بیان ژن ایمنی و شبکه های عملکردی در کلاس های مجزای نفریت لوپوس Ⅰ

خلاصه

هدف بررسی کاربرد پلتفرم NanoString درکلیه روشن کنندهرونوشت های ایمنی برای نفریت لوپوس کلاس III، IV، و V (LN) با استفاده از یک گروه گذشته نگرپارافین ثابت شده با فرمالین(FFPE) بافت بیوپسی کلیه.

روش ها: تجزیه و تحلیل رونوشت ژن ایمنی با استفاده از پلت فرم NanoString nCounter بر روی RNA از LN (n=55)، بیماری غشای پایه نازک (TBM) (n=14) و نفروپاتی غشایی (MN) (n{) انجام شد. {2}}) FFPEبیوپسی کلیهبافت. نمونه‌های LN شامل بیوپسی‌های تک کلاس III (n=11)، IV (n=23) و V (n=21) بدون ضایعات مختلط بودند. بیان ژن دیفرانسیل با NanoString nSolver، با تجسم نمودارهای آتشفشان و نقشه‌های حرارتی تولید شده در R انجام شد. رونوشت‌های قابل‌توجهی برای شناسایی شبکه‌های کاربردی با استفاده از اصطلاحات STRING و ژن‌زایی ژن مورد بازجویی قرار گرفتند.

برای دریافت فرمولاسیون گیاهی سیستانچ برای کلیه اینجا را کلیک کنید

ResultsIn مقایسه با TBM، ما 52 ژن به طور قابل توجهی متفاوت بیان شده مشترک در هر سه کلاس LN شناسایی کردیم. تجزیه و تحلیل مسیر، غنی‌سازی مسیرهای سیگنالینگ، مکمل و MHC II اینترفرون نوع I (IFN) را نشان داد که اکثر آنها بالاترین بیان را در کلاس IV LN نشان دادند. بیوپسی‌های کلاس IV LN ما نیز در مقایسه با بیوپسی‌های LN کلاس V، تنظیم مثبت سیگنالینگ NF-kB و غنی‌سازی ایمنی را نشان دادند. رونوشت های مسیر IFN نوع I کلاس V LN را از MN متمایز می کند.

نتیجه‌گیری کل آنالیز رونویسی بخش کلیه ما بینش‌هایی را در مورد مشخصات مولکولی کلاس III، IV و V LN ارائه کرد. داده‌ها مسیرهای مهم مشترک برای هر سه کلاس و مسیرهای غنی‌شده در بیوپسی‌های کلاس IV LN را برجسته کردند. توانایی آشکارسازی مسیرهای مولکولی در LN با استفاده از بخش‌های بیوپسی کامل FFPE می‌تواند کاربرد بالینی در انتخاب درمان برای LN داشته باشد.

معرفی

نفریت لوپوس(LN) یک تظاهرات مهم سیستمیک استلوپوس اریتماتوز(SLE) و تقریباً در 40٪ بیماران ایجاد می شود. 1 شیوع آن تحت تأثیر سن (بیشتر در SLE در دوران کودکی) و قومیت (در بیماران غیرقفقازی بیشتر است) و با وضعیت اجتماعی و اقتصادی ارتباط معکوس دارد.بیوپسی کلیهبخش مهمی از مدیریت LN3 4 است و تلاش های قابل توجهی برای مرتبط کردن تغییرات مشاهده شده در بیوپسی با پاتوژنز، انتخاب درمان و پیش آگهی انجام شده است. تعاریف استاندارد شده ضایعات بیوپسی برای کاهش تنوع بین گزارش

