علت بیماری کلیه پلی کیستیک

برای اطلاعات بیشتر:ali.ma@wecistanche.com

بیان بیش از حد PKD1 باعث بیماری کلیه پلی کیستیک می شود

کارولین تیویرژ، آلمیرا کوربیگوویچ، مارتین کویار، ریچارد گیوم، اولیویه کوته و ماری ترود

مکانیسم های پاتوژنتیک زیربناییاتوزومال غالببیماری کلیه پلی‌کیستیک(ADPKD) باید روشن شود. در حالی که شواهدی وجود دارد که Pkd1(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)نارسایی هاپلو ژن و از دست دادن هتروزیگوسیتی می تواند باعث تشکیل کیست در موش ها شود که به طور متناقضی سطوح بالای Pkd1 (بیماری کلیه پلی کیستیک 1بیان در کلیه های ADPKD شناسایی شده است (اتوزومال غالببیماری کلیه پلی‌کیستیک) بیماران. برای تعیین اینکه آیا Pkd1(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)افزایش عملکرد می تواند یک فرآیند پاتوژنتیک باشد، یک کروموزوم مصنوعی باکتریایی Pkd1 (Pkd1-BAC) با نوترکیبی همولوگ اصلاح شد تا صرفاً یک بیان پایدار Pkd1 را ترجیحاً برای کلیه بزرگسالان هدف قرار دهد، چندین خط تراریخته تولید شد که به طور خاص بیانگر بیش از حد بود. تراریخته Pkdl در کلیه ها 2- تا 15-برابر سطوح درون زا Pkd1 برابر است. همه موش‌های تراریخته به‌طور تکرارپذیر دچار هزینه‌های لوله‌ای و گلومرولی و نارسایی کلیوی شدند و بر اثر نارسایی کلیوی مردند. این مدل نشان می دهد که بیان بیش از حد Pkd1 نوع وحشی به تنهایی برای تحریک سیستوژنز مشابه ADPKD انسان کافی است. (اتوزومال غالببیماری کلیه پلی‌کیستیک). نتایج ما همچنین افزایش قابل توجه بیان c-myc کلیوی را در موش از تمام خطوط تراریخته نشان داد، که نشان می دهد که c-myc در داخل بدن عامل پایین دست Pkd1 حیاتی است.(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)Dathwavs مولکولی، این مطالعه نه تنها یک PKD ارزشمند و برای اولین بار تولید کرد(بیماری کلیه پلی‌کیستیک)مدلی برای ارزیابی پاتوژنز مولکولی و درمان‌ها، اما همچنین شواهدی ارائه می‌کند که افزایش عملکرد می‌تواند یک مکانیسم بیماری‌زایی در ADPKD باشد. (اتوزومال غالببیماری کلیه پلی‌کیستیک).

برای بیماری کلیوی روی Cistanche کلیک کنید

اتوزومال غالببیماری کلیه پلی‌کیستیک(ADPKD) یکی از شایع ترین بیماری های ژنتیکی در انسان است. مشخصه آن ایجاد پیشرونده کیست های متعدد کلیه است که تمام بخش های نفرون را تحت تاثیر قرار می دهد. سایر تظاهرات شامل تشکیل کیست در کبد و لوزالمعده و همچنین آنوریسم داخل جمجمه و نقص قلبی عروقی است. ADPKD (اتوزومال غالببیماری کلیه پلی‌کیستیک)معمولاً منجر به نارسایی کلیه با پیشرفت به مرحله نهایی بیماری کلیوی در اواخر میانسالی می شود.

تقریباً 85 درصد ADPKD (اتوزومال غالببیماری کلیه پلی‌کیستیک)موارد با جهش در PKD1 همراه است(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)ژن این PKD1(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)ژن بزرگ است، 54 کیلوبایت را پوشش می دهد و از 46 اگزون تشکیل شده است. این یک رونوشت 14.{3}} کیلوبایتی تولید می‌کند و یک 302-پروتئین اسید آمینه به نام پلی سیستین-1 (4، 9-11) 4. را کد می‌کند. بیان PKD1 انسانی و پلی سیستین{11}} در نرمال و ADPKD آنالیز شده است (اتوزومال غالببیماری کلیه پلی‌کیستیک)کلیه ها. در طول رشد کلیه، پلی سیستین{0}} به آسانی در سلول های اپیتلیال گلومرولی و لوله ای تشخیص داده می شود (در مرجع 37 و منابع موجود در آن بررسی شده است). در بزرگسالان عادی، ما و دیگران نشان داده ایم که PKD1(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)RNA و پروتئین در سطوح متوسط ​​تا پایین در لوله‌های جمع‌کننده و دیستال بیان می‌شوند، در حالی که سطوح در ADPKD (~{0}} برابر) افزایش یافته است. (اتوزومال غالببیماری کلیه پلی‌کیستیک)کلیه ها (22، 39). جالب توجه است که بیان مداوم یا افزایش یافته پلی سیستین{2}} در اکثر کیست های اپیتلیال کلیه تشخیص داده می شود، اگرچه رنگ آمیزی در اقلیت قابل توجهی از کیست ها وجود نداشت (29). علاوه بر کلیه ها، PKD1(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)بیان به طور معمول در سایر بافت های بالغ، از جمله انواع سلول های اپیتلیال و غیر اپیتلیال گسترده است (6،14،18،29،30،39).

بیش از 200 PKD1 مختلف(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)جهش‌ها شرح داده شده‌اند که بیشتر آنها جهش‌های حذف-درج، تغییر قاب یا جهش‌های بی معنی هستند. پیش‌بینی می‌شود که اینها منجر به شکل‌های کوتاه‌شده پروتئین می‌شوند که مطابق با غیرفعال شدن یک آلل است.

