گالکتین-3 دارای اثرات ضد نکروپتوز و ضد آپوپتوز در نکروز حاد لوله ای ناشی از سیس پلاتین است

مخاطب: ali.ma@wecistanche.com

سهیل السلمه و همکاران

دوز Cistanche tubulosa برای بیماری کلیوی، برای دریافت نمونه اینجا را کلیک کنید

خلاصه

پیشینه/هدف:حادکلیهآسیب (AKI) یک بار سلامت عمومی با افزایش عوارض، مرگ و میر و هزینه مراقبت های بهداشتی است. با افزایش خطر ابتلا به بیماری مزمن همراه استکلیهبیماری و مرگ نکروز حاد توبولار (ATN) شایع ترین علت AKI است. آپوپتوز و نکروز بافتی نقش مهمی در ATN دارند. گالکتین 3 (GAL{1}})، یک لکتین اتصال بتا گالاکتوزید، شناخته شده است که در التهاب، آپوپتوز، و استرس اکسیداتیو نقش دارد، اما نقش آن در نکروز حاد لوله‌ای ناشی از سیس پلاتین به وضوح مشخص نشده است.

مواد و روش ها:موش های نر C57B6-J و C57BL-6 -GAL-3 ناک اوت برای القای ATN با استفاده از مدل موش سیس پلاتین نکروز حاد لوله ای مورد استفاده قرار گرفتند. بیان GAL{6}}، پروتئین های آپوپتوز، نکروز و نکروپتوز درکلیه هابا استفاده از روش‌های استاندارد هیستولوژیک، ایمونوهیستوشیمی، و روش‌های ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم اندازه‌گیری شد. داده ها به صورت میانگین ± SE تفاوت آماری معنی دار (ص<0.05) were="" calculated="" between="" experimental="" groups="" and="" corresponding="" control="" groups="" by="" one-way="" analysis="" of="">

نتایج:افزایش قابل توجهی در GAL-3 درکلیه هااز موش‌های وحشی GAL-3 تیمار شده با سیس پلاتین در مقایسه با موش‌های کنترل آن. علاوه بر این، درصد بالاتری از ATN، سطوح بالاتر اوره و کراتینین پلاسما و سطوح بالاتر کاتپسین B و کاتپسین D درکلیه هااز موش‌های GAL-3 KO تیمار شده با سیس پلاتین نسبت به موش‌های وحشی GAL-3 تیمار شده با سیس پلاتین. به همین ترتیب، سطوح بالاتری از پروتئین‌های نکروپتوز RIPK1، RIPK3 و MLKL درکلیه هااز موش‌های GAL-3 KO تیمار شده با سیس پلاتین نسبت به موش‌های وحشی GAL-3 تیمار شده با سیس پلاتین. علاوه بر این، سطوح به طور قابل توجهی بالاتر از وجود داردکلیهپروتئین های پرو آپوپتوز؛ کاسپاز شکافته شده-3، PARP، TRAIL و FAS شکافته شده در موش‌های GAL-3 KO تحت درمان با سیس پلاتین در مقایسه با موش‌های وحشی GAL-3 تیمار شده با سیس‌پلاتین.

نتیجه:GAL{0}} می‌تواند از طریق برهمکنش با پروتئین‌های نکروپتوز، آپوپتوز و پرو-بقا در لوله‌های کلیوی در طی نکروز حاد لوله‌ای ناشی از سیس پلاتین، بر بقا و مرگ سلولی تأثیر بگذارد.

کلید واژه ها: کلیه• نکروز لوله‌ای حاد • سیس پلاتین • گالکتین-3 • نکروز • آپوپتوز

مقدمه

حادکلیهآسیب (AKI) با کاهش ناگهانی مشخص می شودکلیهعملکرد بر اساس افزایش سطح کراتینین سرم، کاهش برون ده ادرار، نیاز به درمان جایگزینی کلیه، یا ترکیبی از این عوامل [1].

راکلیهراهنمای عمل بالینی بهبود بیماری (KDIGO) برای AKI، AKI را به‌عنوان افزایش کراتینین سرم به میزان بیش‌تر یا مساوی 0. mg/dl (بیشتر یا مساوی 26.5 میکرومول در لیتر) در داخل تعریف می‌کند. 48 ساعت؛ یا افزایش کراتینین سرم به بیشتر یا مساوی 1.5 برابر سطح پایه، که معلوم است یا فرض می شود در 7 روز قبل رخ داده است. یا حجم ادرار<0.5 ml/kg/h="" for="" 6="" hours="">

نکروز حاد توبولار (ATN) یک علت شایع AKI است [3]. موارد ایسکمیک و نفروتوکسیک علل اصلی ATN هستند [3]. علیرغم مطالعات گسترده بر روی ATN، که شامل آسیب سلولی، مرگ سلولی و بازسازی می شود، مکانیسم های زمینه ای به وضوح تعریف نشده اند.

آپوپتوز نوعی مرگ برنامه ریزی شده سلولی است که با واسطه کاسپازها انجام می شود. گزارش های مهم نشان داده اند که آپوپتوز نقش مهمی در ATN ایفا می کند [3، 4]. از سوی دیگر، نکروز شکلی از مرگ سلولی است که با نفوذپذیری اولیه غشای پلاسمایی، تورم اندامک ها و از هم پاشیدگی محتویات سلولی مشخص می شود [5]. نکروز اغلب زمانی رخ می دهد که سلول ها با استرس خارجی بیش از حد به چالش کشیده می شوند. نکروز به طور سنتی به عنوان غیرفعال و برنامه ریزی نشده در نظر گرفته می شود. از این رو، علیرغم شیوع آن در بیماری های انسانی، تلاش های بسیار کمی برای بررسی مکانیسم نکروز انجام شده است [5]. یک نوع نکروز شناخته شده نکروز است [5]. نکروپتوز یک مرگ سلولی غیر آپوپتوز برنامه ریزی شده است که توسط تعدادی از محرک های خارج سلولی مانند فاکتور نکروز تومور (TNF) القا می شود [5]. در ابتدا به عنوان مرگ سلولی تعریف شد که با مورفولوژی مرگ سلولی نکروزه همراه با فعال شدن همزمان سرین/ترئونین-پروتئین کیناز 1 (RIPK1) برهم کنش گیرنده مشخص می شد. RIPK1 سرین/ترئونین-پروتئین کیناز 3 (RIPK3) را فعال می‌کند که با گیرنده تعامل دارد و مجموعه‌ای را تشکیل می‌دهد که نکروزوم نامیده می‌شود [6]. بعداً، RIPK3 فعال شده توانایی فسفریله کردن و فعال کردن دامنه‌مانند کیناز دودمان مخلوط (MLKL) را به دست می‌آورد [6]. مولکول های MLKL فسفریله شده قادر به تشکیل الیگومرها برای تسهیل انتقال آنها به غشای سلولی از طریق اتصال به لیپیدهای فسفاتیدیلینوزیتول و کاردیولیپین هستند. الیگومرهای MLKL جابه‌جا شده به‌عنوان کانال‌هایی در غشای سلولی عمل می‌کنند تا هجوم سدیم و خروج یون‌های پتاسیم [7] یا هجوم یون‌های کلسیم [8] را القا کنند. از هر دو جهت این امر منجر به مرگ سلولی نکروزه از طریق نفوذپذیری و پارگی غشای پلاسما می شود که منجر به ریختن محتوای داخل سلولی به داخل اندام می شود.

در این پروژه از سیس پلاتین (Cis) برای القای نکروز حاد توبولار استفاده شده است. سیس دارای طیف گسترده ای از اثرات ضد تومور است و برای درمان تومورهای بدخیم مختلف استفاده شده است [9]. با این وجود، سمیت کلیوی عارضه جانبی اصلی است و با نکروز سلولی توبولار کلیوی، آسیب بافتی، اختلال عملکرد کلیوی و حاد مشخص می شود.کلیهشکست [10]. علیرغم اقدامات مختلفی که برای غلبه بر آسیب کلیوی انجام شده است، تقریباً 4 تا 23 درصد از بیماران تحت تأثیر AKI هستند [11]. مکانیسم های شناخته شده آسیب کلیوی ناشی از سیس پلاتین شامل آپوپتوز، استرس اکسیداتیو و پاسخ التهابی به دلیل آسیب مستقیم به سلول های اپیتلیال لوله های کلیوی و عروق کلیوی است [12].

