسی کرد. نتایج نشان داد که توانایی گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید برای بهبود نقایص شناختی در موش‌های SAMP8 ممکن است با ارتقای شکل‌پذیری سیناپسی شامل فرآیندهای آنتی‌اکسیدانی مرتبط باشد [8]. در این مطالعه، دو گلیکوزید فنیل اتانوئیدی از گره های چوب Tectona grandis (جعبه) جدا و خالص شدند. این ترکیبات اثرات آنتی اکسیدانی قابل توجهی را نشان دادند که با استفاده از روش آمپرومتریک تعیین شد [9]. علاوه بر این، ترکیبات گلیکوزید فنیل اتانوئید کافئویل از Lindernia ruellioides اثرات آنتی اکسیدانی وابسته به دوز و مهارکننده رادیکال آزاد آنیون سوپراکسید را در شرایط آزمایشگاهی اعمال می کنند [10]. مکانیسم های اثر گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید به تنظیم مسیر سیگنالینگ Nrf2/ARE مربوط می شود که بر سنتز SOD، CAT، GSH-PX و سایر آنزیم های آنتی اکسیدانی تأثیر می گذارد [11]. خانواده Gesneriaceae که شامل 150 جنس و تقریباً 3700 گونه است، عمدتاً در مناطق گرمسیری و معتدل آسیای شرقی و جنوبی، اقیانوسیه، آمریکای جنوبی، آفریقا، اروپای جنوبی و مکزیک پراکنده شده است [12]. 54 جنس و تقریباً 463 گونه متعلق به Gesneriaceae در چین وجود دارد. گزارش شده است که تقریباً 100 گونه دارای اثربخشی پزشکی هستند و بیشتر آنها عمدتاً در استان های گوانگشی و گوئیژو توزیع شده اند [13]. در سال های اخیر، تحقیقات روی گیاهان Gesneriaceae به تدریج در مناطق مختلف جهان افزایش یافته است و برخی از ترکیبات جدید با فعالیت های فیزیولوژیکی پیدا شده است [14]. Paraboea martinii (Levl.) Burtt متعلق به Parabola (Gesneriaceae) و گیاهی علفی است. بر اساس "سوابق منابع طب سنتی چین"، ثبت شد که از کل گیاه به عنوان دارو استفاده می شود. علاوه بر این، می تواند بسیاری از فعالیت های دارویی را در شرایطی مانند هماتمز، ادم، اسهال خونی، آسیب تروماتیک و شکستگی اعمال کند [15]. بای این را ثابت کردفنیل اتانوئیدگلیکوزیدهایکی از ترکیبات شیمیایی اصلی گیاهان Gesneriaceae هستند [16]. برخی از محققان نیز دریافته اندفنیل اتانوئیدگلیکوزیدهاhave significant antioxidant activities [17]. Li demonstrated that phenylethanoid glycosides of Cistanche deserticola have significant antioxidant activity [18]. In addition, Ju systematically studied the neuroprotective activities of phenylethanoid glycosides using PC12 cell models. The results indicated that phenylethanoid glycosides significantly attenuate the damage induced by Aβ1-42 [19]. In our studies, we isolated eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) from P. martini [20]. All compounds were isolated from the genus Parabola for the first time, and the compounds paraboside A, paraboside B, p paraboside I, paraboside II, and paraboside III were new compounds [20]. In a continuing search for molecules with antioxidant properties, phenylpropanoid glycosides were examined. However, whether these phenylpropanoid glycosides from P. martini could protect against H2O2-induced PC12 cell injury was previously unclear. In this study, we examined the protective effects of phenylpropanoid glycosides on H2O2-induced damage to PC12 cells. We also examined the effects and preliminary mechanism underlying the activity of phenylpropanoid glycosides with respect to the activation of HO-1 and GCLC in vitro. Materials and methods Materials Paraboea martini (Level.) Burtt was collected from Daxin County, Guangxi Autonomous Region in August 2014 and verified by Dr. Minhui Li (Baotou Medical College). Voucher specimens were deposited at the Laboratory of Pharmacognosy and Phytochemistry. Eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) were extracted and separated from P. martinii (Levl.) Burtt by prof. Xiaoqin Wang [20]. The purity (>98 درصد از هشت گلیکوزید فنیل پروپانوئید با روش نرمال‌سازی پیک ناحیه HPLC اندازه‌گیری شد. به عنوان مثال، نمودارهای کروماتوگرافی پارابوزید B و پارابوزید II در شکل 1 نشان داده شده است و محتوای نسبی آنها به ترتیب 98.23 درصد و 99.20 درصد است. رده سلولی فئوکروموسیتوم آدرنال موش صحرایی با تمایز ضعیف (PC12) از بانک سلولی در آکادمی علوم چین (شانگهای، چین) خریداری شد. محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM) و سرم اسب از Gibco (Gaithersburg، MD، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. سرم جنین گاوی (FBS) از Thermo Fisher Scientific (Hyclone, Waltham, MA, USA) خریداری شد. H2O2 از Tianjin Fu Yu Reagent Co., Ltd. (تیانجین، چین) به دست آمد. Trizol از Invitrogen (Carlsbad، CA، USA) خریداری شد. کیت معرف PrimeScriptTM RT (Perfect Real Time) از شرکت بیوتکنولوژی TaKaRa (دالیان، چین) تهیه شد. آغازگرهای HO{10}}، GCLC، و GAPDH توسط Sangon Biotech (شانگهای، چین) سنتز شدند. کیت سنجش تکثیر سلولی یک محلول آبی CellTiter 96® (MTS) از Promega Corp. (مدیسون، ایالات متحده آمریکا) تهیه شد. مهارکننده‌های HO{12}} روی پروتوپورفیرین (ZnPP) از شرکت شیمیایی سیگما (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. همچنین از یک انکوباتور Thermo311 CO2 (Thermo، ایالات متحده)، StepOnePlusTM Real-Time PCR Thermal Cycling Block (Thermo)، Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo)، و xCELLigence RTCA DPlus Analyzer و E-Plate 16 (ACEA Biosciences) استفاده شد. .