با این حال، نسبت قابل‌توجهی جهش‌های نادرست یا درون چارچوبی است که در سراسر ژن یافت می‌شوند و اغلب مختص یک خانواده خاص هستند (33، 34). همانطور که از نام آن پیداست، ADPKD (اتوزومال غالببیماری کلیه پلی‌کیستیک)غالب است و PKD1 جهش یافته منتقل شده است(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)آلل برای ایجاد بیماری کافی است. با این حال، ماهیت کانونی کیست های کلیه در ADPKD (اتوزومال غالببیماری کلیه پلی‌کیستیک)نشان می دهد که مکانیسم جهش برای PKD1(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)می تواند دو ضربه یا از دست دادن هتروزیگوسیتی باشد. پشتیبانی از این مکانیسم با تشخیص PKD1 به دست آمد(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)جهش های سوماتیک کلونال در سلول ها از نسبت قابل توجهی از کیست ها (3، 21، 32). مکانیسم از دست دادن هتروزیگوسیتی می تواند برای فنوتیپ بسیار متفاوتی که معمولاً در خانواده های فردی مشاهده می شود، توضیح دهد.

مطالعات روی ماوس Pkd1(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)ژن ممکن است بینش های ارزشمندی را در مورد عملکرد(های) PKD1 به دلیل شباهت نزدیک بین ژن انسان و موش و محصول ژن ارائه دهد. در رشد طبیعی، Pkd1 موش در سطوح بالایی از مرحله مورولا بیان می‌شود و در تمام مشتقات سلول تاج عصبی شناسایی می‌شود. از جمله مغز بالغ، قوس آئورت، غضروف و تراکم مزانشیمی (16، 17). گزارش شده است که موش‌های جهش یافته هموزیگوت که برای حذف Pkd1 هدف قرار گرفته‌اند، در رحم می‌میرند و کیست‌های کلیوی و پانکراس ایجاد می‌کنند (2،19،{7}}، 40). متأسفانه این تلاش‌های قبلی برای تولید مدل‌های موش، حیوانات زنده پس از تولد را فراهم نکرد. با این وجود، وقوع کیست های کلیوی در این موش های جهش یافته Pkd1 هموزیگوت با فرضیه مکانیسم جهش دو ضربه ای در انسان سازگار است که شامل یک جهش ژرمینال و غیرفعال سازی جسمی آلل طبیعی است. با این حال، موش‌های هتروزیگوت برای حذف هدفمند Pkd1 نیز PKD را با کیست‌های گاه به گاه کبد و پانکراس علیرغم شروع دیررس بزرگسالان نشان دادند، که از مکانیسم نارسایی هاپلو یا کاهش دوز ژن حمایت می‌کرد. علاوه بر این، از دست دادن هتروزیگوسیتی یا نارسایی هاپلون ممکن است تنها مکانیسم برای ADPKD نباشد. (اتوزومال غالببیماری کلیه پلی‌کیستیک)پاتوژنز در واقع، این مکانیسم ها با بیان مداوم یا افزایش یافته PKD1 در تضاد هستند(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)در اکثر کیست های کلیه انسان دیده می شود مگر اینکه پروتئین های غیرعملکردی تولید شوند. این یافته از بیان پایدار یا افزایش یافته PKD1 این سوال را مطرح می کند که آیا افزایش عملکرد یا بیان بیش از حد ممکن است عامل باشد. برای بررسی مکانیسم بیماری زایی افزایش عملکرد Pkd1، ما یک کروموزوم مصنوعی باکتریایی Pkd1 موش (Pkd{5}}BAC) را جدا و مشخص کردیم که متعاقباً با نوترکیبی همولوگ در اشریشیا کلی برای بیان هدف Pkd1 اصلاح شد.(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)به طور خاص به کلیه ها ما تولید سه لاین تراریخته را گزارش می‌کنیم که ژن Pkd1 را در سطوح مختلف بیان می‌کنند. همه موش‌ها به‌طور تکراری تعدادی شباهت به ADPKD انسانی نشان دادند و به طور مداوم شروع زودهنگام با پیشرفت سریع تغییرات مورفولوژیکی و عملکردی کلیه ایجاد کردند و در میانسالی به دلیل نارسایی کلیوی مردند. علاوه بر این، مطالعه فعلی یک مکانیسم in vivo را توصیف می‌کند که توسط آن Pkd1 می‌تواند این فنوتیپ PKD را واسطه کند. این موش ها اولین مدل PKD تولید شده توسط تنها بیان بیش از حد کلیوی PKD1 ارتولوگ را نشان می دهند.(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)ژن