گالکتین-3 (GAL-3)، پروتئین 35 کیلو دالتون، یک کایمرا مانند منحصر به فرد است که دارای یک دامنه تشخیص کربوهیدرات ترمینال C (CRD) متصل به یک دامنه N-ترمینال طولانی (ND) است [13] ].GAL{7}} در سطح سلول، سیتوپلاسم و هسته سلول ها و همچنین در ماتریکس خارج سلولی یافت می شود [13].

GAL درون سلولی{0}} در تکثیر سلولی و مکانیسم‌های ضد آپوپتوز نقش داشته است [14، 15]. این پروتئین‌های K-Ras و Akt را تحت تأثیر قرار می‌دهد و همچنین بقای تمایز و مرگ را تنظیم می‌کند [14، 15]. در حالی که GAL خارج سلولی واسطه چسبندگی سلولی، تعامل و سیگنال دهی سلول-ماتریکس، التهاب و آپوپتوز می شود [16].

نشان داده شده است که GAL به دنبال قرار گرفتن در معرض محرک‌های آپوپتوز یا از سیتوزول یا از هسته به میتوکندری منتقل می‌شود و از تغییرات پتانسیل غشای میتوکندری جلوگیری می‌کند و در نتیجه از آپوپتوز جلوگیری می‌کند [17]. مطالعات همچنین نشان داده اند که GAL{2}} می تواند آپوپتوز ناشی از TNF را از طریق فعال سازی AKT مهار کند [18]. مطالعات دیگر نشان داده اند که GAL{5}} و Beclin1 در دو مسیر هماهنگ مرگ برنامه ریزی شده سلولی، آپوپتوز و اتوفاژی نقش دارند [18]. در این پروژه فرض می‌کنیم که GAL{8}} نقش محافظتی بر روی اپیتلیوم لوله‌ای کلیه در آسیب حاد لوله‌ای دارد. ما از یک مدل موش آسیب حاد لوله‌ای برای بررسی نقش محافظتی GAL{9}} در آسیب لوله‌ای حاد ناشی از سیس پلاتین از طریق اندازه‌گیری عملکرد کلیوی (اوره پلاسما و کراتینین) استفاده کرده‌ایم.کلیهپروتئین‌های نکروپتوز (RIP{0}}، RIP-3 و MLKL)، پروتئین‌های نکروز (کاتپسین D و کاتپسین B)، پروتئین‌های آپوپتوز (کاسپاز بریده شده-3، PARP، TRAIL، و FAS شکافته شده) و نشانگرهای بقای سلول ها (p-NF-κB، بتا-کاتنین و Wnt)، با استفاده از روش استاندارد ایمونوسوربنت متصل به آنزیم، تجزیه و تحلیل بیوشیمیایی، روش های بافت شناسی و ایمونوهیستوشیمی.

مواد و روش ها

ما از یک مدل تجربی موش حاد استفاده کرده ایمکلیهآسیبی که به طور گسترده در ادبیات توصیف شده و برای مطالعه حاد استفاده شده استکلیهآسیب در آزمایشگاه های سراسر جهان [19].

مدل موش نکروز حاد لوله ای

موش های C57BL/6 و C57BL/6 –GAL{4}} ناک اوت (KO) با وزن 25-30 گرم استفاده شد. موش ها در یک رژیم غذایی استاندارد نگهداری شدند. موش‌ها حداقل 1 هفته قبل از تجویز سیس‌پلاتین در هر قفس 5 ساعت تحت برنامه‌های تاریک و روشن 12- ساعت قرار گرفتند.

سیس پلاتین (EBEWE Pharma GmbH Nfg. KG، Unterach، AUSTRIA) به تازگی در روز تجویز در غلظت 0.5 میلی گرم در میلی لیتر استفاده شد. به موش‌ها 30 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن سیس‌پلاتین [11] یا حامل (سالین نرمال) داخل صفاقی (IP) داده شد، پس از آن موش‌ها دوباره به غذا و آب دسترسی آزاد داشتند. روش اتانازی با تزریق داخل صفاقی داروهای بیهوشی که شامل ترکیبی از کتامین (mg/kg 100) و زایلازین (mg/kg 10) بود، شروع شد، سپس کلیه‌ها خارج شدند و نمونه‌های خون 96 ساعت پس از تجویز سیس پلاتین جمع‌آوری شد. خون در جاروبرقی EDTA جمع آوری شد.کلیه هاسپس برداشته شدند، در سالین بافر فسفات سرد (PBS) شسته شدند، نیمی از هر کلیه بلافاصله در نیتروژن مایع منجمد شد و بعداً در فریزر 80- درجه نگهداری شد. نیم دیگر بلافاصله به مدت 24 ساعت در 10 درصد سرم سالین رسمی بافر تثبیت شد. خون جمع آوری شده با سرعت 3000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. پلاسما جمع آوری شد، تقسیم شد و تا تجزیه و تحلیل بیشتر در دمای 80- درجه نگهداری شد.

پردازش نمونه برای استخراج پروتئین

پروتئین کل از آن استخراج شدکلیهنمونه ها با همگن سازی با بافر لیز و جمع آوری مایع رویی پس از سانتریفیوژ. برای لیز سلولی کل، نمونه‌های کلیه ذوب شدند، وزن شدند و در بافر لیز سرد حاوی 5{{2{22}}}} میلی‌مولار تریس، 300 میلی‌مولار NaCl، 1 میلی‌مولار قرار داده شدند. MgCl2، 3 میلی‌مولار EDTA، 20 میلی‌مولار - گلیسروفسفات، 25 میلی‌مولار NaF، 1 درصد Triton X-100، 10 درصد وزنی بر وزن گلیسرول و قرص بازدارنده پروتئاز (بازدارنده پروتئاز کامل Roche) قرص کوکتل). کلیه ها روی یخ توسط هموژنایزر (IKA T25 Ultra Turrax) همگن شدند. سپس نمونه‌ها در 14000 RPM به مدت 15 دقیقه در 4 درجه سانتریفیوژ شدند، مایع رویی جمع‌آوری شد، تقسیم‌بندی شد و تا آنالیز بیشتر در 8-0 درجه نگهداری شد. استخراج پروتئین های هسته ای و سیتوپلاسمی طبق پروتکلی که در جاهای دیگر توضیح داده شد انجام شد [19]. به طور خلاصه، نمونه های کلیه روی یخ ذوب شدند، وزن شدند و روی یخ با بافر حاوی Tris HCl 10 mmol/l، CaCl2 3 mmol/l، MgCl2 2 mmol/l، EDTA 0.1 mmol/l همگن شدند. ، فنیل متان سولفونیل فلوراید (PMSF) 0.5 میلی مول در لیتر، ساکارز 0.32 میلی مول در لیتر، دیتیوتریتول (DTT) 1 میلی مول در لیتر، Nonidet P-40 (NP-40) 0.5 درصد و کوکتل بازدارنده پروتئاز 1 درصد. هموژن ها با سرعت 800 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند. مایع رویی خارج شد و به عنوان فراکسیون سیتوپلاسمی نگهداری شد. گلوله دو بار با بافر همگن بدون NP{34}} شسته شد و با یک بافر کم نمک حاوی HEPES 20 mmol/l، MgCl2 1.5 mmol/l، KCl 20 mmol/l، EDTA 0.2 mmol مجدداً معلق شد. /l. گلیسرول 25 درصد، PMSF 0.5 میلی مول در لیتر و DTT 0.5 میلی مول در لیتر. پس از انکوباسیون روی یخ به مدت 5 دقیقه، حجم مساوی از بافر پر نمک حاوی HEPES 20 mmol/l، MgCl2 1.5 mmol/l، KCl 800 mmol/l، EDTA 0.2 mmol/l. گلیسرول 25 درصد، PMSF 0.5 میلی مول در لیتر، DTT 0.5 میلی مول در لیتر، NP{58}} درصد و کوکتل بازدارنده پروتئاز 1 درصد اضافه شد، مخلوط به مدت 30 دقیقه روی یخ انکوبه شد، سانتریفیوژ شد در 14000 RPM به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه و مواد رویی به عنوان کسر هسته ای ذخیره شدند. غلظت کل پروتئین با استفاده از روش سنجش پروتئین BCA (کیت سنجش پروتئین BCA Thermo Scientific Pierce) تعیین شد.