کشت و درمان سلولی

سلول های PC12 در DMEM حاوی 5 درصد FBS و 5 درصد سرم اسب در دمای 37 درجه در اتمسفر 5 درصد CO2 مرطوب شده رشد داده شدند. سلول های PC12 به سه گروه به شرح زیر تقسیم شدند: یک گروه کنترل، یک گروه مدل و یک گروه درمان. هشت گلیکوزید فنیل پروپانوئید در DMSO حل شدند.< 0.01%)="" and="" then="" diluted="" with="" a="" complete="" culture="" medium.="" to="" study="" the="" effects="" of="" the="" eight="" phenylpropanoid="" glycosides="" on="" h2="" o2-induced="" cell="" injury,="" pc12="" cells="" were="" cultured="" with="" the="" eight="" compounds="" at="" concentrations="" of="" 3.125,="" 6.25,="" 12.5,="" 25,="" and="" 50="" μm="" for="" 12="">

تعیین H2O2

مدل، ما غلظت مناسب H2 O2 را با استفاده از آنالیز سلولی بلادرنگ (RTCA) تعیین کردیم. سلول های PC12 در میکروپلیت{5}} CIM-plate با حجم 100 میکرولیتر کاشته شدند و سپس به مدت 12 ساعت در دمای 37 درجه در اتمسفر 5 درصد CO2 انکوبه شدند. سلول های PC12 به دو گروه کنترل و مدل تقسیم شدند. سپس، 10 میکرولیتر H2O2 (50، 100، 200 و 400 میکرومولار) به گروه‌های مدل اضافه شد و گروه‌های کنترل با 10 میکرولیتر DMEM کامل، در سه چاهک پیچیده تیمار شدند. E-Plate 16 در xCELLigence RTCA قرار داده شد، هر 15 دقیقه نظارت شد و نتایج به مدت 32 ساعت ثبت شد. اثر H2O2 بر سلول‌های PC12 با استفاده از نرم‌افزار تحلیل داده‌های xCELLigence RTCA مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. مقدار شاخص سلولی (CI) برای تعیین غلظت بهینه H2O2 و مدت زمان اثر استفاده شد.

استخراج و جداسازی ترکیب

کسری بر اساس قطب خود را با استفاده از روش های قبلا شرح داده شده جدا شد. P. martinii پودر شده در هوا (4 کیلوگرم) به طور متوالی سه بار با محلول اتانول آبی 75 درصد استخراج شد [2{11}}]. سپس عصاره های به دست آمده با استفاده از اواپراتور چرخشی برای حذف اتانول تغلیظ شده و عصاره خام بدست آمد. نمونه ها در آب دیونیزه حل شده و سپس به صورت متوالی با پترولیوم اتر، اتیل استات، n-بوتانول و آب استخراج شدند. عصاره n-بوتانول (4{31}}{38}} گرم) با استفاده از ستون رزین ماکرو متخلخل AB-8 و محلول اتانول-H2O2 (0، 1{47}) تکه تکه شد. }، 30، 50، 70 و 95 درصد). شش کسری (کسری 1-6) در نهایت به دست آمد. فراکسیون های 3 و 4 با استفاده از یک ستون MCI با گرادیان گامی MeOH-H2O2 (100-10 درصد) در معرض جداسازی قرار گرفتند. سپس محصولات با استفاده از سفادکس LH{27}} با 50 درصد MeOH به عنوان شوینده جداسازی شدند. ترکیبات 1 (41.0 میلی گرم) و 6 (15.6 میلی گرم) از کسر 3 جدا شد. ترکیبات 2 (62.0 میلی گرم)، 3 (34.7 میلی گرم)، 7 (11.0 میلی گرم) و 8 (26.0 میلی گرم) از بخش 4 با استفاده از Sephadex به دست آمد. کروماتوگرافی LH{49}} با 50 درصد MeOH به عنوان شوینده. جداسازی نهایی توسط HPLC نیمه آماده فاز معکوس (Merck LiChrosorb, RP{53}}, RP{54}}, 250 × 10 mm) با 50 درصد MeOH و آشکارسازی UV در 280 نانومتر انجام شد تا ترکیبات 4 حاصل شود. (39.0 میلی گرم) و 5 (9.0 میلی گرم) [20].