مواد و روش ها

جداسازی کلون های BAC حاوی Pkd1(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)منبع Pkd{0}}کلون های BAC از سویه میزبان باکتریایی E. coli DH10B (RecA؛ RecBC) از یک کتابخانه pBelo11BAC موش 129Sv (تحقیق ژنتیک) جدا شد. غربالگری سوپر استخرهای BAC توسط PCR با پرایمرهای زیر انجام شد: 5 ناحیه، 5-CTG ATGAGTTCTGGCCATGGATG-3 (Exon 1 Pkd1 جلو) و 5-CTGCCA GCCAATGCCATAGTCAC{10}} (معکوس) Pkd1 اگزون 1)؛ و 3 ناحیه، 5-TCG GCCCTAGCGTCTGCAGCC-3 (اگزون 39 Pkd1 جلو) و 5-TCCAGTCC CACCTACAGCCAAC-3 (اگزون 40 Pkd1 معکوس). یک کلون مثبت برای هر دو تقویت شناسایی و بر روی ژل استاندارد و الکتروفورز ژل میدان پالسی (PFGE) و سپس ساترن بلات تجزیه و تحلیل شد. برای تجزیه و تحلیل ساترن بلات، هفت پروب Pkd1 موش طراحی شده است: اگزون ژنومیک 1 (516 جفت باز؛ نوکلئوتید [nt] 1 تا 516؛ شماره دسترسی NCBI U70209)، اگزون ژنومی 2-3 (220 جفت باز)، اگزون ژنومی {{{ 31}} (8479 جفت باز)، اگزون cDNA 15-20 (1724 جفت باز؛ nt 6455 تا 8179)، اگزون cDNA 25-34 (1،315 جفت باز؛ nt 9415 تا 10730)، اگزون cDNA 36-45 1655 جفت باز؛ nt 10963 تا 12618)، و اگزون ژنومی 45-46 (1640 جفت باز) (16). چندین ناحیه از جمله اندام‌های درج BAC این Pkd{53}}BAC موش نیز توالی‌یابی شده‌اند و ثابت شده‌اند که ارتولوگ ژن PKD1 انسانی و نواحی مجاور آن هستند.

نتایج

تولید SBPkdl(بیماری کلیه پلی کیستیک 1) rAc-BAC با نوترکیبی همولوگ. برای تعیین اینکه آیا بهره عملکرد Pkd1 به تنهایی برای تولید ADPKD کافی است یا خیر (اتوزومال غالببیماری کلیه پلی‌کیستیک)فنوتیپ، ابتدا یک کلون ژنومی حاوی کل ژن Pkdl را در یک کتابخانه ناقل BAC 129/Sv جدا کردیم. این کتابخانه با استفاده از PCR با دو مجموعه پرایمر برای ژن Pkd1 که اگزون 1 را در انتهای 5 و اگزون های 39 تا 40 را به سمت انتهای 3 را پوشش می داد، غربالگری شد (شکل 1). یک کلون BAC مثبت برای ژن Pkd1 شناسایی شد که شامل کل بدنه ژن Tsc2 مجاور بود. درج Pkd1 با جزئیات مشخص شد تا اطمینان حاصل شود که ساختار ژنومی با ساختار Pkd1 درون زا مطابقت دارد.(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)ژن سویه موش 129/Sv که درج از آن مشتق شده و از سویه همخون C57BL/6J. نقشه‌های ژنومی جایگاه Pkd1 در BAC و در این سویه‌های همخون با تجزیه و تحلیل ساترن بلات، با چهار هضم آنزیم محدودکننده و هفت پروب که کل ژن Pkdl را پوشش می‌دهند، بدون هیچ شواهدی از بازآرایی یکسان به نظر می‌رسند (شکل 1). این BAC حاوی یک درج ~121- کیلوبایتی شامل-37 کیلوبایت بالادست و-39 کیلوبایت از یک دنباله پایین‌دستی از Pkd1 بود.(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)ژنی که توسط الکتروفورز و تعیین توالی تعیین می شود.

این کلون Pkd1-BAC توسط دو رویداد نوترکیبی همولوگ متوالی در E.coli اصلاح شد. Pkd1(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)ژن در اگزون 10 با جایگزینی یک نوکلئوتید (G تا A) برای ایجاد یک سایت جدید EcoRI در موقعیت 2355 روی نقشه cDNA برچسب گذاری شد. این جهش نقطه خاموش برای تشخیص Pkd1 تولید شد(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)ژن و رونوشت BAC از منشا درون زا. علاوه بر این، ما با بهره گیری از عناصر اختصاصی اپیتلیال کلیه قبلاً شناسایی شده "SB" از SBM (مرتبط با c-Myc) یا SBF مرتبط با c-، 5'عناصر تنظیمی ژن Pkd{1}}BAC را جایگزین کرده ایم. fos) ساخت ترانس ژن برای محدود کردن بیان به کلیه ها (36،38) (شکل 2a).

این SBPkd1TAc-BAC جدید با Notl، یک سایت منحصر به فرد واقع در بالادست عناصر SB، و ClaI در بدن ژن Tsc2 هضم شد، و عناصر تنظیمی Tsc2 و نیمی از بدن ژن را کوتاه کرد تا از عدم بیان بیرونی Tsc2 اطمینان حاصل شود. در تمام بافت ها و حذف توالی های BACبردار پروکاریوتی (شکل 1 و 2). این قطعه خطی شده 70-kb Notl-Clal جدا شد، خالص شد و برای ریز تزریق تخمک تعیین شد (36).

تولید و تجزیه و تحلیل موش های تراریخته SBPkd1rAc. چهار بنیانگذار تراریخته حامل چندین نسخه از تراریخته SBPkd1rAc به طور مداوم PKD را توسعه دادند.(بیماری کلیه پلی‌کیستیک). از چهار موش بنیانگذار SBPkdlrAc که با تجزیه و تحلیل جنوبی تعیین شد، سه خط تراریخته SBPkd1rAG با دو تا نه نسخه از ژن ایجاد شد (شکل 2b). مشخصه یکپارچگی تراریخته در این خطوط با کاوشگرهای 5'، داخلی و 3' همانطور که با نمونه های نماینده در شکل 2b نشان داده شده است، بررسی شد. خطوط تراریخته با کاوشگر 5'"SB" یک باند در 10.9 کیلوبایت نشان داد که با ژن ترانس SBPkd1rAc که در جهت سر به دم ادغام شده است و با کاوشگر 3 یک باند 7.{14}}kb مطابقت دارد. (شکل 2b). علاوه بر این، کاوشگر داخلی باند 9.{17}}kb Pkd1 درون زا و همچنین باندهای 6.{20}}kb و 2.{22}}kb تراریخته را به دلیل محل درج EcoRI شناسایی کرد. در اگزون 10 (شکل 2b). این موش ها بر اساس تجزیه و تحلیل ساختار همپوشانی ژنومی، دارای نسخه های کاملی از تراریخته بودند.