پردازش نمونه برای بافت شناسی

کلیه ها برداشته شدند، با PBS سرد یخ شسته شدند و وزن شدند. هر یککلیهبه دو نیمه تقسیم شد و هر نیمه یک کاست بود و مستقیماً در فرمالین 10 درصد بافر ثابت شد. بخش ها در غلظت های فزاینده اتانول آبگیری شدند، با زایلن پاکسازی شدند و با پارافین جاسازی شدند. مقاطع سه میکرومتری از بلوک‌های پارافین تهیه و با استفاده از روش‌های استاندارد با رنگ‌های هماتوکسیلین و ائوزین و اسید پریودیک شیف (PAS) رنگ‌آمیزی شدند [20]. مقاطع رنگ آمیزی شده توسط هیستوپاتولوژیست شرکت کننده در این پروژه ارزیابی شدند.

ایمونوهیستوشیمی

مقاطع پنج میکرومتری با زایلن پارافین زدایی و با الکل درجه بندی شده هیدراته شدند. سپس برش ها در محلول بازیابی با pH بالا (pH 9) در حمام آب با دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 20 دقیقه قرار داده شد. سپس بخش ها با آب مقطر به مدت 5 دقیقه و سپس بافر TBST به مدت 5 دقیقه شسته شدند. سپس برش ها با بلوک پراکسیداز به مدت 10 دقیقه و سپس بلوک پروتئین به مدت 10 دقیقه تیمار شدند. سپس بخش ها به مدت یک ساعت در دمای اتاق با آنتی بادی ضد کاسپاز{9}} (Rabbit Polyclonal, 1:300, Cell signaling technology, Danvers, MA USA) و آنتی بادی PARP ضد شکاف (Rabbit Polyclonal, 1: انکوبه شدند: 100، فناوری سیگنال دهی سلولی، Danvers، MA، ایالات متحده)، آنتی بادی ضد بتا کاتنین (Rabbit Polyclonal، 1:100، Abcam، کمبریج، MA، ایالات متحده آمریکا)، آنتی بادی ضد فسفو-NF-kB (Rabbit Polyclonal، 1: 100, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-Wnt-3 (Rabbit Polyclonal, 1:100, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-RIPK1 (Rabbit polyclonal,1:100, Thermo Scientific, Waltham، MA، USA)، anti-RIPK3 (Rabbit polyclonal، 1:100، Thermo Scientific، Waltham، MA، USA)، و anti-MLKL 1 (Rabbit monoclonal، 1:100، Thermo Scientific، Waltham، MA، ایالات متحده) . پس از کونژوگه با آنتی بادی های اولیه، بخش ها با آنتی بادی ثانویه (EnVisionTM Detection System، DAKO، Agilent، USA) به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق و سپس با افزودن کروموژن DAB (EnVisionTM Detection System، DAKO، Agilent، Santa Clara، CA، انکوبه شدند. USA) و ضد رنگ آمیزی با هماتوکسیلین انجام شد. از کنترل های مثبت مناسب استفاده شد. برای کنترل منفی، آنتی بادی اولیه به بخش ها اضافه نشد. در هر دسته از اسلایدهای رنگ‌آمیزی از کنترل‌های مثبت و منفی استفاده شد (در شکل‌ها نشان داده نشده است).

برچسب گذاری ایمونوفلورسانس

مقاطع پنج میکرومتری با زایلن پارافین زدایی و با الکل درجه بندی شده هیدراته شدند. مقاطع در محلول بازیابی با pH بالا (pH 9) در حمام آب در دمای 95 درجه به مدت 20 دقیقه قرار گرفتند. سپس بخش ها با آب مقطر به مدت 5 دقیقه و سپس بافر TBST به مدت 5 دقیقه شسته شدند. سپس بخش‌ها با آنتی‌بادی ضد GAL{7} (رابیت پلی کلونال، 1:50، بیوتکنولوژی سانتا کروز، دالاس، تگزاس، ایالات متحده آمریکا)، ضد RIPK1 (خرگوش پلی کلونال، 1:50، ترمو علمی، ترمو ساینتیفیک، Waltham, MA, USA), anti-RIPK3 1 (Rabbit polyclonal,1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) و anti-MLKL 1 (Rabbit monoclonal, 1:50, Thermo Scientific، Thermo Scientific، Waltham، MA، USA) یک شب در دمای اتاق. بخش‌ها متعاقباً با آنتی‌بادی الکسا فلور 488 ضد خرگوش الاغ (آزمایشگاه‌های تحقیقات ایمنی جکسون، بار هاربر، مین، ایالات متحده آمریکا، 1:100) انکوبه شدند. در نهایت، مقاطع در محیط نصب محلول در آب DAPI (Abcam، کمبریج، MA، ایالات متحده آمریکا) سوار شدند و با میکروسکوپ فلورسنت Olympus مشاهده شدند. از بخش های کنترل مثبت مناسب استفاده شد. برای کنترل منفی، آنتی بادی اولیه به بخش ها اضافه نشد و کل روش به همان روشی که در بالا ذکر شد انجام شد. در هر دسته از اسلایدهای رنگ‌آمیزی از کنترل‌های مثبت و منفی استفاده شد (در شکل‌ها نشان داده نشده است).

تجزیه و تحلیل مورفومتریک

آنالیز مورفومتریک نکروز حاد توبولار توسط دو محقق شرکت کننده در این مطالعه انجام شد. تجزیه و تحلیل مورفومتریک کاسپاز بریده شده{0}}، PARP، RIPK1، RIPK3، MLKL، فسفو-NFK-B، Wnt-3، بتا-کاتنین شکاف شده، با استفاده از نرم افزار ImageJ انجام شد (http: //rsbweb.nih.gov/ij/). کاسپاز بریده شده-3، PARP شکافته، RIPK1، RIPK3، MLKL، فسفو-NFK-B، Wnt{12}}، بتا-کاتنین، برچسب‌گذاری با شمارش تعداد سلول‌های مثبت در انتخاب تصادفی با توان بالا تعیین شد. زمینه ها (HPF) در کلیه میانگین تعداد سلول های مثبت از هر HPF به میلی متر مربع (هر میلی متر2= 4HPF) تبدیل می شود. برای، کاسپاز بریده شده-3، PARP، RIPK1، RIPK3 و Wnt{20}} بریده شده، برچسب‌گذاری، در نظر گرفته شد.

زمانی که الگوی رنگ آمیزی سیتوپلاسمی وجود داشت مثبت بود. برای برچسب زدن MLKL، سلول ها زمانی که الگوی رنگ آمیزی غشایی و سیتوپلاسمی وجود داشت مثبت در نظر گرفته شدند. برای برچسب‌گذاری فسفو-NFK-B و بتا-کاتنین، سلول‌ها زمانی که الگوی رنگ‌آمیزی هسته‌ای وجود داشت مثبت در نظر گرفته شدند.

سنجش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم

کلیهغلظت GAL-3، کاتپسین D، کاتپسین B، کاسپاز بریده شده-3، TRAIL و FAS با استفاده از کیت توسعه سنجش ایمنی متصل به آنزیم DuoSet (ELISA) (R&D Systems، Minneapolis، MN، USA) تعیین شد. ) برای ساندویچ الایزا، با استفاده از روش استاندارد طبق دستورالعمل سازنده. غلظت PARP شکاف کلیوی با استفاده از کیت Elisa تکنولوژی سیگنالینگ سلولی (Danvers، MA، USA) برای ساندویچ Elisa، با استفاده از روش استاندارد طبق دستورالعمل سازنده تعیین شد. غلظت‌های RIPK1، RIPK3 و MLKL کلیه با استفاده از کیت‌های Elisa MyBioSource (سان دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) برای ساندویچ Elisa، با استفاده از روش استاندارد طبق دستورالعمل‌های سازنده تعیین شد. قرائت جذب در 450 نانومتر، با استفاده از یک اسپکتروفتومتر صفحه چاهی (BioTek ELx800 microplate Elisa reader, Winooski, VT, USA) انجام شد. غلظت‌های GAL{8}}، کاتپسین D، کاتپسین B، کاسپاز بریده شده-3، TRAIL، RIPK1، RIPK3، MLKL، PARP شکافته شده و FAS در نمونه‌های کلیه با درون یابی از یک منحنی استاندارد تعیین شد. سطوح به غلظت پروتئین کل نرمال شد.