انجمن بین المللی نفرولوژی/انجمن آسیب شناسی کلیه (ISN/RPS) در سال 2003 طبقه بندی اجماع LN5 شش کلاس را شرح داد: حداقل LN مزانژیال (کلاس I). LN پرولیفراتیو مزانژیال (کلاس II)؛ LN کانونی (کلاس III)؛ LN منتشر که می تواند بیشتر به LN پرولیفراتیو منتشر (کلاس IV-S) و منتشر جهانی (کلاس IV-G) تقسیم شود. LN غشایی (کلاس V) و LN اسکلروزان پیشرفته (کلاس VI). ضایعات گلومرولی فعال (به عنوان مثال، هیپرسلولاری اندوکاپیلاری، نکروز فیبرینوئید، هلال های سلولی و میکروسلولی) و مزمن (C، به عنوان مثال، اسکلروز گلومرولی، هلال های فیبری) نیز در هنگام توصیف کلاس های III و IV تعریف و مشخص شدند. به عنوان مثال، کلاس IV-G (A) LN پرولیفرای جهانی منتشر را با ضایعات فعال توصیف کرد. یک به‌روزرسانی برای این طبقه‌بندی پیشنهاد شده است. توصیه‌ها شامل حذف زیربخش‌های کلاس IV-S و IV-G است، زیرا این دسته‌بندی‌ها بر نتیجه تأثیری ندارند. در یک متاآنالیز، وقوع هر دومرحله نهایی بیماری کلیهیادو برابر شدن کراتینین سرمبین کلاس های IV-S و IV-G تفاوتی نداشت. 7 همچنین پیشنهاد شد که توصیفگرهای فعال و مزمن را با شاخص های فعالیت و مزمن ناشی از فعالیت و سیستم امتیازدهی NIH لوپوس جایگزین کند، و در نتیجه ارزیابی کمی از فعالیت را امکان پذیر می کند. امتیاز از 0 تا 24) و مزمن (نمره 0 تا 12).

کلاس LN برای اطلاع رسانی مدیریت حیاتی است. سرکوب سیستم ایمنی در کلاس III و IV LN فعال توصیه می شود اما در کلاس II LN توصیه نمی شود. تصمیم برای تحریک سرکوب سیستم ایمنی در کلاس V LN تحت تأثیر درجه پروتئینوری و پاسخ آن به محاصره رنین-آنژیوتانسین-آلدوسترون است. عدم کنترل پروتئینوری 12 ماه پس از درمان با پیشرفت بیماری مزمن کلیه مرتبط است.<0.5–0.7 g per 24 hours).

کلاس LN به تنهایی در اطلاع رسانی نتایج قوی تر است زیراعوامل خطر برای ایجاد بیماری مزمن کلیهعبارتند ازویژگی های بالینیو به این دلیل که آنها شامل ویژگی های تاریخی-منطقی هستند که توسط تعاریف کلاس LN ثبت نشده اند. اینها شامل درجه فیبروز بینابینی و آتروفی توبولی (IFTA) و ضایعات گلومرولی خاص مانند نکروز فیبرینوئید و هلالهای فیبری است. این امر در نفروپاتی IgA مشهود است، جایی که نشان داده شده است که امتیازدهی سلولی مزانژیال، هیپرسلولیری اندوکاپیلاری، اسکلروز سگمنتال، آتروفی لوله‌ای، فیبروز بینابینی و هلالی برای تشکیل امتیاز MEST-C به پیش‌بینی خطر کمک می‌کند. /RPS 2003 طبقه‌بندی اجماع LN ممکن است این کمبودها را برطرف کند، اما هنوز بر اساس استفاده از مورفولوژی است. در نتیجه، نیاز به مطالعه مسیرهای مولکولی در بیوپسی‌های LN و درک اینکه چگونه این مسیرها با کلاس‌های LN16 17 و نتایج درمان مرتبط هستند، وجود دارد. پیشرفته در تشخیص رد کلیه با واسطه آنتی بادی که در آن افزایش بیان رونوشت های ژن در بافت بیوپسی، در انتظار اعتبار سنجی، به معیارهای مورفولوژیکی معتبر اضافه شده است. بیوپسی در SLE، ما از فناوری NanoString برای مطالعه بیان 750 رونوشت ایمنی و مربوط به التهاب در بخش‌های پارافین تعبیه‌شده با فرمالین (FFPE) از 55 بیوپسی LN، 14 نمونه‌برداری با بیماری غشای پایه نازک (TBM) و 9 نمونه‌برداری استفاده کردیم. نفروپاتی غشایی (MN).