Pkd1(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)افزایش عملکرد در موش های تراریخته بالغ SBPkdlrAc بیان ژن SBPkdlrAG و ژن Pkd1 در اندام های مختلف مورد بررسی قرار گرفت. کمی سازی سطوح رونوشت از ژن تراریخته و/یا ژن درون زا با آنالیز شمال بلات انجام شد (شکل 3a). همانطور که انتظار می رفت، رونوشت های ژن تراریخته و درون زا دارای طول مشابه (14.2 کیلوبایت) بودند. بر اساس بیان کنترل GAPDH، کلیه‌های تمام لاین‌های موش SBPkd1TAG به طور مداوم بیان رونوشت را در مقایسه با سطوح Pkdl طبیعی در کلیه‌های بالغ (n=3) با سن مشابه افزایش دادند. تراریخته کلیوی و بیان درون زا برای خطوط مختلف تراریخته، دامنه ای از 2- تا 15- برابر بالاتر از سطح کنترل Pkd1 درون زا کلیوی نشان داده است (شکل 3a). به ویژه، خط تراریخته 39 (n {{11}) }) Pkd1 بالاتر را نشان داد(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)سطوح از خطوط 3 (n=3) و 41 (n =4). علاوه بر این، سطوح بیان Pkd1 اندازه‌گیری شده توسط آنالیز بلات شمالی با سطوح به‌دست‌آمده توسط PCR بلادرنگ با استفاده از پرایمرها در اگزون‌های 1 و 2 همبستگی دارد (شکل 3b).

کمی سازی سطوح بیان تراریخته به طور خاص توسط PCR بلادرنگ و RT-PCR نیمه کمی در سه خط تراریخته در سنین بزرگسالی با استفاده از پرایمرها در ناحیه 5' ترجمه نشده (پرومتر B، -گلوبین) و در اگزون 2 Pkd1 انجام شد.(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)(شکل 3b). بیان SBPkdlrAc در موش های تراریخته با محصول ژن پروتئین ریبوزومی S16 به عنوان یک استاندارد داخلی مقایسه شد. شرایط مورد استفاده برای تقویت نیمه کمی RT-PCR در محدوده خطی بود. بیان تراریخته توسط Real-time PCR و RT-PCR نیمه کمی به طور مداوم و به طور خاص بالاترین بیان را در کلیه خطوط تراریخته نسبت به سایر اندام ها نشان داد (شکل 3b و c). سطح بیان کلیوی برای یک نمونه فردی با هر یک از تکنیک های تشخیص استفاده شده قابل تکرار بود. بالاترین سطوح Pkd1(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)بیان کلیوی ترانس ژن برای خطوط 39 و 41 اندازه گیری شد. برای نظارت بر افزایش Pkd1(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)بیان ناشی از ژن تراریخته یا ژن درون زا، همان گروه موش از سه خط تراریخته برای بیان تراریخته Pkd1 کلیوی و برای بیان کل کلیوی (ترانس ژن و درون زا) با روش Real-time PCR مقایسه شد. جالب توجه است، خطوط 39 و 41 نسبت به خط 3 نشان دادند که افزایش بیان کلیوی تراریخته Pkdl مشابه یا بالاتر از بیان کلیوی کل Pkd1 بود، که به تراریخته به عنوان مسئول خاص این بیان القا شده اشاره کرد. در اندام‌های مختلف (از جمله قلب، ریه، مغز، کبد، لوزالمعده و طحال)، تراریخته SBPkd1rAg بیان بسیار ضعیفی را نشان می‌دهد که گاهی در طحال و ریه مشاهده می‌شود، با بیان کمی تا غیرقابل تشخیص در سایر اندام‌ها (شکل 3b). تعیین کمیت توسط PCR بلادرنگ سطح بیان تراریخته را در بافت‌های خارج کلیوی نسبت به بیان کلیوی از 10- تا یک برابر کمتر نشان داد (شکل 3c). عناصر تنظیمی "SB" تراریخته SBPkdlrA بیان کلیوی ترجیحی اعطا می کند. این توزیع اندام خاص نیز هنگام استفاده در ژن های مرتبط با c-myc (SBM) و c-fos (SBF) تعیین شد (36، 38).

C-myc، یک عامل پایین دستی Pkd1(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)مسیرهای سیگنالینگ در موش های SBPkdlrAc برای به دست آوردن بینش در مورد مکانیسم پاتوژنتیک داخل سلولی موش های تراریخته SBPkdlrAg، ما در مرحله بعدی به دنبال نظارت بر سطح بیان کلیوی c-myc بر اساس مشاهدات قبلی خود از تنظیم زدایی c-myc در ADPKD انسانی بودیم. (اتوزومال غالببیماری کلیه پلی‌کیستیک)کلیه ها (22). تجزیه و تحلیل کلیه ها از هر سه لاین تراریخته 3 (n =4)، 39 (n =7) و 41 (n=4) و همچنین گروه شاهد انجام شد. (n=4). همانطور که در شکل 3d نشان داده شده است، بیان قابل توجهی از c-myc درون زا در موشهای SBPkd1TAG نسبت به موشهای کنترل با سن مشابه وجود دارد. جالب توجه است، سطح بیان c-myc در برخی از کلیه های SBPkd1-c. در خط خاص 39، به سطوح قابل مقایسه با آنچه در مدل موش تراریخته PKD SBM تولید شده توسط بیان c-myc کلیوی مشاهده شد، رسید.