تحلیل آماری

همه تجزیه و تحلیل های آماری با استفاده از نرم افزار Graph Pad Prism نسخه 5 انجام شد. مقایسه های چندگانه بین گروه های مختلف با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) و به دنبال آن آزمون های چند دامنه ای تعقیبی نیومن کیولز به دست آمد. مقایسه بین دو گروه با استفاده از آزمون t-test به دست آمد. داده ها با میانگین ± خطای استاندارد (SE) ارائه می شوند. مقادیر P < 0.05="" معنی="" دار="" در="" نظر="" گرفته="" می="">

نتایج

نکروز حاد لوله ای ناشی از سیس پلاتین

گروه وحشی تیمار شده با سیس پلاتین GAL{1}} ATN را نشان می دهد که شامل (2.392 ± 67.29 درصد) پارانشیم کلیه (شکل 1) با از دست دادن مرزهای قلم مو، تورم سلول های لوله ای، افتادن سلول های داخل لوله ای، ترشحات داخل لوله ای و میتوز است. شکل 2B و 3B).

گروه GAL{1}} KO تیمار شده با سیس پلاتین، ATN را نشان می دهد که شامل (78.54 درصد ± 0.8120) پارانشیم کلیه (شکل 1) با از دست دادن مرزهای قلم مو، تورم سلول های لوله ای، افتادن سلول های داخل لوله ای، ترشحات داخل لوله ای و میتوز (شکل 2D و 3D).

درصد ATN به طور قابل توجهی بالاتر استکلیه هادر موش‌های GAL-3 KO تیمار شده با سیس پلاتین نسبت به موش‌های وحشی GAL-3 تیمار شده با سیس پلاتین (P<0.002) (fig.="">

GAL{0}} در نکروز لوله ای حاد بیان می شود

افزایش قابل توجهی در غلظت کسر سیتوپلاسمی GAL-3 درکلیه هادر گروه وحشی GAL-3 تیمار شده با سیس پلاتین (587.3 ± 6084 pg/mg) در مقایسه با گروه کنترل وحشی GAL-3 (1620 ± 62.3 pg/mg)، (P<0.001), (fig.="" 4e).="" there="" is="" a="" significant="" increase="" in="" the="" nuclear="" fraction="" concentration="" of="" gal-3="" in="">کلیه هادر GAL-3 وحشی تیمار شده با سیس پلاتین

گروه (41.11 ± 841.8 pg/mg) در مقایسه با گروه کنترل وحشی GAL{4}} (429.2 ± 39.56 pg/mg)، (P<0.001), (fig.="" 4e).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس نمایندهکلیهدر مقایسه با موش‌های کنترل وحشی GAL{0}} در بخش‌های مختلف، در لوله‌های کلیوی تحت‌تاثیر نکروز حاد لوله‌ای (شکل 4B-D) بیان بیشتری از GAL-3 نشان داده شده است (شکل 4A).

GAL{0}} یک واسطه ضد نکروپتوز است

سرین/ترئونین-پروتئین کیناز 1 (RIPK1) با تعامل گیرنده. افزایش قابل توجهی در غلظت RIPK{4}} (3.766 ± 55.33 pg/mg) درکلیه هااز موش‌های وحشی GAL-3 تیمار شده با سیس پلاتین در مقایسه با موش‌های کنترل وحشی GAL-3 (1.687 ± 14.22 pg/mg)، (P<0.001), (fig.="" 5a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" ripk-1="" concentration="" (159.7="" ±="" 4.183="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (39.59="" ±="" 1.808="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" ripk-1="" (159.7="" ±="" 4.183="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (55.33="" ±="" 3.766="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

مقایسه چندگانه بین چهار گروه آزمایشی با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه و به دنبال آن آزمون تعقیبی نیومن-کولز از نظر آماری معنی دار بود (05/0P<>

رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمیایی برای RIPK-1 تعداد سلول‌هایی را که RIPK-1 را بیان می‌کنند به‌طور قابل‌توجهی بالاتر نشان داد.کلیه هااز موش های GAL-3 KO تیمار شده با سیس پلاتین نسبت به موش های وحشی GAL-3 تیمار شده با سیس پلاتین (P<0.001), (fig.="">

سرین/ترئونین-پروتئین کیناز 3 (RIPK3) با تعامل گیرنده. افزایش قابل توجهی در غلظت RIPK{4}} (616.4 ± 27.07 pg/mg) در کلیه موش‌های وحشی GAL تحت درمان با سیس پلاتین در مقایسه با موش‌های کنترل وحشی GAL (17.46±17.46) مشاهده شد. 7.002 pg/mg)، (P<0.001), (fig.="" 5b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" ripk-3="" concentration="" (2165="" ±="" 73.29="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (203.1="" ±="" 6.443="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" ripk-3="" (2165="" ±="" 73.29="" pg/mg)="" in="">کلیه هاموش‌های GAL{1}} KO تحت درمان با سیس پلاتین نسبت به موش‌های وحشی GAL-3 تیمار شده با سیس پلاتین (616.4 ± 27.07 pg/mg)، (P<0.001), (fig.="">

رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمیایی برای RIPK-3 تعداد سلول‌های بیان‌کننده RIPK-3 را در کلیه‌های موش‌های GAL-3 KO تحت درمان با سیس‌پلاتین به‌طور قابل‌توجهی بالاتر از موش‌های وحشی GAL-3 تحت درمان با سیس‌پلاتین نشان داد. پ<0.001), (fig.="" 7).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

شبیه به دامنه کیناز دودمان مخلوط (MLKL). افزایش قابل توجهی در غلظت MLKL (71.46 ± 1.757 pg/mg) درکلیه هاموش‌های وحشی GAL-3 تیمار شده با سیس پلاتین در مقایسه با موش‌های کنترل وحشی GAL-3 (0.5897 ± 23.3{5}} pg/mg)، (P<0.001), (fig.="" 5c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" mlkl="" concentration="" (160.3="" ±="" 6.648="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (40.30="" ±="" 1.090="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" mlkl="" (160.3="" ±="" 6.648="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (71.46="" ±="" 1.757="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5c).="" immunohistochemical="" staining="" for="" mlkl="" showed="" a="" significantly="" higher="" number="" of="" cells="" expressing="" mlkl="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice=""><0.001), (fig.="" 8).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

کاتپسین B. افزایش قابل توجهی در غلظت کاتپسین B درکلیه هاموش های وحشی GAL{1}} تیمار شده با سیس پلاتین (4.141 ± 55.79 pg/mg) در مقایسه با موش های کنترل وحشی GAL-3 (37.99 ± 1.206 pg/mg)، (P<0.05), (fig.="" 9a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cathepsin-b="" concentration="" in="">کلیه هااز موش های GAL{1}} KO تیمار شده با سیس پلاتین (9.220 ± 85.87 pg/mg در مقایسه با GAL{6}} موش های کنترل وحشی (32.81 ± 1.570 pg/mg)، (P<0.001), (fig.="" 9a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cathepsin-b="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" (85.87="" ±="" 9.220="" pg/mg="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (55.79="" ±="" 4.141="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

مقایسه چندگانه بین چهار گروه آزمایشی با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه و به دنبال آن آزمون تعقیبی نیومن-کولز از نظر آماری معنی دار بود (05/0P<>

کاتپسین-دی. افزایش قابل توجهی در غلظت کاتپسین-D درکلیه هاموش‌های وحشی GAL{1}} تیمار شده با سیس پلاتین (286.1 ± 5145 pg/mg) در مقایسه با موش‌های کنترل وحشی GAL-3 (4066 ± 107.7 pg/mg)، (P<0.05), (fig.="" 9b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cathepsin-d="" concentration="" in="">کلیه هاموش های GAL{1}} KO تیمار شده با سیس پلاتین (6695 ± 587.7 pg/mg) در مقایسه با موش GAL{5}} کنترل وحشی (3914 ± 87.51 pg/mg)، (P<0.001), (fig.="" 9b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cathepsin-d="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" (6695="" ±="" 587.7="" pg/mg)="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (4066="" ±="" 107.7="" pg/mg),=""><0.01), (fig.="">