مواد و روش ها

نمونه‌ها: بافت بیوپسی کلیه FFPE از نمونه‌های بایگانی‌شده LN، TBM، و MN برای استفاده بالینی و جایی که بافت کافی برای تجزیه و تحلیل در دسترس بود، به‌دست آمد. بیوپسی های لوپوس با ضایعات مختلط یا اسکار قابل توجه حذف شدند. TBM به عنوان یک کنترل بیماری به دلیل در دسترس نبودن بیوپسی طبیعی کلیه استفاده شد. پارامترهای بالینی به صورت گذشته نگر از پرونده سلامت جمع آوری شد. ماتریس امتیاز اینترفرون (IFN) همانطور که قبلا گزارش شده بود به دست آمد. 21 پاسخ کامل به عنوان نسبت پروتئین به کراتینین ادرار (uPCR) تعریف شد.<50mg/mmol and an estimated glomerular filtration rate (eGFR) of ≥60mL/min, or if <60mL/min at baseline not fallen by >20 درصد تا یک سال پس از بیوپسی. پاسخ جزئی به عنوان uPCR تعریف شد<300mg/mmol with a≥50% improvement from baseline and eGFR criteria the same as for complete response. Non-response was defined as failing to achieve partial response by 1 year.

استخراج RNA

شش بخش بافت کامل ضخامت 10 میکرومتر توسط میکروتوم از هر بلوک FFPE، به دنبال حذف دو بخش 4 میکرومتر به دست آمد. برای جلوگیری از آلودگی متقاطع، تجهیزات با RNase Away بین نمونه ها تمیز شد و برای هر نمونه از یک تیغه تازه استفاده شد. جداسازی RNA کل بافت در همان روز با استفاده از کیت RNeasy FFPE (Qiagen، #73504) انجام شد و غلظت RNA توسط اسپکتروفتومتر NanoDrop ND1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA؛ داده‌های تکمیلی آنلاین S1) ارزیابی شد.

تجزیه و تحلیل رونوشت

Transcriptome analysis was performed using 100ng of total RNA on the NanoString nCounter platform (NanoString nCounter FLEX Dx analysis system, NanoString Technologies, Seattle, Washington, USA) with a probe CodeSet comprising the human PanCancer immune profiling panel (730 immune-related genes, 40 housekeeping genes, 6 positive control genes, 8 negative control genes) and additional 20 custom probes selected based on literature review (online supplemental table 1). Samples were run using two CodeSets which differed only by 10 unique probes, enabling us to analyze 750 endogenous transcripts across the 78 samples. CodeSet One: LN class III (n=6), class IV (n=9), class V (n=8), TBM (n=8), MN (n=1). CodeSet Two: LN class III (n=5), class IV (n=14), class V (n=13), TBM (n=6), MN (n=8). All samples passed NanoString quality control parameters (image quality control, binding density, positive control linearity and limit of detection). To control for inter-CodeSet variation and batch variability we used the nSolver Cross Reporter Library File (RLF) function to calibrate raw counts of overlapping probes using an identical sample run on both CodeSets. To reduce technical bias, and increase confidence and reproducibility, background thresholding was set at 100 counts, which is >دو برابر (میانگین{0}} SD) پروب های کنترل منفی. شمارش به میانگین هندسی 10 ژن خانه دار (FCF1، HPRT1، MRPS5، MTMR14، POLR2A، PRPF38A، SDHA، SF3A3، TUBB، و ZC3H14) نرمال شد، همانطور که در همه انواع نمونه بیان شد. شمارش نرمال شده برای همه نمونه ها در داده های تکمیلی آنلاین S2 فهرست شده است.