ناهنجاری های کلیوی در موش های SBPkd1raG مشابه PKD(بیماری کلیه پلی‌کیستیک). To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size(Fig.4a and b). SBPkdl-AG kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n =25;n>6 برای هر خط) چندین کیست توبولار (T) و گلومرولی (G) ایجاد کردند (شکل 4d،f، و g). کیست ها در لوله های نواحی قشر مغز و مدولاری و همچنین جمع آوری لوله ها از پاپیلا مشاهده شد (شکل. 4d و e). موش‌های تراریخته هیپرپلازی اپیتلیال لوله‌ای (سر پیکان) شامل لوله‌های کیستیک و غیرکیستیک و هیپرتروفی مکرر (شکل 4g و h) را نشان دادند، اما شدت آن بین موش‌ها متفاوت بود. فیبروز بینابینی (F)، ارتشاح لنفاوی اطراف عروقی، و گچ پروتئینی (P) اغلب مشاهده شد (شکل 4d و e).

برای تعریف دقیق تر محل محلی سازی افزایش Pkd1(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)بیان در کلیه ها، ما هیبریداسیون درجا را با استفاده از پروب اگزون 36-45 که قبلاً استفاده شده بود انجام دادیم (16). سیگنال هیبریداسیون به طور خاص به سلول های اپیتلیال پوشش کیست و توبول های هیپرپلاستیک و همچنین کیست های گلومرولی محلی شد. علاوه بر این، برخی سیگنال‌ها روی اپیتلیوم لوله‌های غیرکیستیک یا کمی گشاد شده دیده می‌شود، که احتمالاً لوله‌هایی را که از پیش تعیین شده‌اند برای دستخوش تغییرات کیستیک آینده شناسایی می‌کنند (شکل 4i و j).

تجزیه و تحلیل بافت شناسی کلیه نیز بر روی موش های تراریخته در بدو تولد (n =8)، روز 10 پس از زایمان (P10) (n =3)، P20 (n =5)، P35 (n {) انجام شد. {7}})، و P45(n=3) در مقایسه با همزادهای منفی از همان گروه سنی (n2 تا 4). جالب توجه است، همه موش‌های تراریخته تازه متولد شده، اتساع لوله‌ای و گلومرولی را نسبت به همزادهای منفی کنترل نشان دادند (شکل 4k و 1)، که نشان می‌دهد ناهنجاری‌های کلیوی در داخل رحم آغاز شده است، همانطور که در موش‌های SBM و در ADPKD مشاهده شد. (اتوزومال غالببیماری کلیه پلی‌کیستیک)بیماران. اتساع لوله‌ای و گلومرولی با افزایش سن از نظر اندازه و تعداد افزایش می‌یابد. در P35، موش های تراریخته هیپرپلازی شدیدتر و شواهدی از گلومرولواسکلروز را نشان دادند. عملکردهای فیزیولوژیکی کلیوی تغییر یافته در موش SBPkd1TAG عملکرد فیزیولوژیک کلیه موش های تراریخته ویژگی هایی مشابه PKD را نشان می دهد(بیماری کلیه پلی‌کیستیک)، در حالی که نوزادان غیرتراریخته هرگز به این بیماری مبتلا نشدند. در عرض چند ماه پس از تولد، حیوانات مبتلا به نارسایی مزمن کلیه مبتلا شدند. این حیوانات از نظر پارامترهای عملکردی کلیه با اندازه گیری سطوح سرمی و ادراری، نیتروژن اوره خون (BUN) و کراتینین، اسمولالیته ادرار، پروتئین ادرار و دفع یون بررسی شدند (جدول 1). همه موش‌های سه لاین در مقایسه با گروه شاهد، نقص‌های تمرکزی را نشان دادند، یافته‌ای رایج در ADPKD، و در نتیجه کاهش غلظت BUN، کراتینین، پروتئین و آهن در ادرار را نشان دادند. بنیانگذاران و نتاج SBPkd1TAG تراریخته (n6) از هر خط به صورت کیفی برای پروتئینوری در نمونه های ادرار توسط SDS-PAGE (شکل 5) پایش شدند. موش های بزرگتر از 2 ماه پروتئینوری غیرانتخابی نشان دادند که با افزایش سن پیشرفت می کرد. علاوه بر این، سطوح BUN سرم و کراتینین سرم افزایش یافت که نارسایی کلیوی را نشان داد (جدول 2). از آنجایی که نارسایی مزمن کلیوی معمولاً منجر به تغییرات در پارامترهای خونی می شود، این موارد در موش های تراریخته SBPkd1TAG با سن 3 تا 14 ماه مورد بررسی قرار گرفت (جدول 2). این موش‌های تراریخته کم خون بودند، همانطور که با کاهش قابل توجه تعداد گلبول‌های قرمز خون، با هموگلوبین و هماتوکریت به نصف سطح طبیعی می‌رسیدند. سایر پارامترهای گلبول قرمز، مانند درصد رتیکولوسیت ها، همانطور که انتظار می رفت در هنگام ایجاد نقص کلیوی تحت تاثیر قرار نگرفتند. این حیوانات به طور مداوم به دلیل نارسایی کلیه در 5.9  2.8 ماهگی (n 42) برای خط ترانس ژنیک 39 و در سنین بعدی، 14.6 3.1 ماه (n 20) و 11 سالگی مردند. .7 6.5 ماه (n 7)، به ترتیب برای خطوط 3 و 41.