مقایسه چندگانه بین چهار گروه آزمایشی با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه و به دنبال آن آزمون تعقیبی نیومن-کولز از نظر آماری معنی دار بود (05/0P<>

GAL{0}} یک واسطه ضد آپوپتوز است

کاسپاز بریده شده-3. افزایش قابل توجهی در غلظت کاسپاز بریده شده (4665 ± 330.9 pg/mg) درکلیه هااز موش‌های وحشی GAL-3 تیمار شده با سیس پلاتین در مقایسه با موش‌های کنترل وحشی GAL-3 (3193 ± 75.30 pg/mg)، (P<0.05), (fig.="" 10a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" caspase-3="" concentration="" (6319="" ±="" 686="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (3022="" ±="" 78.57="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" caspase-3="" (6319="" ±="" 686="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (4665="" ±="" 330.9="" pg/mg),=""><0.01), (fig.="" 10a).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمیایی برای کاسپاز شکافته{0}} تعداد سلول‌های آپوپتوتیک به‌طور قابل‌توجهی در کلیه موش‌های GAL-3 KO تحت درمان با سیس‌پلاتین نسبت به موش‌های وحشی GAL{4}} تیمار شده با سیس‌پلاتین به‌طور معنی‌داری بیشتر بود (P<0.001), (fig.="" 11="" a,="" c,="" i).cleaved="">

PARP قطع شد. افزایش قابل توجهی در غلظت Cleaved PARP (pg/mg 56.97 ± 1446) درکلیه هااز موش‌های وحشی GAL-3 تیمار شده با سیس پلاتین در مقایسه با موش‌های کنترل وحشی GAL-3 (171.5 ± 3.926 pg/mg)، (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" parp="" concentration="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (236.1="" ±="" 11.86="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" parp="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (1446="" ±="" 56.97="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمیایی برای PARP شکافته شده تعداد سلول‌های مثبت به طور قابل‌توجهی در کلیه موش‌های GAL{1}} KO تیمار شده با سیس پلاتین نسبت به موش‌های وحشی GAL{3}} تیمار شده با سیس پلاتین نشان داد (P<0.001), (fig.="" 11="" e,="" g,="">

لیگاند القا کننده آپوپتوز مرتبط با TNF (TRAIL). افزایش قابل توجهی در غلظت TRAIL (4.748 ± 120.9 pg/mg) درکلیه هاموش‌های وحشی GAL-3 تیمار شده با سیس پلاتین در مقایسه با موش‌های کنترل وحشی GAL-3 (2.879 ± 14/2 pg/mg 86)، (P<0.05), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" trail="" concentration="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (82.77="" ±="" 3.881="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" trail="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (120.9="" ±="" 4.748="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمیایی برای کاسپاز شکافته{0}} تعداد سلول‌های آپوپتوز به‌طور قابل‌توجهی را درکلیه هااز موش های GAL-3 KO تیمار شده با سیس پلاتین نسبت به موش های وحشی GAL-3 تیمار شده با سیس پلاتین (P<0.001), (fig.="" 11="" a,="" c,="">

PARP قطع شد. افزایش قابل توجهی در غلظت Cleaved PARP (97/56 ± 1446 pg/mg) در کلیه موش‌های وحشی GAL{4}} تیمار شده با سیس پلاتین در مقایسه با موش‌های کنترل وحشی GAL (926/3 ± 5/171 pg/) مشاهده شد. میلی گرم)، (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" parp="" concentration="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="">کلیه هاموش‌های GAL{1}} KO تحت درمان با سیس پلاتین در مقایسه با موش‌های کنترل GAL-3 KO (236.1 ± 11. 86 pg/mg)، (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" parp="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (1446="" ±="" 56.97="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی برای PARP شکاف یافته تعداد سلول های مثبت به طور قابل توجهی بالاتری را نشان داد.کلیه هااز موش های GAL-3 KO تیمار شده با سیس پلاتین نسبت به موش های وحشی GAL-3 تیمار شده با سیس پلاتین (P<0.001), (fig.="" 11="" e,="" g,="">

لیگاند القا کننده آپوپتوز مرتبط با TNF (TRAIL). افزایش قابل توجهی در غلظت TRAIL (4.748 ± 120.9 pg/mg) در کلیه موش‌های وحشی GAL{7}} تیمار شده با سیس پلاتین در مقایسه با موش‌های کنترل وحشی GAL-3 ({9}}.14) مشاهده شد. 2.879 ± pg/mg)، (P<0.05), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" trail="" concentration="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (82.77="" ±="" 3.881="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" trail="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="">کلیه هاموش‌های KO GAL-3 تیمار شده با سیس پلاتین نسبت به موش‌های وحشی GAL-3 تیمار شده با سیس پلاتین (4.748 ± 120.9 pg/mg)، (P<0.001), (fig.="" 10c).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

افسانه FAS.افزایش قابل توجهی در غلظت FAS (6.395 ± 332.5 pg/mg) درکلیه هااز موش‌های وحشی GAL-3 تیمار شده با سیس پلاتین در مقایسه با موش‌های کنترل وحشی GAL-3 (77.72 ± 2.805 pg/mg)، (P<0.001), (fig.="" 10d).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" fas="" concentration="" (387.9="" ±="" 8.520="" pg/mg)="" in="" the="">کلیه هااز موش‌های GAL-3 KO تیمار شده با سیس پلاتین در مقایسه با موش‌های کنترل GAL-3 KO (3.597 ± 134.1 pg/mg)، (P<0.001), (fig.="" 10d).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" fas="" (387.9="" ±="" 8.520="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (332.5="" ±="" 6.395="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

مقایسه چندگانه بین چهار گروه آزمایشی با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه و به دنبال آن آزمون تعقیبی نیومن-کولز از نظر آماری معنی دار بود (05/0P<>

سیگنال‌های GAL-3 و prosurvival

NF-kB.رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمیایی فسفر-NF-kB تعداد سلول‌های رنگ‌آمیزی شده با فسفر-NF-kB را به طور قابل‌توجهی نشان داد.کلیه هااز موش‌های وحشی GAL-3 تیمار شده با سیس پلاتین نسبت به موش‌های GAL-3 KO تحت درمان با سیس پلاتین (P<0.001), (fig.="" 12="">

بتا کاتنین.رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمیایی برای بتا-کاتنین تعداد سلول های رنگ آمیزی شده با بتا-کاتنین را به طور قابل توجهی نشان داد.کلیه هااز موش‌های وحشی GAL-3 تیمار شده با سیس پلاتین نسبت به موش‌های GAL-3 KO تحت درمان با سیس پلاتین (P<0.001), (fig.="" 12="">

Wnt-3a.رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمیایی برای Wnt-3a تعداد سلول‌های رنگ‌آمیزی شده با Wnt-3a را در کلیه‌های موش‌های وحشی GAL-3 تحت درمان با سیس‌پلاتین به‌طور قابل‌توجهی بیشتر از GAL تیمار شده با سیس‌پلاتین نشان داد-3 موش های KO (P<0.001), (fig.="" 12="">

اوره پلاسماافزایش قابل توجهی در غلظت اوره پلاسما (23.88 ± 6.715mmol/L) در موش‌های وحشی GAL{5}} تحت درمان با سیس پلاتین در مقایسه با موش‌های کنترل وحشی GAL-3 (0 ± 6.688) مشاهده شد. 6066 میلی مول در لیتر)، (P<0.001), (fig.="" 13a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" plasma="" urea="" concentration="" (36.10="" ±="" 2.878="" mmol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (8.331="" ±="" 0.5194="" mmol/l),=""><0.001), (fig.="" 13a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" plasma="" urea="" concentration="" (36.10="" ±="" 2.878="" mmol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (23.88="" ±="" 6.715mmol/l),=""><0.001), (fig.="">

مقایسه چندگانه بین چهار گروه آزمایشی با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه و به دنبال آن آزمون تعقیبی نیومن-کولز از نظر آماری معنی دار بود (05/0P<>

کراتینین پلاسما

افزایش قابل توجهی در غلظت کراتینین پلاسما (48.42 ± 3.992 میکرومول در لیتر) در موش های وحشی GAL{5}} تحت درمان با سیس پلاتین در مقایسه با موش های کنترل وحشی GAL-3 (0 ± 13.27) مشاهده شد. 3106 umol/L)، (P<0.001), (fig.="" 13b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" plasma="" creatinine="" concentration="" (62.36="" ±="" 3.605="" umol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (13.88="" ±="" 0.4183="" umol/l),=""><0.001), (fig.="" 13b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" plasma="" creatinine="" concentration="" (62.36="" ±="" 3.605="" umol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (48.42="" ±="" 3.992="" umol/l),=""><0.01), (fig.="" 13b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

بحث

حادکلیهآسیب یک مشکل بهداشتی رایج در سراسر جهان است. هر سال حدود 13.3 میلیون مورد حاد وجود داردکلیهآسیب (AKI). باری که به ویژه در کشورهای نوظهور در حال افزایش است [21]. در سراسر جهان، سالانه 1.7 میلیون مرگ ناشی از AKI وجود دارد. از این تعداد، حدود 1.4 میلیون در کشورهای با درآمد کم و متوسط ​​رخ می دهد [21]. AKI اغلب قابل پیشگیری و درمان است و تنها با چند عواقب سلامتی درازمدت قابل درمان است. شناسایی مکانیسم‌های اصلی و بازیگرانی که در توسعه AKI مشارکت دارند، بر بهبود مراقبت از بیماران و به حداقل رساندن مرگ‌ومیر و عوارض منعکس خواهد شد.