سنجش بقای سلولی

سلول‌های PC12 در 96-صفحه‌های چاهک با تراکم 2 × 1{{10}}4 سلول در چاهک در حجم نهایی 100 میکرولیتر کاشته شدند. . سلول های PC12 در دمای 37 درجه با 5 درصد CO2 به مدت 12 ساعت انکوبه شدند. سپس سلول ها با غلظت های مختلف عصاره خام ({18}}.025، 0.05، 0.1، 0.2، و 0.4 میلی گرم در میلی لیتر) و ترکیبات 1، 2، 3، 4، 5، 6، 7 و 8 در پنج غلظت (3.125، 6.25، 12.5، 25، و 50 میکرومولار). پس از 24 ساعت پیش تیمار، زنده ماندن سلول ها با روش MTS تعیین شد. سلول های PC12 با یا بدون مهارکننده HO{38}} بدون ZnPP (15 میکرومولار) به مدت 30 دقیقه پیش انکوبه شدند، سپس با یا بدون کالئولاریوزید B، پارابوزید B و پارابوزید II (3.125 میکرومولار) به مدت 12 ساعت انکوبه شدند و در نهایت انکوبه شدند. با 400 میکرومولار H2O2 برای 6 ساعت دیگر. پس از درمان، تعداد سلول‌های زنده‌مانده با روش MTS تعیین شد [6].

اثرات محافظتی عصاره های خام و ترکیبات مونومر بر روی سلول های PC12 تیمار شده با H2O{1}}

سلول ها در یک {{0}}صفحه چاهک در حجم نهایی 100 میکرولیتر کشت داده شدند. رقت‌های سریالی عصاره‌های خام ({8}}. 25، 0.05، 0.1، 0.2 و 0.4 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) به گروه تیمار اضافه شد. پس از 12 ساعت پیش تیمار، 400 میکرومولار محلول H2O2 (غلظت بهینه) به گروه تیمار شده و گروه H2O2 هر چاهک به مدت 6 ساعت اضافه شد. سپس محلول MTS به هر چاهک اضافه شد و صفحات به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. صفحات با سرعت کم به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق نوسان شدند تا تمام بلورها به طور کامل حل شوند. حفاظت سلولی بر اساس نتایج سنجش MTS مطابق با 2204 X. GONG ET AL سازنده تعیین شد. دانلود شده از https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145 توسط مهمان در دستورالعمل 27 اوت 2021. چگالی نوری در طول موج جذب 490 نانومتر تعیین شد. ما بیشتر فعالیت ترکیبات 1، 2، 3، 4، 5، 6، 7 و 8 جدا شده از کسرهای 3 و 4 را دنبال کردیم. رقت های سریالی ترکیبات 1، 2، 3، 4، 5، 6، 7 و 8 (3.125، 6.25، 12.5، 25 و 50 میکرومولار) به گروه تیمار شده اضافه شد تا اثرات محافظتی مربوطه آنها بر روی سلول های PC12 القایی H2O{57}}تعیین شود.

PCR کمی در زمان واقعی (qRT-PCR)

سلول های PC12 در 12 ساعت پس از تیمار با 3.125 میکرومولار کالئولاریوساید B، پارابوزید B و پارابوزید II برداشت شدند. RNA کل با استفاده از معرف TRIZol استخراج شد و مقدار کمی از RNA کل طبق دستورالعمل سازنده با استفاده از کیت Master RT Primescript رونویسی معکوس شد. آغازگرهای زیر برای آزمایش‌ها مطابق با گزارش قبلی [21] استفاده شدند. HO-1: جلو 5′ -GC CTGCTAGCCTGGTTCAAG-3′، معکوس 5′ -AGC GGTGTCTGGGATGAACTA-3′; GCLC: جلو 5′ - GTCCTCAGGTGACATTCCAAGC-3′، معکوس 5′ -TG TTCTTCAGGGGCTCCAGTC-3′; GAPDH: جلو 5′-AAGCTGGTCATCAACGGGAAAC-3′، معکوس 5′- GAAGACGCCAGTAGACTCCACG-3′. مقدار کمی از cDNA های به دست آمده توسط PCR تکثیر شد. شرایط واکنش به شرح زیر بود: دناتوراسیون اولیه در 95 درجه (30 ثانیه)، به دنبال آن 40 چرخه در 95 درجه (5 ثانیه)، 60 درجه (34 ثانیه)، و 72 درجه (35 ثانیه). همه پرایمرها مورد آزمایش قرار گرفتند و سیگنال فلورسنت FL شناسایی شد. سپس مقدار △Ct محاسبه شد و مقادیر نسبی با مقادیر نسبی گروه کنترل با استفاده از معادله زیر مقایسه شد: △Ct=Ct (نمونه) − Ct (کنترل درون زا)، △△Ct } △Ct (نمونه) −△Ct (درمان نشده)، and fold change=2−△△Ct. گلیسرآلدئید{38}فسفات دهیدروژناز (GAPDH) به عنوان کنترل داخلی استفاده شد.

استخراج پروتئین

سلول‌های PC12 روی ظروف 100- میلی‌متری در 107 × 1 سلول در ظرف کاشته شدند. پس از اتصال، سلول ها به ترتیب با caleolarioside B، paraboside B و paraboside II (3.125 میکرومولار) به مدت 12 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. سپس گلیکوزیدها برداشته شدند و سلول ها با H2O2 به مدت 6 ساعت دیگر انکوبه شدند. پس از انکوباسیون، سلول ها دو بار با PBS سرد شسته و با 1 میلی لیتر PBS از ظروف خراش داده شدند. هموژن های سلولی با سرعت 1500 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند. پس از درمان، پروتئین های سلولی با استفاده از بافر لیز سلولی Beyotime RIPA با 1 میلی مولار PMSF مطابق دستورالعمل سازنده استخراج شدند. علاوه بر این، پروتئین‌های سیتوپلاسمی و هسته‌ای همانطور که در پروتکل کیت استخراج هسته‌ای و سیتوپلاسمی Beyotime توضیح داده شد، جدا شدند. غلظت پروتئین نمونه ها با استفاده از کیت سنجش پروتئین Beyotime BCA شناسایی شد و همه نمونه ها در دمای 80- درجه برای تجزیه و تحلیل وسترن بلات نگهداری شدند [6].