شکل. 1. نمایش شماتیک و تجزیه و تحلیل نقشه محدودیت دقیق یک Pkd1-BAC موش.

الگوهای هضم DNA ژنومی Pkd1(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)-BAC با Pkd1 مقایسه شد(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)منبع در سویه‌های موش همخون 129Sv و C57Bl/6J. هفت کاوشگر حاوی بیشتر ژن Pkd1 موش تولید شد:

(الف) اگزون 1، (ب) اگزون 2-3، (ج) اگزون 7-15، (د) اگزون 15-20، (ه) اگزون 25-34، (f) اگزون 36-45 و (g) اگزون 45-46، برچسب‌گذاری شده از a تا g در Pkd1 ژنومی(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)نمایندگی و بیش از لکه های فردی.

تجزیه و تحلیل ساترن بلات به دنبال هضم محدود (BamHI، EcoRI، HindIII، و KpnI) DNA ژنومی از Pkd1-BAC و Pkd1 موش(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)جایگاه‌ها الگوهای یکسانی را با هر هفت پروب نشان دادند. نشانگر M، HindIII. 129, 129/Sv; C57، C57Bl/6J.

بحث

در اینجا، جداسازی و خصوصیات یک Pkd1-BAC موش را گزارش می‌کنیم. این Pkd1(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)ژن برچسب گذاری شد و عناصر تنظیمی برای هدف قرار دادن بیان به طور خاص به کلیه ها توسط دو رویداد نوترکیبی همولوگ متوالی جایگزین شدند. موش های تراریخته تولید شده با این ژن جدید SBPkd1TAG، افزایش 2- تا 15- برابری در بیان Pkd1 نشان دادند و تغییرات مورفولوژیکی اولیه کلیوی معمولی PKD را به طور قابل تکرار ایجاد کردند. نارسایی کلیوی در میانسالی آشکار می شود و موش ها به دلیل نارسایی کلیوی زودرس می میرند. نتایج ما همچنین نشان می‌دهد که مکانیسم بیان بیش از حد Pkd1 مسئول این فنوتیپ با سیگنال‌دهی فعال‌سازی c-myc در داخل بدن واسطه می‌شود. این مطالعه نشان می دهد که افزایش عملکرد Pkd1 موش در کلیه ها برای تولید یک فنوتیپ کلیوی PKD کافی است. از آنجایی که ژن Pkd1 موش همانند انسان تکرار نمی شود (27)، ما مستقیماً یک کلون BAC را شناسایی و جدا کرده ایم که حاوی کل ژن Pkd1 است. خصوصیات کامل 129/Sv موش Pkd1-BAC، مقایسه غیرمستقیم با دو سویه موش همخون دیگر، یکپارچگی جایگاه Pkd1 را تأیید کرد. درج Pkd{13}}BAC حاوی 37 تا 39 کیلوبایت توالی بالادستی و پایین‌دستی از ژن Pkd1 بود. تجزیه و تحلیل ما نشان داد که ژن Pkd1 در این BAC یک مکان موش از نوع وحشی است که می‌تواند برای مطالعات بیشتر استفاده کند. اگرچه شواهد قوی مبنی بر تشکیل کیست در ADPKD وجود دارد (اتوزومال غالببیماری کلیه پلی‌کیستیک)می تواند ناشی از از دست دادن هتروزیگوسیتی به دنبال غیرفعال سازی جسمی PKD1 طبیعی باشد(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)آلل (3، 21، 32)، همچنین شواهد پیشنهادی برای پایداری یا حتی افزایش بیان پلی سیستین{3}} در اپیتلیوم لوله‌ای کیستیک وجود دارد (22، 29). مشاهده اخیر این سوال را مطرح می کند که آیا بیان بیش از حد Pkd1 به خودی خود یک علت نزدیک به اندازه کافی برای سیستوژنز است. در موش های تراریخته حامل PKD1 انسانی(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)ژن‌های TSC2، RAB 26، NTHL1 و SLC9A3R2، تنها تعداد کمی از موش‌ها کیست ایجاد کردند و هیچ‌کدام با وجود 30 نسخه از ترانس ژن، در بزرگسالی بیان تراریخته قابل تشخیصی نداشتند (31). در آن موش های تراریخته، تعیین نقش روشنی برای بیان بیش از حد Pkd1 در سیستوژنز دشوار بود. مدل ما متفاوت است، زیرا دو تا نه نسخه از نوع وحشی Pkd1 به تنهایی، بدون ژن‌های مجاور، در موش‌های تراریخته ادغام شدند. از آنجایی که ژن Pkd1 عملکردهای اساسی در اندام‌ها یا بافت‌های مختلف دارد، همانطور که برای موش‌های متعدد با فرسایش ژن Pkd1 توضیح داده شد، بیان بیش از حد سیستمیک Pkd1 می‌تواند منجر به اثرات مخدوش‌کننده اضافی شود. در نتیجه، ما به نقش افزایش عملکرد Pkd1 با استفاده از رویکردی پرداخته‌ایم که Pkd1 را به طور خاص برای کلیه‌ها هدف قرار می‌دهد. با نوترکیبی همولوگ، ما ابتدا منطقه تنظیمی بالادست Pkd1 را با عناصر تنظیمی محدود شده کلیوی "SB" جایگزین کردیم، در نتیجه از کاهش بیان ژن که به طور معمول برای Pkd1 در بزرگسالی دیده می شود و همچنین از تنظیم حلقه بازخورد ثانویه بالقوه جلوگیری می کنیم (36، 38). دوم، ما ترانس ژن Pkd1 موش (Pkd1TAG) را با یک جهش نقطه خاموش در اگزون 10 علامت گذاری کرده ایم اما برای اطمینان از اینکه یک پروتئین "نوع وحشی" کاملاً کاربردی با ساختار و یکپارچگی تولید می شود، برچسب اپی توپ را وارد نکرده ایم. از این BAC اصلاح شده، یک قطعه SBPkd1TAG به دور از ژن Tsc2 و ناقل BAC خالص شد تا از تداخل ژن Tsc2 جلوگیری شود، که همچنین می تواند یک فنوتیپ کیستیک را القا کند (8، 20، 28)، و همچنین برای جلوگیری از اثر مهاری توالی های پروکاریوتی (5).