ما افزایش قابل توجهی در غلظت GAL-3 نشان داده‌ایمکلیه هاتحت AKI قرار گرفتند. ما همچنین بیان بیشتری از GAL-3 را در توبول‌های کلیوی متاثر از نکروز حاد توبولار در موش‌های وحشی GAL-3 تحت درمان با سیس پلاتین نسبت به لوله‌های کلیوی در گروه کنترل تحت درمان با نمک نشان داده‌ایم. هر دو غلظت سیتوپلاسمی و هسته‌ای GAL{4}} در مقایسه با موش‌های تحت درمان با نمک در لوله‌های کلیوی به دنبال ATN به طور قابل‌توجهی افزایش می‌یابد. افزایش سطح GAL-3 در لوله های کلیوی آسیب دیده، GAL-3 را به عنوان یک بازیکن مهم در ATN نشان می دهد.

ما همچنین از موش‌های GAL-3 KO برای بررسی نقش مکانیکی GAL-3 در ATN استفاده کرده‌ایم. این به ما کمک می کند تا از نزدیک به مدولاسیون های پروتئین های pro-apoptotic، pro-necroptotic و prosurvival در حضور و عدم حضور GAL-3 نگاه کنیم و تعیین کنیم که آیا GAL-3 بر این تغییرات تأثیر دارد یا خیر. .

ما درصد بیشتری از لوله‌های تحت‌تأثیر ATN را در موش‌های GAL-3 KO تحت درمان با سیس‌پلاتین نسبت به موش‌های وحشی GAL-3 تحت درمان با سیس‌پلاتین نشان داده‌ایم. نتایج ما همچنین افزایش قابل توجهی در کاتپسین B و کاتپسین D در کلیه های تحت تاثیر ATN نشان داده است. علاوه بر این، سطوح کاتپسین B و کاتپسین D به طور قابل توجهی بالاتر استکلیه هاموش های GAL-3 KO تحت درمان با سیس پلاتین نسبت به موش های وحشی GAL-3 تحت درمان با سیس پلاتین. کاتپسین ها نقش مهمی در مسیرهای سیگنال دهی که منجر به مرگ سلولی آپوپتوتیک و نکروزه می شوند، با تخریب بسترهای مختلف و/یا کمک به بی ثباتی میتوکندری ایفا می کنند [22]. پروتئازهای لیزوزومی، کاتپسین B و کاتپسین D به وفور در کلیه ها بیان می شوند [23].

کاتپسین B، یک سیستئین پروتئیناز که فعالیت بهینه در محیط اسیدی دارد، در بسیاری از فرآیندهای فیزیولوژیکی و پاتولوژیک شرکت می کند. پروتئین ها و آنزیم های ساختاری سلول را هضم می کند، عناصر اصلی غشای پایه را تجزیه می کند و پروآنزیم ها، هورمون ها و فاکتورهای رشد را فعال می کند [24]. افزایش سطح بیان و فعال شدن کاتپسین B در رده سلولی اپیتلیال لوله‌ای پروگزیمال انسان HK{1}} که تحت آپوپتوز قرار می‌گیرد، مشاهده شده است [25].

کاتپسین D به طور قابل توجهی در سلول های لوله پروگزیمال بیان می شود. کاتپسین D یک پروتئاز آسپارتیک لیزوزومی کلیدی است که مسئول تخریب پروتئین ها و اندامک ها توسط اتوفاژی-لیزوزومی و همچنین در طی نکروز سلولی و پارگی غشای لیزوزومی است [26]. کاتپسین D به طور قابل توجهی در لوله های آسیب دیده به دنبال آسیب ایسکمی کلیوی/آسیب خونرسانی مجدد افزایش یافته است که از یافته ما در مورد افزایش قابل توجه کاتپسین D درکلیه هابا نکروز حاد لوله ای [27].

سطوح بالاتر کاتپسین B و D با درصد بالاتر ATN درکلیه هاموش‌های GAL-3 KO تحت درمان با سیس پلاتین نسبت به موش‌های وحشی GAL-3 تحت درمان با سیس‌پلاتین، GAL-3 را به‌عنوان یک واسطه ضد نکروز پیشنهاد می‌کنند.

ما همچنین سطوح بالاتری از پروتئین‌های نکروپتوز را نشان داده‌ایم. RIPK1، RIPK3، و MLKL درکلیه هاموش های تحت درمان با سیس پلاتین علاوه بر این، ما غلظت قابل توجهی بالاتری از RIPK1، RIPK3 و MLKL را در کلیه موش‌های GAL{4}} KO تحت درمان با سیس پلاتین نسبت به موش‌های وحشی GAL-3 تحت درمان با سیس پلاتین شناسایی کرده‌ایم.

مطالعات نشان داده اند که سیس پلاتین با افزایش استرس اکسیداتیو مرتبط است [28]. تولید گونه های فعال اکسیژن (ROS)، تجمع محصولات پراکسیداسیون لیپیدی درکلیه هاتصور می شود که سیستم های آنتی اکسیدانی سرکوب شده مکانیسم های اصلی AKI ناشی از سیس پلاتین هستند [29]. در داخل سلول، سیس پلاتین به شکل بسیار واکنش پذیر تبدیل می شود که به سرعت با مولکول های آنتی اکسیدانی حاوی تیول مانند گلوتاتیون واکنش نشان می دهد [30]. سیس پلاتین همچنین ممکن است باعث اختلال در عملکرد میتوکندری و افزایش تولید ROS از طریق یک زنجیره تنفسی مختل شود [31]. ROS اتوفسفوریلاسیون RIPK1 را تسهیل می کند و جذب RIPK{6}} و تشکیل نکروزوم را ترویج می کند [32]. علاوه بر این، ROS یک محرک حیاتی برای نفوذپذیری غشای لیزوزومی (LMP) است [33].

کای و همکاران [34] نشان داده اند که LMP با واسطه ROS در القای نکروپتوز در سلول های دیسک بین مهره ای خرگوش نقش دارد. به همین ترتیب، تولید میتوکندری-ROS ناشی از RIPK با LMP و اختلال عملکرد میتوکندری در نتیجه یک حلقه بازخورد مثبت بین Ca2 plus و JNK که منجر به نکروپتوز سلول‌های A549 و H1299 می‌شود، دنبال می‌شود [35، 36].

علاوه بر این، نشان داده شده است که RIPK3 تنظیم‌شده در نکروپتوز باعث ایجاد استرس شبکه آندوپلاسمی می‌شود که غلظت Ca2 سلولی و بیان گزانتین اکسیداز را افزایش می‌دهد که منجر به افزایش تولید ROS می‌شود [37].