تجزیه و تحلیل وسترن بلات

الکتروفورز SDS-PAGE پس از استخراج و دناتوره کردن پروتئین کل از گروه‌های مختلف انجام شد. پس از الکتروفورز، پروتئین به غشاهای PVDF منتقل شد و سپس با پودر شیر بدون چربی 5 درصد به مدت 4 ساعت مسدود شد. پس از شستشو، آنتی بادی اولیه (آنتی بادی پلی کلونال خرگوش GAPDH (رقت 1:10،{5}})، آنتی بادی پلی کلونال خرگوش HO{6}} (رقت 1:1000)، یا آنتی بادی پلی کلونال خرگوش GCLC (رقت 1:1000) به غشاها اضافه شد که یک شب در دمای 4 درجه انکوبه شدند.روز بعد غشاهای PVDF سه بار در TTBS شسته شدند سپس آنتی بادی ثانویه (IgG بز خالص میل ترکیبی ضد خرگوش (رقت 1:1000) با برچسب ترب کوهی پراکسیداز به غشاها اضافه شد، که سپس در دمای اتاق به مدت 2 ساعت انکوبه شدند.غشاهای PVDF شسته شدند و در معرض معرف تشخیص نورتابی شیمیایی ECL برای قرار گرفتن در معرض سیگنال در فیلم اشعه ایکس قرار گرفتند، که سپس ثابت و اسکن شد [22].

تحلیل آماری

داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار SPSS 19 تجزیه و تحلیل شدند و نتایج به‌عنوان میانگین با انحراف معیار (SD) سه آزمایش مستقل ارائه شد. مقادیر p < 0.05="" برای="" نشان="" دادن="" تفاوت="" های="" آماری="" معنی="" دار="" در="" نظر="" گرفته="">

نتایج استقرار مدل H2O2

همانطور که در شکل 2 نشان داده شده است، H2O2 در 50، 100 و 200 میکرومولار سطح مناسبی از مرگ سلولی را ایجاد نکرد. با این حال، 400 میکرومولار H2O2 روی سلول‌های PC12 در عرض 2 تا 6 ساعت عمل کرد و آسیب اکسیداتیو به سلول‌ها تمایل به پایداری داشت. بنابراین، ما در نظر گرفتیم که القاء با H2O2 در غلظت 400 میکرومولار به مدت 6 ساعت برای تقلید آسیب ناشی از استرس اکسیداتیو به سلول‌های PC12 مناسب است.

اثرات محافظتی عصاره های خام بر روی سلول های PC12 تیمار شده با H2O2

در مقایسه با گروه مدل H2O2 (شکل 3)، عصاره n-بوتانول در غلظت های 0.05، 0.1، {{10} }.2 و 0.4. mg/ml بطور قابل توجهی آسیب اکسیداتیو به سلولهای PC12 ناشی از H2O2 (p < 0.05)="" را="" به="" روشی="" وابسته="" به="" غلظت="" بهبود="" دادند.="" این="" داده="" ها="" نشان="" می="" دهد="" که="" بخش="" n-بوتانول="" حاوی="" فعالیت="" محافظتی="" قوی="" تری="" است.="" با="" این="" حال،="" عصاره‌های="" پترولیوم="" اتر="" و="" اتیل="" استات="" فقط="" در="" غلظت‌های="" بالا="" فعالیت="" محافظتی="" نشان="" دادند="" (اتر="" نفت:="" 0.1="" and="" 0.2="" mg/ml,="" p=""><{29}}.{31} 5؛="" اتیل="" استات:="" 0.2="" و="" 0.4="" میلی="" گرم="" در="" میلی="" لیتر،="" p=""><0.05). علاوه="" بر="" این،="" غلظت‌های="" مختلف="" عصاره‌های="" فاز="" آبی="" هیچ="" اثر="" محافظتی="" نشان="" نداد="" (05/0p="">). علاوه بر این، ما داده‌هایی از یک مطالعه اعتبار سنجی با استفاده از رده‌های سلولی نوروبلاستوم انسانی SH-SY5Y (SH-SY5Y) در فایل تکمیلی اضافه کرده‌ایم. درمان با 250 میکرومولار H2O2 منجر به کاهش زنده ماندن سلول شد. با این حال، درمان caleolarioside B، paraboside B، و paraboside II (3.125، 6.25، 12.5، 25، و 50 میکرومولار) به طور قابل توجهی مرگ سلولی SH-SY5Y را کاهش داد. نتایج آزمایش ثابت کرد که caleolarioside B، paraboside B و paraboside II از سلول های SHSY5Y در برابر آسیب سلولی ناشی از H2O محافظت می کنند.