چهار موش بنیانگذار تراریخته SBPkd1TAG مختلف و سه لاین مستقل با Pkd1 کلیوی خاص تولید شدند.(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)-بیان تقویت شده نفوذ کامل فنوتیپ در این موش های تراریخته به ویژه قابل توجه است. موسس SBPkd1TAG و خطوط موش چندین ویژگی فیزیوپاتولوژیک مشترک با ADPKD دارند. (اتوزومال غالببیماری کلیه پلی‌کیستیک). اینها شامل ایجاد کیست در قشر، مدولا و گلومرول همراه با هیپرپلازی اپیتلیال، فیبروز بینابینی و التهاب بینابینی کانونی است.

زیرا PKD(بیماری کلیه پلی‌کیستیک)فنوتیپ به طور مداوم در تمام موش‌های مختلف بنیان‌گذار تراریخته مشاهده شد و ادغام تراریخته در ژنوم موش یک پدیده تصادفی است، فنوتیپ نمی‌تواند از اثر موقعیت کروموزومی ناشی شود، بلکه فقط از افزایش بیان Pkd1 ناشی می‌شود. در واقع، بیان ژن Pkd1 در تمام لاین‌ها نشان داده شد که با محدودیت کلیوی مواجه است، همانطور که قبلاً برای سایر ژن‌های تنظیم‌شده توسط عناصر "SB" مشاهده شد (36، 38). علاوه بر این، این افزایش بیان Pkd1 توسط ترانس ژن ایجاد شد و نه توسط یک فعال سازی درون زا غیر مستقیم Pkd1. از این رو، نتایج ما شواهد روشنی را ارائه می‌کند که افزایش عملکرد یک Pkd1 عملکردی نوع وحشی می‌تواند کیست‌های کلیوی متعدد ایجاد کند. نکته مهم این است که این موش‌های SBPkd1TAG اولین مدل موش تولید شده توسط تنها بیان بیش از حد ارتولوژی موش ژن PKD1 انسانی را تشکیل می‌دهند.

موش‌های SBPkd1TAG نشان می‌دهند که Pkd1(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)بیان بیش از حد یک مکانیسم پاتوژنتیک اولیه سیستوژنز کلیه است. نکته مهم، به نظر می رسد که بالاترین سطح بیان ترانس ژن در کلیه ها با پیشرفت و شدت فنوتیپ مرتبط است. ما همچنین دریافتیم که بیان بیش از حد Pkd1 در توسعه فنوتیپ SBPkd1TAG احتمالاً سیگنال فعال‌سازی c-myc در داخل بدن را نشان می‌دهد. قابل تصور است که این فعال‌سازی می‌تواند مستقیماً از طریق دم C ترمینال پلی‌سیستین{3}} که تحت شکاف پروتئولیتیک و جابجایی هسته‌ای قرار می‌گیرد، باشد (7). از آنجایی که افزایش بیان کلیوی c-myc در موش های بالغ نشان داده شد که PKD را القا می کند، حمایت از c-myc به عنوان یک عامل اصلی پایین دست مسیرهای سیگنالینگ Pkd1 بسیار سازگار است. این نتیجه همچنین با یافته‌های قبلی ما در مورد افزایش بیان c-myc در کلیه‌های تمام ADPKD انسانی مرتبط بود. (اتوزومال غالببیماری کلیه پلی‌کیستیک)تجزیه و تحلیل شد (22). در مجموع، این نتایج نشان می دهد که c-myc یک واسطه اصلی Pkd1 است(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)سیستوژنز نتایج ما از مدل افزایش عملکرد Pkd1، همراه با ناکافی بودن Pkd1 موش و از دست دادن عملکرد، نشان می‌دهد که هرگونه اختلال در تنظیم Pkd1 می‌تواند منجر به سیستوژنز شود (2، 19، 23-26، 31، 40).

Pkd1 شدید(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)عدم تعادل در موش ناشی از Pkd1(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)فرسایش یا بیان بیش از حد تراریخته باعث شروع زودرس و پیشرفت سریع کیست های کلیوی شده و نسبت بالایی از توبول ها را تحت تاثیر قرار می دهد. در مقابل، یک عدم تعادل خفیف تر Pkd1 مانند ناکافی بودن هاپلو منجر به پیشرفت کندتر PKD با کیست های کانونی تر شد. توسعه متناقض ظاهری یک فنوتیپ مشابه با استفاده از بی نظمی پلی سیستین مخالف را می توان با نتیجه رایج توضیح داد، یعنی عدم تعادل نسبی غلظت پروتئین که می تواند تشکیل یا عملکرد یک کمپلکس چند پروتئینی پلی سیستین فعال را تغییر دهد. روی هم رفته، نتایج ما و سایر محققین استدلال می کنند که مکانیسم تشکیل کیست در ADPKD (اتوزومال غالببیماری کلیه پلی‌کیستیک)احتمالاً از سه مکانیسم بیماری زایی ناشی می شود: افزایش عملکرد، از دست دادن عملکرد، و اثرات دوز ژن. موش‌های جدید SBPkd1TAG یک مدل قدرتمند از سیستوژنز کلیه را تشکیل می‌دهند که می‌تواند بینش‌های عمده‌ای را در مورد پاتوفیزیولوژی PKD ارائه دهد.(بیماری کلیه پلی‌کیستیک)، Pkd1(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)مسیرهای انتقال سیگنال و شرکای تعاملی مطالعه این مدل همچنین ممکن است منجر به توسعه استراتژی‌های درمانی جدید برای بازگرداندن تعادل پروتئین طبیعی در مجموعه چندمری Pkd1 شود.