تحلیل آماری

بیان ژن دیفرانسیل (DGE) با استفاده از الگوریتم تجزیه و تحلیل پیشرفته حل کننده (V.4) Fast/Approxi mate که از مدل دوجمله ای منفی ساده شده برای همه کاوشگرها استفاده می کند، به جز مواردی که الگوریتم همگرا نیست و از روش رگرسیون خطی استفاده می شود، انجام شد. LN، MN یا کلاس LN (III، IV و V) به عنوان متغیرهای مستقل و TBM به عنوان گروه مرجع ما استفاده شد. شمارش آستانه روی 100 و فراوانی مشاهده در نمونه‌ها 8 درصد تعیین شد. مقدار P با استفاده از روش بنجامینی-هوچبرگ با آستانه کشف نادرست برای تنظیم در 0.05 تنظیم شد. نمودارهای آتشفشان با استفاده از بسته آتشفشان پیشرفته (https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano) در R.22 تولید شد. تجسم شبکه پروتئینی عملکردی با استفاده از پایگاه داده STRING (https://string-db.org/) ، با استفاده از شبکه کامل STRING. لبه های شبکه با اطمینان تعریف شدند و تعاملات با بالاترین امتیاز تعامل اطمینان (بیشتر یا مساوی 0.9) تنظیم شدند. گره های قطع شده در شبکه ها نمایش داده نشدند. ژن‌های متفاوت بیان شده برای غنی‌سازی اصطلاحات هستی‌شناسی ژن (GO) (فرآیندهای بیولوژیکی، عملکردهای مولکولی، اجزای سلولی)، مسیرهای Reactome و خوشه‌های شبکه محلی STRING مورد ارزیابی قرار گرفتند. شبکه‌های تعامل بصری با غنی‌سازی‌های عملکردی در شرایط GO (فرآیندهای بیولوژیکی) و تحلیل STRING ایجاد شدند. نمودار ون متناسب با سطح همپوشانی ژن‌های بیان شده متفاوت بین زیر کلاس‌های LN با BioVenn (www.biovenn. nl) تولید شد. داده‌ها از نرم‌افزار حل‌کننده تجزیه و تحلیل پیشرفته در محیط آماری R خوانده شد و تجسم داده‌ها با استفاده از نمودارهای جعبه، تجزیه و تحلیل مؤلفه‌های اصلی انجام شد. نقشه های آتشفشانی و نقشه های حرارتی نقشه های حرارتی با استفاده از نمرات Z از شمارش نرمال شده و فت مپ در R. خوشه ها با استفاده از آزمون دقیق فیشر تجزیه و تحلیل شدند. برای مقایسه گروه‌های چندگانه از تحلیل واریانس با آزمون مقایسه‌های چندگانه سیداک استفاده شد. داده ها با استفاده از GraphPad Prism (V.8.0) تجزیه و تحلیل شد.

بیانیه مشارکت بیمار و عمومی (PPI).

این مطالعه بخشی از کنسرسیوم MASTERPLANS بود و همکاران بیمار در هر رشته کاری از جمله این مطالعه شرکت کردند. واژه‌نامه‌ای از اصطلاحات توسط PPI تولید شد تا امکان تعامل بیشتر با جامعه گسترده‌تر بیماران را فراهم کند و یافته‌های پژوهشی در روزهای بررسی اولیه گنجانده شد. بررسی‌های عمومی نشریات در وب‌سایت MASTERPLANS (https://sites. manchester.ac.uk/masterplans) به اشتراک گذاشته می‌شود.

خدمات حمایتی Wecistanche - بزرگترین صادرکننده سیستانچ در چین:

ایمیل:wallence.suen@wecistanche.com

واتساپ/تلفن:+86 15292862950

خرید برای جزئیات بیشتر مشخصات:

https٪3a٪2f٪2fwww.xjcistanche.com٪2fcistanche-shop

عصاره سیستانچ طبیعی ارگانیک با 25% اکیناکوزید و 9% آکتئوزید برای کلیه دریافت کنید