ساختار ترکیبات جدا شده از کسر n-بوتانول

برای تأیید اینکه عصاره n-بوتانول حاوی اجزای فعال است، هشت ترکیب را از استخراج بیشتر تقسیم کردیم. ساختار ترکیبات 1، 2، 3، 4، 5، 6، 7 و 8 با داده های طیفی مختلف (1 H-NMR، 13C-NMR و ESI-MS) بر اساس مقایسه با داده های منتشر شده برای پارابوزید A شناسایی شد. پارابوزید B، پارابوزید I، پارابوزید II، پارابوزید III، نوومیوزید A، کالئولاریوزید B، و ایزونوومیوزید A به ترتیب [20]. به عنوان مثال، داده های مربوط به پارابوزید B به شرح زیر بود: صمغ قهوه ای. ½ 2{0 D-55.7 (c 0.05، CH3OH) [20]; UVMeOH حداکثر نانومتر (loge): 220 (3.61)، 291 (3.54)، 330 (3.66) [20]; IRKBr حداکثر cm-1: 3392، 2943، 2885، 1699، 1683، 1606، 1521، 1361، 1282، 1163، 1114، 1039، 995، 817] cm-1 [ برای داده های دقیق طیف سنجی 1H و 13C NMR نشان داده شده در مرجع 20. HR-ESI-MS (منفی) m/z 741.2231 [MH]- (محاسبه برای C33H41O19، 741.2242) [20]. داده ها برای پارابوزید II به شرح زیر بود: پودرهای آمورفوس سفید. ½ 20 D -80.5 (c 0.05، CH3OH) [20]; UVMeOH حداکثر نانومتر (loge): 229 (3.74)، 322 (3.73) [20]; IRKBr حداکثر cm-1: 3419، 1699، 1625، 1596، 1515، 1456، 1419، 1263، 1159، 1139، 1068، 1022، 808 cm-1 [20]؛ برای داده های دقیق طیف سنجی 1H و 13C NMR نشان داده شده در مرجع 20. ESI-MS (منفی) m/z 637

اثرات حفاظتی ترکیبات جدا شده در برابر سمیت ناشی از H2 O2- در سلول های PC12

سنجش MTS برای بررسی اثر ترکیبات جدا شده بر روی زنده ماندن سلول های PC12 در معرض سمیت ناشی از H2O استفاده شد. همانطور که در شکل 5 نشان داده شده است، در مقایسه با سلول های گروه کنترل، سلول های PC12 با پنج غلظت مختلف از caleolarioside B، paraboside B، paraboside II یا paraboside A (3.125، 6.25، 12.5، 25، و 5) پیش تیمار شده اند. میکرومولار) به مدت 24 ساعت تفاوت معنی داری در زنده ماندن سلول نشان نداد (05/0p>). بنابراین، پیش تیمار سلول‌های PC12 با caleolarioside B، paraboside B و paraboside II منجر به سمیت سلولی نشد. همانطور که در شکل 6 نشان داده شده است، 400 میکرومولار H2O2 به طور قابل توجهی زنده ماندن سلول را در مقایسه با گروه کنترل کاهش داد. علاوه بر این، زنده ماندن سلولی سلول‌های PC12 تیمار شده با H2O به طور قابل‌توجهی به دنبال پیش تیمار سلول‌های PC12 با غلظت‌های مختلف کالئولاریوزید B، پارابوزید B و پارابوزید II افزایش یافت. بعلاوه، زنده ماندن سلولی با 50 میکرومولار کالئولاریوزید B، 50 میکرومولار پارابوزید B، و 12.5 میکرومولار پارابوزید II، بالاترین میزان زنده‌مانی را داشت. پنج ترکیب دیگر هیچ اثر محافظتی قابل توجهی روی سلول‌های PC12 تیمار شده با H2O نشان ندادند. برای نشان دادن این یافته، یکی از این موارد را به عنوان مثال مورد بحث قرار می دهیم، در حالی که بقیه در دستنوشته شرح داده نشده اند.

سطوح رونویسی HO-1 و GCLC

سپس سطوح رونویسی HO-1 و GCLC را در سلول‌های PC12 تیمار شده با caleolarioside B، paraboside B و paraboside II آزمایش کردیم. مجموع mRNA از سلول های PC12 تیمار شده و تیمار نشده به مدت 12 ساعت جمع آوری شد و سپس با استفاده از qRT-PCR مورد تجزیه و تحلیل بیان قرار گرفت. همانطور که در شکل 7 (الف، ج، ه) نشان داده شده است، سطوح رونویسی HO{6}} پس از

سلول‌های PC12 با غلظت‌های مشخص‌شده کالئولاریوزید B، پارابوزید B، و پارابوزید II به مدت 12 ساعت از قبل تیمار شدند (p < 0.{{1{14}}}}5).="" همانطور="" که="" در="" شکل="" 7="" (b)="" نشان="" داده="" شده="" است،="" سطوح="" رونویسی="" gclc="" نیز="" در="" سلول="" های="" pc12="" پیش="" تیمار="" شده="" با="" غلظت="" های="" مشخص="" شده="" کالئولاریوزید="" b="" به="" مدت="" 12="" ساعت="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" افزایش="" یافت.="" با="" این="" حال،="" سطوح="" gclc="" در="" سلول‌های="" pc12="" که="" از="" قبل="" با="" پارابوزید="" b="" به="" مدت="" 12="" ساعت="" از="" قبل="" تیمار="" شده="" بودند="" در="" مقایسه="" با="" گروه="" مدل="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" کاهش="" یافت=""><؛ شکل="" 7(d)).="" علاوه="" بر="" این،="" با="" درمان="" پارابوزید="" ii،="" سطوح="" gclc="" در="" سلول‌های="" pc12="" در="" مقایسه="" با="" گروه="" مدل="" تفاوت="" معنی‌داری="" نداشت="" (05/0p="">؛ شکل 7(f)).