کاتپسین های B و D محتویات عملکردی اصلی آزاد شده از لیزوزوم ها با افزایش LMP در طول فرآیند مرگ سلولی هستند [34]. فعال شدن کاتپسین B و D می تواند مسیر نکروپتوز را افزایش دهد [38]. بنابراین نکروپتوز را می توان به روشی مستقل از گیرنده القا کرد [39]. علاوه بر این، گزارش‌ها نشان داده‌اند که محرک‌های اضافی، غیر از ROS، کاتپسین B و D، برای القای نکروپتوز وجود دارد که شامل تنظیم افزایشی TRAIL و پروتئین‌های افسانه‌ای FAS می‌شود [40]. بنابراین افزایش ROS چه به دلیل سیس پلاتین یا القای RIPK1 یا RIPK3 می تواند منجر به افزایش LMP و آزادسازی کاتپسین B و D شود که به نوبه خود باعث افزایش نکروپتوز می شود. به همین ترتیب، افزایش ROS می تواند RIPK1 را فعال کند، جذب RIPK3، افزایش تشکیل نکروزوم، فسفوریلاسیون MLKL، انتقال MLKL فسفریله شده به غشای سلولی که منجر به مرگ سلولی نکروزه از طریق نفوذپذیری غشای پلاسمایی و پارگی می شود.

در این مطالعه، ما معتقدیم که افزایش ROS، کاتپسین B، کاتپسین D، TRAIL و FAS در القای نکروپتوز در ATN نقش دارند.

برای تعیین نقش GAL{0}} در نکروپتوز، غلظت‌های RIPK1، RIPk3 و MLKL را در حضور و عدم حضور GAL{3}} با استفاده از GAL{4}} wild و GAL اندازه‌گیری کردیم. }} موش KO.

غلظت قابل توجهی بالاتر RIPK1، RIPK3 و MLKL در موش های GAL{3}} KO تحت درمان با سیس پلاتین نسبت به موش های GAL{5}} تیمار شده با سیس پلاتین نشان می دهد که حذف GAL-3 با افزایش قابل توجه پروتئین های نکروپتوز، نشان دهنده نقش ضد نکروپتوز GAL{9}} است.

علاوه بر این، ما سطوح قابل توجهی بالاتری از پروتئین های پرو آپوپتوز را نشان داده ایم. شکاف کاسپاز-3، شکاف PARP، TRAIL، FAS، و اجسام آپوپتوز درکلیه هادنبال ATN.

در طول ATN، نفوذپذیری غشای لیزوزومی امکان انتقال کاتپسین D و کاتپسین B را از لیزوزوم به سیتوزول فراهم می‌کند، جایی که می‌تواند عملکرد پرو آپوپتوز خود را اعمال کند. کاتپسین سیتوزولی D پروتئین Bid را به tBid می شکند و باعث وارد شدن پروتئین Bax به غشای میتوکندری می شود. این منجر به آزاد شدن سیتوکروم c از میتوکندری به داخل سیتوزول و فعال شدن پروکاسپازهای 9 و 3 می شود [41]. در این مطالعه، هم رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس و هم غلظت پروتئین بیانگر به‌طور قابل‌توجهی بیانگر GAL درون سلولی، هر دو بخش سیتوپلاسمی و هسته‌ای، در ATN درکلیه هااز GAL-3 موش‌های وحشی در مقایسه با موش‌های کنترل.

بنابراین سطوح بالاتر پروتئین های پرو آپوپتوز. شکاف کاسپاز-3، TRAIL، FAS، و اجسام آپوپتوز درکلیه هاموش‌های GAL-3 KO تحت درمان با سیس پلاتین نسبت به موش‌های وحشی تحت درمان با سیس پلاتین، نقش ضد آپوپتوز GAL-3 را نشان می‌دهند. مشخص شده است که GAL{6}} بسته به محل قرارگیری درون سلولی آن، به شدت در آپوپتوز نقش دارد. مطالعات نشان داده اند که GAL داخل سلولی-3 می تواند آپوپتوز [42-44] را مهار کند. در حمایت از نقش ضد آپوپتوزی GAL{10}}، تعداد قابل توجهی سلول‌هایی را شناسایی کرده‌ایم که پروتئین‌های فسفو-NF-kB، بتا-کاتنین و Wnt را در کلیه‌های GAL تیمار شده با سیس پلاتین بیان می‌کنند{15} } موش وحشی نسبت به موش GAL{16}} KO. NF-kB یک فاکتور رونویسی است که نقش مهمی در تنظیم التهاب، تکثیر سلولی و بقای سلول دارد. فسفوریلاسیون نقش مهمی در فعال سازی NF-kB در پایین دست همه این محرک ها دارد [45]. NF-kB در حال حاضر به عنوان یک عامل مهم در بقای سلول و محافظت در برابر آپوپتوز شناخته شده است [46]. نشان داده شده است که پروتئین‌های Wnt از طریق عملکرد ضد آپوپتوز خود از طریق فعال‌سازی -catenin و c-Myc روی سلول‌های آسیب‌دیده اثرات محافظتی دارند [47].

وو و همکاران همچنین افزایش قابل توجهی در p-NF-kB درکلیه هابا ATN [48]. وانگ و همکاران همچنین افزایش تنظیم مسیر سیگنالینگ Wnt/-catenin را در آسیب حاد کلیه نشان داده‌اند [49]. مطالعات نشان داده‌اند که NF-kB در القای GAL{5}} [50] و همچنین GAL{7}} در فعال‌سازی NF-kB نقش دارد [51]. جالب اینجاست که GAL{10}} یک شریک جدید اتصال -catenin است [52].

این یافته‌ها نشان می‌دهند که نقش ضد آپوپتوز GAL{1}} می‌تواند از طریق فعال‌سازی مسیرهای NF-kB و Wnt/-catenin نیز واسطه شود. به نظر می‌رسد که GAL{4}} این مسیرهای انتقال سیگنال طرفدار بقا را که در مطالعه ما بررسی شده‌اند، مرتبط می‌کند. این مسیرها همچنین در سطوح مختلف بین آنها گفتگوی متقابل دارند. بازیکنان مسیر Wnt/-catenin بسیاری از اثرات خود را از طریق تعامل با NF-kB تعدیل می کنند و متقابلاً NF-kB نیز بر مسیر سیگنالینگ Wnt/-catenin تأثیر می گذارد [53]. بنابراین، قابل درک است که GAL{12}} نقش اتصال دهنده مرکزی را در مسیرهای انتقال سیگنال prosurvival ایفا می کند.

مطالعه ما نشان می‌دهد که وجود یا عدم وجود GAL درون سلولی با تغییرات قابل‌توجهی در پروتئین‌های پروآپوپتوز، پرونکروپتوتیک و پیش‌بقا در ATN القا شده با سیس پلاتین مرتبط است و سطح بالای GAL-3 در لوله‌های کلیوی است. میانجیگری یک محیط ضد آپوپتوز، ضد نکروپتوز و پیش از بقا که ممکن است روند آینده بیماری را شکل دهد. این نشان دهنده نقش محافظتی برای GAL{4}} در ATN حاد ناشی از سیس پلاتین است که توسط سطوح پلاسمایی اوره و کراتینین به میزان قابل توجهی در موش‌های تحت درمان با سیس پلاتین وحشی نسبت به GAL پشتیبانی می‌شود. موش های تحت درمان با سیس پلاتین KO (شکل 13).

نتیجه

GAL{0}} می‌تواند از طریق برهمکنش با پروتئین‌های نکروپتوز، آپوپتوز و پرو-بقا در لوله‌های کلیوی در طی نکروز حاد لوله‌ای ناشی از سیس پلاتین، بر بقا و مرگ سلولی تأثیر بگذارد.

قدردانی

مشارکت های نویسنده

همه نویسندگان نسخه ارسال شده نسخه خطی را بررسی و تایید کردند. SA مفهوم را معرفی کرد، مطالعه را طراحی کرد، داده ها را تجزیه و تحلیل و تفسیر کرد، ارقام را طراحی کرد و مقاله نوشت. GJ آزمایش‌های حیوانی و تکنیک الایزا را انجام داد، MS رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی و ایمونوفلورسانس و پردازش بافت مرتبط را انجام داد. HT آزمایشات حیوانی و روش الایزا را انجام داد. JY تجزیه و تحلیل بیوشیمیایی عملکرد کلیه را انجام داد و داده های به دست آمده را ارسال کرد.

بیانیه افشا

نویسندگان اعلام می کنند که هیچ منافع رقیب ندارند.

منابع

1 Lameire NH، Bagga A، Cruz D، De Maeseneer J، Endre Z، Kellum JA، Liu KD، Mehta RL، Pannu N، Van Biesen W، Vanholder R: آسیب حاد کلیه: یک نگرانی جهانی فزاینده. Lancet 2013؛ 382: 170-179.