منابع

1. بلوین، ام جی، اچ.بوشمین، آ.رایت، میدی پیپه، ام.سورت، ای.-ام. Bleau.B. ناکاموتو. C.-N، Ou، G. Stamatovannopoulos و M. Trudel 2000. اصلاح ژنتیکی بیماری سلول داسی شکل: بینش با استفاده از مدل های موش تراریخته. نات. پزشکی 6:177-182.

2. بولتر، سی، اس. مولروی، اس. وب، اس. فلمینگ، کی. بریندل و آر. سندفورد. 2001. نقایص قلبی عروقی، اسکلتی و کلیوی در موش با اختلال هدفمند Pkd1(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)gene.Proc. Natl. آکادمی علمی ایالات متحده آمریکا 98:12174-12179.

3. Brasier, JL, and EPHenske.1997.Loss of theبیماری کلیه پلی‌کیستیکمنطقه (PKD1) کروموزوم 16p13 در سلول‌های کیست کلیه از یک مدل از دست دادن عملکرد برای پاتوژنز کیست پشتیبانی می‌کند. جی. کلین. Investig.99:194-199.

4. Burn، TC، TD Connors، WRDackowski، LRPetry، TJVan Raay، JM Millholland، M. Venet، G.Miller، RM Hakim، GMLandes، KW Klinger، F. Qian، LF Onuchic، T.Watnick، GG Germino، و NA Doggett.1995. تجزیه و تحلیل توالی ژنومی برایاتوزومال غالب بیماری کلیه پلی‌کیستیکژن (PKD1) حضور یک تکرار غنی از لوسین را پیش بینی می کند. هوم مول. Genet.4:575-582.

5. Chada, K, J.Magram, K. Raphael, G.Radice, E.Lacy, and F.Costantini.1985. بیان اختصاصی یک ژن -گلوبین خارجی در سلول‌های اریتروئید موش‌های تراریخته طبیعت 314:377-380.

6. Chauvet، V، F. Qian، N. Boute، Y. Cai، B.Phakdeekitacharoen، LF Onuchic، T.Attie-Bitach، L.Guicharnaud، O.Devuyst، GG Germino، و M.-C. گوبلر.2002. بیان PKD1(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)و PKD2(بیماری کلیه پلی کیستیک 2)رونوشت ها و پروتئین ها در جنین انسان و در طول رشد طبیعی کلیه. صبح. J. Pathol 160:973-983.

7. Chauvet, V., X. Tian, ​​H. Husson, DHGrimm, T.Wang, T.Hiesberger, P. Igarashi, AM Bennett, O. Ibraghimov-Beskrovnava, S. Somlo, and MJ Caplan.2004. محرک های مکانیکی باعث برش و جابجایی هسته ای انتهای پلی سیستین-1 C می شوند. جی. کلین. تحقیق کنید. 114:{5}}.

8. Cheadle، JPMP Reeve، JR Sampson و DJ Kwiatkowski.2000. پیشرفت های ژنتیکی مولکولی در بیماری توبروس اسکلروزیس هوم Genet.107:97-114. 9. کنسرسیوم، EPKD1993. شناسایی و خصوصیات ژن اسکلروز توبروس در کروموزوم 16. سلول 75:1305-1315.

10. کنسرسیوم، EPKD1994. ژن بیماری کلیه پلی کیستیک 1 یک رونوشت 14 کیلوبایتی را کد می کند و در یک ناحیه تکراری در کروموزوم 16 قرار دارد. سلول 77:881-894.

11. کنسرسیوم، IPKD1995. بیماری کلیه پلی کیستیک: ساختار کامل PKD1(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)ژن و پروتئین آن سلول 81:289-298.

12. Couillard, M., R. Guillaume, N. Tanji, V. DAgati, and M. Trudel.2002. آپوپتوز ناشی از c-myc در بیماری کلیه پلی کیستیک مستقل از تعامل FasL Fas است. سرطان Res. 62:{5}}.

13. De Paepe, ME, and M. Trudel.1994. موش SAD تراریخته: مدلی از گلومرولوپاتی سلول داسی شکل انسانی. کلیه بین المللی 46:{3}}.

14. Geng، L.، Y. Segal، B.Peissel، N.Deng، Y. Pei، F. Carone، HGRennke، AM Glücksmann-Kuis، MC Schneider، M. Ericsson، STReeders، و J.Zhou. 1996. شناسایی و محلی سازی پلی سیستین، PKD1(بیماری کلیه پلی کیستیک 1)محصول ژن جی. کلین. تحقیق کنید. 98:{1}}.

15. Gong, S., XWYang, C. Li, and N.Heintz. 2002. اصلاح بسیار کارآمد کروموزوم های مصنوعی باکتریایی (BACs) با استفاده از بردارهای شاتل جدید حاوی منشاء همانندسازی R6Ky. ژنوم Res. 12؛ 1992-1998.