بیان HO-1 و GCLC

HO{{0}} و GCLC آنزیم های مهم آنتی اکسیدانی سلولی هستند و هر دو ژن های پایین دستی تنظیم شده Nrf هستند. بیان پروتئین HO{2}} و GCLC نیز پس از درمان مشاهده شد [6]. شکل 8 سطوح پروتئین HO-1 و GCLC را در سلول های PC12 پس از تیمار با 400 میکرومولار H2O2 نشان می دهد. نتایج نشان داد که شدت فلورسنت FL HO در گروه‌های caleolarioside B و paraboside B بیشتر از گروه‌های تحت درمان با H2O بود (شکل 8(a,c)). با این حال، بیان GCLC به طور قابل توجهی توسط ترکیبات تغییر نکرد، به جز کالئولاریوزید B (شکل 8 (b)). سپس، بازدارنده‌های شیمیایی HO{15}} برای ارزیابی بیشتر نقش آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان در تنظیم اثرات محافظتی اعمال شده توسط caleolarioside B، paraboside B، یا paraboside II در برابر سمیت سلولی ناشی از H2O استفاده شد. Caleolarioside B، paraboside B، و paraboside II (3.125 میکرومولار) از سمیت سلولی ناشی از H2O جلوگیری کردند، اما چنین اثرات محافظتی توسط مهارکننده HO{22}} ZnPP (0.01 < p)="" در="" 15="" میکرومولار="" معکوس="" شد="" (شکل="" 8)="">

بحث

پیری جمعیت یک مشکل جدی جهانی است. بسیاری از بیماری ها مانند AD و PD به پیری مربوط می شوند که تهدیدی جدی برای سلامت عمومی هستند. AD و PD به عنوان سومین بیماری های کشنده در سطح جهان، پس از بیماری های قلبی عروقی و سرطان ظاهر شده اند. بنابراین، تخریب عصبی به یک موضوع تحقیقاتی فوری در سراسر جهان تبدیل شده است. با این حال، پاتوژنز AD و PD، بیماری های نورودژنراتیو سیستم عصبی مرکزی، تا به امروز نامشخص باقی مانده است. علاوه بر این، تنها چند دارو وجود دارند که می توانند به طور موثر AD یا PD را به دلیل مکانیسم های بیماری زایی پیچیده خود درمان کنند [23]. مطالعات قبلی نشان داد که ROS، مانند آنیون سوپراکسید (O2-) و H2O2، عوامل اصلی در ایجاد بیماری‌های عصبی هستند. تغییرات پاتولوژیک در طول PD شامل دژنراسیون عصبی و مرگ جسم سیاه و دوپامین مخطط است [24،25]. بر این اساس، توسعه داروهای آنتی اکسیدانی موثر برای درمان PD مهم است و چنین کشف دارویی به یک جهت تحقیقاتی مهم تبدیل شده است [26]. در حال حاضر به نظر می رسد مسیر سیگنالینگ Nrf2/ARE مهمترین مسیر استرس آنتی اکسیدانی درون زا باشد [27]. AREها در نواحی 5'- جناحی ژن‌ها، مانند HO{11}} و GCLC [28،29] قرار دارند. HO{14}} و GCLC ژن‌های مرتبط با Nrf2- هستند که در پایین دست این پروتئین تنظیم می‌شوند [6]. AREها متعاقباً می‌توانند بر سطوح آنتی‌اکسیدان‌ها تأثیر بگذارند و بیان پایین‌دستی HO{17}} و سایر ژن‌های محافظ را فعال کنند، که می‌تواند فعالیت‌های محافظت از سلول را افزایش دهد [30،31]. علاوه بر این، یافته‌ها نشان می‌دهد که اثرات محافظتی رسوراترول در برابر سمیت ناشی از A {20}} در سلول‌های PC12 از طریق تنظیم مثبت بیان HO{22}} از طریق فعال‌سازی مسیر سیگنال‌دهی درون سلولی Nrf2 رخ می‌دهد [32].