2 KDIGO: راهنمای عمل بالینی برای آسیب حاد کلیه. Kidney Int 2012؛ 2:1-138.

3 شومر ام، کلمبل MC، ساوکزوک IS، گلوب جی، کانر جی، اوتول KM، اولسون CA، وایز GJ، بوتیان آر: شواهد مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی آپوپتوز در مرحله خونرسانی مجدد پس از دوره های کوتاه ایسکمی کلیوی Am J Pathol 1992؛ 140: 831-838.

4 Schumer AT، Davies DR، McLaren AJ، Cerundolo L، Morris PJ، Fuggle SV: آپوپتوز در آسیب ایسکمی/پرفیوژن مجدد آلوگرافت های کلیوی انسانی. پیوند 1998؛ 66: 872-876.

5 Degterev A، Huang Z، Boyce M، Li Y، Jagtap P، Mizushima N، Cuny GD، Mitchison TJ، Moskowitz MA، Yuan J: بازدارنده شیمیایی مرگ سلولی غیر آپوپتوز با پتانسیل درمانی برای آسیب مغزی ایسکمیک. Nat Chem Biol 2005؛ 1:112-119.

6 Vandenabeele P، Galluzzi L، Vanden Berghe T، Kroemer G: مکانیسم‌های مولکولی نکروپتوز: یک انفجار سلولی منظم. Nat Rev Mol Cell Biol 2010؛ 11:700-714.

7 Chen X، Li W، Ren J، Huang D، He WT، Song Y، Yang C، Li W، Zheng X، Chen P، Han J: انتقال پروتئین شبیه به دامنه کیناز دودمان مخلوط به غشای پلاسما منجر به سلول نکروز می شود. مرگ. Cell Res 2014؛ 24:105-121.

8 Cai Z، Jitkaew S، Zhao J، Chiang HC، Choksi S، Liu J، Ward Y، Wu LG، Liu ZG: انتقال غشای پلاسمایی پروتئین MLKL trimerized برای نکروپتوز ناشی از TNF مورد نیاز است. Nat Cell Biol 2014؛ 16:55-65.

9 Wang Y، Liu Y، Liu Y، Zhou W، Wang H، Wan G، Sun D، Zhang N، Wang Y: یک پیش داروی پلیمری سیس پلاتین مبتنی بر پولولان برای درمان هدفمند در برابر سرطان کبد. Int J Pharm 2015؛ 483:89-100.

10 Pablo N، Dong Z: سمیت کلیوی سیس پلاتین: مکانیسم‌ها و استراتژی‌های محافظت مجدد. کلیه Int 2008؛ 73:994-1007.

11 Mi XJ، Hou JG، Wang Z، Han Y، Ren S، Hu JN، Chen C، Li W: اثرات محافظتی مالتول بر سمیت کلیوی ناشی از سیس پلاتین از طریق مسیرهای سیگنالینگ PI3K/Akt و p53 با واسطه AMPK. Sci Rep 2018; 8:15922.

12 Ozkok A، Edelstein CL: پاتوفیزیولوژی آسیب حاد کلیه ناشی از سیس پلاتین. Biomed Res Int 2014؛ 2014: 1-17.

13 Hughes RC: ترشح خانواده گالکتین از پروتئین‌های اتصال به کربوهیدرات پستانداران. Biochim Biophys Acta 1999؛ 1473: 172-185.

14 Liu FT، Patterson RJ، Wang JL: عملکردهای درون سلولی گالکتین ها. Biochim Biophys Acta 2002؛ 1572: 263- 273.

15 van den Brûle FA, Waltregny D, Liu FT, Castronovo V: تغییر الگوی بیان سیتوپلاسمی/هسته ای گالکتین-3 با پیشرفت کارسینوم پروستات ارتباط دارد. Int J Cancer 2000؛ 89: 361-367.

16 Xue J، Gao X، Fu C، Cong Z، Jiang H، Wang W، Chen T، Wei Q، Qin C: تنظیم آپوپتوز گالکتین-3-القای آپوپتوز سلول های Jurkat توسط O-گلیکان ها و N-گلیکان ها روی CD45. FEBS Lett 2013; 587:3986-3994.

17 Matarrese P، Fusco O، Tinari N، Natoli C، Liu FT، Semeraro ML، Malorni W، Iacobelli S: بیان بیش از حد گالکتین-3 با بهبود خواص چسبندگی سلولی از آپوپتوز محافظت می کند. Int J Cancer 2000؛ 85: ​​545- 554.

18 Oka N، Nakahara S، Takenaka Y، Fukumori T، Hogan V، Kanayama HO، Yanagawa T، Raz A: گالکتین-3 با فعال کردن Akt در مثانه انسان، آپوپتوز ناشی از لیگاندهای القا کننده آپوپتوز مرتبط با فاکتور نکروز تومور را مهار می کند. سلول های سرطانی Cancer Res 2005؛ 65:7546-7553.

19 هاشمی س، السلام س: گالکتین{2}} در میوکارد خیلی زود پس از انفارکتوس میوکارد بیان می شود. قلب و عروق 2015؛ 24:213-223.

20 Zhang S، Li R، Dong W، Yang H، Zhang L، Chen Y، Wang W، Li C، Wu Y، Ye Z، Zhao X، Li Z، Zhang M، Liu S، Liang X: RIPK3 واسطه توبولار کلیه است آپوپتوز سلول های اپیتلیال در آسیب حاد کلیه ناشی از اندوتوکسین - سایپرز، باشگاه دانش Mol Med Rep 2019; 20:1613-1620.

21 Liyanage T، Ninomiya T، Jha V، Neal B، Patrice HM، Okpechi I، Zhao MH، Lv J، Garg AX، Knight J، Rodgers A، Gallagher M، Kotwal S، Cass A، Perkovic V: دسترسی جهانی به درمان برای مرحله نهایی بیماری کلیه: یک بررسی سیستماتیک Lancet 2015؛ 385: 1975-1982.

22 Turk B، Stoka V: سیگنال دهی پروتئاز در مرگ سلولی: کاسپازها در مقابل کاتپسین های سیستئین. FEBS Lett 2007؛ 581:2761-2767.

23 Pavlock GS، Southard JH، Starling JR، Belzer FO: انتشار آنزیم لیزوزومی در کلیه های سگ پرفیوژن زیر پوست. Cryobiology 1984؛ 21: 521-528.

24 Werle B, Jülke B, Lah T, Spiess E, Ebert W: کسر کاتپسین B فعال در pH فیزیولوژیکی 7.5 در کارسینوم سلول سنگفرشی ریه انسان دارای اهمیت پیش آگهی است. Br J Cancer 1997؛ 75: 1137-1143.

25 Wang C, Jiang Z, Yao J, Wu X, Sun L, Liu C, Duan W, Yan M, Sun L, Liu J, Zhang L: مشارکت کاتپسین B در آپوپتوز ناشی از emodin در HK-2 سلول ها. Toxicol Lett 2008؛ 181:196-204.

26 سوزوکی C، تانیدا I، اوهمورایا ام، اولیوا ترجو JA، کاکوتا اس، سونابوری تی، اوچیاما Y: کمبود کاتپسین D در سلول‌های لوله‌ای پروگزیمال کلیه منجر به افزایش حساسیت در برابر آسیب ایسکمی کلیوی/آسیب خونرسانی مجدد شد. Int J Mol Sci 2019; 20:1711.

27 Lameire N، Van Biesen W، Vanholder R. نارسایی حاد کلیه. Lancet 2005؛ 365: 417-430.

28 Yu W, Chen Y, Dubrulle J, Stassi F, Putluri V, Sreekumar A, Putluri N, Baluya D, Lai SY, Sandulache VC: سیس پلاتین استرس اکسیداتیو ایجاد می کند که با تغییرات سریع در متابولیسم کربن مرکزی همراه است. Sci Rep 2018; 8:4306.

29 Aydinoz S، Uzun H، Cermiketal G: اثرات دوزهای مختلف اکسیژن هیپرباریک بر سمیت کلیوی ناشی از سیس پلاتین. نارسایی کلیه 2007؛ 29:257-263.

30 Siddik ZH: سیس پلاتین: نحوه عملکرد سیتوتوکسیک و اساس مولکولی مقاومت. Oncogene 2003؛ 22:7265-7279.