سلول‌های PC12 یک مدل پذیرفته‌شده از سلول‌های عصبی هستند و به طور گسترده در مطالعات اثر محافظتی عصبی استفاده می‌شوند [33]. H2O2 می تواند به راحتی از غشای سلولی عبور کند و با آهن ترکیب شود تا رادیکال های آزاد بسیار فعال را تشکیل دهد که باعث استرس اکسیداتیو و آسیب سلولی می شود [34]. H2O2 یک ROS مهم است و رادیکال‌های آزاد به راحتی تولید می‌شوند و نسبتاً پایدار هستند، بنابراین، آنها معمولاً برای ایجاد یک مدل استرس اکسیداتیو با استفاده از سلول‌های PC12 استفاده می‌شوند [5]. در این مطالعه، پیش تیمار سلول‌های PC12 با غلظت‌های غیرسمی عصاره گیاهی، سلول‌ها را در برابر H2O{12}}با کاهش تولید ROS القا کرد. گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید حاوی بسیاری از گروه های هیدروکسیل فنلی هستند که دارای فعالیت های آنتی اکسیدانی و ضد پیری هستند. در این مطالعه، ما دریافتیم که استخراج n-بوتانول محافظت بهتری نسبت به سایر بخش های قطبی ایجاد می کند (شکل 3). بنابراین، ما بیشتر فعالیت های محافظتی هشت ترکیب جدا شده از بخش n-بوتانول را بررسی کردیم. نتایج برای اولین بار نشان داد که شکل 8. تجزیه و تحلیل سطوح پروتئین HO{17}} و GCLC در سلولهای PC12. (الف) آنالیز وسترن بلات بیان HO{19}} و GCLC و GAPDH به عنوان کنترل بارگذاری استفاده شد. (ب) آنالیز وسترن بلات بیان پروتئین GCLC. (ج) بیان پروتئین HO{2{23}}}} آنالیز وسترن بلات. (د) مهارکننده HO{21}} ZnPP اثر محافظت عصبی را کاهش داد. داده ها به صورت میانگین ± SD، n=3 ارائه می شوند. ***p < 0.001="" در="" مقابل="" گروه="" کنترل.="" #p="">< 0.05="" در="" مقابل="" گروه="" h2o2="" (بدون="" تیمار="" znpp)،="" ##p="">< 0.01="" در="" مقابل="" گروه="" h2o2="" (بدون="" درمان="" znpp)،="" ###p=""><0.001 در="" مقابل="" گروه="" h2o2="" (بدون="" znpp="" تحت="" درمان)؛="" و="" p=""><0.01، در="" مقابل="" گروه="" h2o2="" (با="" znpp="" تیمار="" شده)،="" و="" &p=""><0.001، در="" مقابل="" گروه="" h2o2="" (با="" znpp="" تیمار="" شده).="" (گروه="" کنترل؛="" گروه="" مدل:="" h2o2؛="" گروه="" منفی="" znpp:="" کالئولاریوزید="" b="" به="" اضافه="" h2o2،="" پارابوزید="" b="" به="" علاوه="" h2o2،="" پارابوزید="" ii="" به="" اضافه="" h2o2؛="" گروه="" znpp="" مثبت:="" znpp="" به="" همراه="" کالئولاریوساید="" b="" به="" اضافه="" h2o2،="" znpp="" به="" همراه="" پارابوزید="" b="" به="" اضافه="" h2o2،="" znpp="" به="" علاوه="" پارابوزید="" ii.="" به="" اضافه="" h2o2).="" 2210="" x.="" gong="" et="" al.="" دانلود="" شده="" توسط="" یک="" مهمان="" در="" 27="" اوت="" 2021caleolarioside="" b،="" paraboside="" b،="" و="" paraboside="" ii="" اثرات="" محافظتی="" قابل="" توجهی="" در="" برابر="" آسیب="" اکسیداتیو="" ناشی="" از="" h2o{63}}="" در="" سلول‌های="" pc12="" دارند.="" نتایج="" همچنین="" نشان="" داد="" که="" تیمار="" h2o2="" باعث="" آسیب="" قابل="" توجه="" سلول="" pc12="" و="" کاهش="" زنده="" ماندن="" سلولی="" می="" شود،="" در="" حالی="" که="" تیمار="" کالئولاریوزید="" b،="" پارابوزید="" b="" و="" پارابوزید="" ii="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" این="" اثرات="" را="" کاهش="" دادند="" (شکل="" 6).="" یک="" مطالعه="" قبلی="" گزارش="" داد="" که="" مسیر="" nrf2/are="" یکی="" از="" مهمترین="" مسیرهای="" آنتی="" اکسیدانی="" درون="" زا="" است="" و="" می="" تواند="" بیان="" نشانگرهای="" پایین="" دستی="" مانند="" ho{70}}="" را="" برای="" محافظت="" از="" سلول="" ها="" تنظیم="" مثبت="" کند="" [7].="" نتایج="" qrt-pcr="" و="" آنالیز="" وسترن="" بلات="" نشان="" داد="" که="" کالئولاریوزید="" b،="" پارابوزید="" b="" و="" پارابوزید="" ii="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" سطوح="" ho="" را="" تنظیم="" کردند.="" با="" این="" حال،="" سطوح="" رونویسی="" gclc="" در="" سلول‌های="" pc12="" که="" با="" کالئولاریوزید="" b="" پیش="" تیمار="" شده="" بودند="" به="" طور="" قابل‌توجهی="" افزایش="" یافت="" اما="" در="" آنهایی="" که="" با="" پارابوزید="" b="" پیش="" تیمار="" شده="" بودند="" در="" مقایسه="" با="" گروه="" مدل="" کاهش="" یافت.="" علاوه="" بر="" این،="" آرابینوزید="" ii="" بیان="" این="" نشانگر="" را="" در="" مقایسه="" با="" گروه="" مدل="" تغییر="" نداد="" (شکل="" 7="" و="" 8="" (a-c)).="" علاوه="" بر="" این،="" اثرات="" محافظتی="" کالئولاریوزید="" b،="" پارابوزید="" b="" و="" پارابوزید="" ii="" در="" برابر="" آسیب="" سلولی="" pc12="" ناشی="" از="" h2o{78}}="" توسط="" مهارکننده="" ho{80}}="" znpp="" معکوس="" شد="" (شکل="" 8(d)).="" در="" نتیجه،="" گلیکوزیدهای="" فنیل="" اتانوئیدی="" caleo="" larioside="" b،="" arabinoside="" b="" و="" paraboside="" ii="" به="" طور="" موثر="" از="" سلول="" های="" pc12="" در="" برابر="" آسیب="" اکسیداتیو="" ناشی="" از="" h2o="" محافظت="" می="" کنند.="" بر="" این="" اساس،="" این="" ترکیبات،="" جدا="" شده="" از="" p.="" مارتینی،="" ممکن="" است="" کاندیدای="" دارویی="" بالقوه="" برای="" درمان="" بیماری‌های="" تخریب‌کننده="" عصبی="">

مشارکت های نویسندهLM و ZC این آزمایش ها را تصور و طراحی کردند. GX، RK و BX آزمایش ها را انجام دادند. GX و XY مقاله را نوشتند. GX، XY، RK، BX، ZC، و LM نتایج را مورد بحث قرار دادند و در مورد دستنوشته نظر دادند. همه نویسندگان نسخه نهایی را خوانده و تایید کردند.

بیانیه افشاگریهیچ تضاد منافع احتمالی توسط نویسندگان گزارش نشده است. تامین مالی این کار توسط صندوق های تحقیقاتی کالج پزشکی بائوتو [شماره کمک هزینه: BYJJ-YF 201727]، و یارانه خدمات بهداشت عمومی پزشکی چین در سال 2018 "چهارمین نظرسنجی در مورد منبع مواد پزشکی چینی" [شماره کمک مالی: انجمن مالی [2018] حمایت شد. ] 43].

منابع

[1] باترفیلد DA. دیدگاه‌های استرس اکسیداتیو در بیماری آلزایمر و پیش‌بینی‌های تحقیقات آینده J Alzheimers Dis. 2018؛ 64:1-11.

[2] Chignon C، Tomas M، Bonnefontrousselot D، و همکاران. استرس اکسیداتیو و پپتید آمیلوئید بتا در بیماری آلزایمر ردوکس بیول. 2018؛ 14:450-464.

[3] Guo JD، Zhao X، Li Y، و همکاران. آسیب به نورون های دوپامینرژیک توسط استرس اکسیداتیو در بیماری پارکینسون (مروری). Int J Mol Med. 2018؛ 41:1817-1825.

[4] Bai Y، Dong LH، Huang XH، و همکاران. ارتباط پلی‌مورفیسم‌های rs823128، rs1572931 و rs823156 با کاهش خطرات بیماری پارکینسون. گزارش عصبی 2017؛ 27:936-941.

[5] Han XH، Zhu SL، Wang BX، و همکاران. عملکرد آنتی اکسیدانی 7،8-دی هیدروکسی فلفلاون از سلول های PC12 در برابر سمیت سلولی ناشی از 6-هیدروکسی دوپامین محافظت می کند. Neurochem Int. 2014؛ 64:18-23.

[6] Li MQ، Xu T، Zhou F، و همکاران. اثرات محافظتی عصبی چهار گلیکوزید فنیل اتانوئیدی بر روی H2O2-القای آپوپتوز روی سلول‌های PC12 از طریق مسیر Nrf2/ARE. Int J Mol Sci. 2018؛ 19:1135.

[7] Buendia I، Michalska P، Navarro E، و همکاران. مسیر Nrf2-ARE: یک هدف نوظهور در برابر استرس اکسیداتیو و التهاب عصبی در بیماری‌های نورودژنراتیو. فارماکول درمانی 2016؛ 157:84-104.

[8] Jia XJ، Yan XS، Cai ZP، و همکاران. اثرات گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید، مشتق شده از گیاه هربا سیستانش، بر نقایص شناختی و فعالیت های آنتی اکسیدانی در موش های نر SAMP8. J Toxicol Env Heal A. 2017؛ 80:1180-1186.

[9] Tsvetkov DE، Dmitrenok AS، Tsvetkov YE، و همکاران. گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید از گره های چوب ساج و فعالیت آنتی اکسیدانی آنها J Biol Active Prod Nat. 2016؛ 6:272-281.

[10] Zhang YQ، Gao EY، Liang CQ، و همکاران. فعالیت آنتی اکسیدانی ترکیبات گلیکوزید فنیل اتانوئید کافئویل از Lindernia ruellioides در شرایط آزمایشگاهی. داروخانه سنت ساوت. 2017؛ 15:1687-1690.

[11] Wu ZH، Ma YF، Zhao L، و همکاران. نقش مسیر Nrf2-ARE در آسیب استرس اکسیداتیو و ارتباط آن با سایر مسیرهای سیگنالینگ. Anim Husbandry Feed Sci. 2016؛ 37:42-48.

[12] Zheng XK، Li J، Feng WS، و همکاران. پیشرفت در مطالعه Gesneriaceae. داروی جدید چین جی. 2003؛ 12:261-263.

[13] ون اف، لی زد. پیشرفت تحقیقات در مورد گیاه Gesneriaceae. منبع گیاه وحشی چانه. 2006؛ 25:1-6.

[14] Yan WY، Chen L، Wang JM، و همکاران. پیشرفت تحقیقات تری ترپنوئیدهای گیاهان Gesneriaceae. Nat Prod Res Dev. 2012؛ 24:698-701.

[15] شرکت چینی داروهای گیاهی. سوابق منابع طب سنتی چینی چین: انتشارات علمی; 1994.

[16] Bai ZF، Wang XQ، Xiao PG، و همکاران. توزیع گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید در گیاهان دارویی Gesneriaceae. چین جی چین ماتر مد. 2013؛ 38:4267-4270.

[17] He ZD، Lau KM، Xu HX، و همکاران. فعالیت آنتی اکسیدانی گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی از Brandisia hancei. جی اتنوفارماکول. 2000؛ 71:483-486.

[18] Li L، Shi DF، Gui YG، و همکاران. بررسی فعالیت های آنتی اکسیدانی گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی از گیاه سیستانش دسرتیکولا. J Anhui Agri Sci. 2009؛ 32: 15835-15836.

[19] Ju BW، Yang JH، Yan Y، و همکاران. اثرات محافظتی گلیکوزیدهای سیستانچ بر آسیب سلول های PC12 PARABOLA MARTINI PROTECT PC12 CELLS FROM H2O{4}}Anduced Injury 2211