وضعیت فعلی محافظت عصبی در بیماری مادرزادی قلب قسمت 3

3.2. ارزیابی نیمه کمی DNA میتوکندری نابجا

تصاویر رنگ‌آمیزی Hsp60 (ماتریکس میتوکندری) و رنگ‌آمیزی هیستون-H2B (نشانگر هسته‌ای) از تصاویر رنگ‌آمیزی dsDNA کم شد. سپس با استفاده از تابع "AdjustThreshold" نرم افزار lmage] (موسسه ملی بهداشت)، تصاویر باینریزه شدند.

میتوکندری ها کارخانه های تولید انرژی در سلول ها هستند که مسئول سنتز ATP برای تامین انرژی مورد نیاز سلول ها هستند. ماتریکس میتوکندری مایع داخلی میتوکندری است که حاوی انواع آنزیم ها و یون ها است و محل کلیدی برای واکنش های مختلف بیوشیمیایی میتوکندری است. حافظه یکی از مهم ترین توانایی های شناختی انسان است. اگرچه ممکن است این دو به نظر غیر مرتبط باشند، اما ارتباط نزدیکی با هم دارند.

تحقیقات نشان می دهد که تعامل بین ماتریکس میتوکندری و حافظه وجود دارد. آنزیم‌ها و یون‌های موجود در ماتریکس میتوکندری می‌توانند مستقیماً با تنظیم متابولیسم انرژی و وضعیت کانال یونی در سلول‌های عصبی بر تحریک‌پذیری نورون‌ها تأثیر بگذارند، بنابراین بر حافظه تأثیر می‌گذارند. علاوه بر این، انواع مختلفی از مولکول‌های سیگنال‌دهنده در ماتریکس میتوکندری وجود دارد که می‌توانند از طریق آکسون‌ها و سیناپس‌های نورون‌ها به نورون‌های پایین‌دست منتقل شوند و بر کارایی انتقال سیگنال نورون‌ها تأثیر بگذارند، بنابراین بر شکل‌گیری و تثبیت حافظه تأثیر می‌گذارند.

در عین حال، فعالیت حافظه نیز مستقیماً بر وضعیت ماتریکس میتوکندری تأثیر می گذارد. فعالیت‌های حافظه مصرف انرژی نورون‌ها را افزایش می‌دهند و واکنش ردوکس را در ماتریکس میتوکندری افزایش می‌دهند، در نتیجه بر سطح متابولیک میتوکندری و تعادل یون درون سلولی تأثیر می‌گذارند و بر تحریک‌پذیری و راندمان انتقال سیگنال نورون‌ها تأثیر می‌گذارند.

بنابراین، حفظ سلامت میتوکندری برای حفظ عملکرد خوب حافظه بسیار مهم است. با حفظ عادات خوب زندگی، مانند رژیم غذایی منظم، ورزش متوسط، خواب کافی و غیره، می توانید به حفظ سلامت ماتریکس میتوکندری کمک کنید. علاوه بر این، عملکرد حافظه نیز می تواند از طریق مداخله دارویی مناسب برای ارتقای واکنش های بیوشیمیایی و سیگنال دهی در ماتریکس میتوکندری افزایش یابد.

در زندگی روزمره می توانیم حافظه را به روش های مختلفی مانند مطالعه، مطالعه، تفکر، بازی و ... تمرین کنیم، در عین حال برای حفظ سلامت ماتریکس میتوکندری باید به حفظ سلامتی نیز توجه کنیم. من معتقدم با این تلاش‌ها، مطمئناً حافظه بهتری خواهیم داشت و با چالش‌های مختلف زندگی و کار بهتر کنار می‌آییم. مشاهده می شود که ما نیاز به بهبود حافظه داریم و سیستانش دسرتیکولا می تواند حافظه را به میزان قابل توجهی بهبود بخشد، زیرا سیستانش دسرتیکولا می تواند تعادل انتقال دهنده های عصبی مانند افزایش سطح استیل کولین و فاکتورهای رشد را نیز تنظیم کند. این مواد برای حافظه و یادگیری بسیار مهم هستند. علاوه بر این، Cistanche deserticola همچنین می تواند جریان خون را بهبود بخشد و اکسیژن رسانی را تقویت کند، که می تواند اطمینان حاصل کند که مغز مواد مغذی و انرژی کافی را دریافت می کند و در نتیجه نشاط و استقامت مغز را بهبود می بخشد.

برای تقویت حافظه روی مکمل‌های شناختی کلیک کنید

ما dsDNA puncta را با اندازه‌های 2 تا 20 um' (دایره 0.1-1.0) با استفاده از تابع "Analyze-Analyze Particles" انتخاب کردیم. در صورت لزوم، تصاویر اصلی برای شمارش نهایی بررسی شدند. اگر سیگنال هیستون H2B کوچک بود. سپس تصاویر تفریق شده ساختارهای دونات مانند را نشان دادند.

اینها نشان دهنده dsDNA سیتوزولی با منشاء هسته ای هستند و باید از مقدار dsDNA سیتوزولی با منشاء میتوکندری حذف شوند. محدوده اندازه را می توان با توجه به نوع سلول یا منشاء نمونه های بافت شناسی تغییر داد. شکل lE نمونه ای از شمارش DNA میتوکندری نابجا را نشان می دهد

نقاط با استفاده از 1B D.

متناوبا، تصاویر رنگ‌آمیزی Hsp60 از تصاویر رنگ‌آمیزی dsDNA کم شد. سپس تعداد نقاط dsDNA با استفاده از توابع "Adjust-Threshold "Analyze-Analyze Particles" شمارش شد. سپس نقاط dsDNA بدون سیگنال هیستون-H2B با مشاهده مستقیم شمارش شد. روش دوم برای تصاویر هیستون-H2B مناسب است. نسبت سیگنال به نویز کم را نشان می دهد.

در مجموع، این روش می تواند به وضوح نشت DNA میتوکندری نابجا را به سیتوپلاسم نشان دهد و امکان ارزیابی عینی و آماری چنین DNA میتوکندری نابجا را در سلول ها فراهم می کند.

4. بحث

در مطالعه خود، روشی را توسعه دادیم که شمارش DNA میتوکندری سیتوپلاسمی را ممکن می‌سازد. تشخیص DNA میتوکندری سیتوپلاسمی با استفاده از تکنیک های ایمونوفلورسانس گزارش شده است، اما روش ها برای ارزیابی DNA میتوکندری سیتوپلاسمی در اکثر موارد کمی نبودند [15،25]. در مطالعه دیگری، قطره‌ای PCR برای کمی کردن DNA میتوکندری در گردش انجام شد [9].

اخیرا، ساتو و همکاران. [26،27] یک پروتکل عالی برای ارزیابی DNA سیتوپلاسمی توسط میکروسکوپ ایمونوفلورسانس با استفاده از آنتی بادی های Lamin B1 (LMNB1) به عنوان نشانگر ساختار هسته ای و سیتوکروم c اکسیداز زیر واحد 4 (COX4) به عنوان نشانگر ساختار میتوکندری منتشر کرد. این پروتکل برای کمی سازی dsDNA سیتوپلاسمی با منشاء هسته ای بسیار مفید به نظر می رسد.

با این حال، زمانی که COX4 یا سایر نشانگرهای غشای میتوکندری، از جمله نشانگرهای داخلی و خارجی را امتحان کردیم، تشخیص دقیق سیتوپلاسم از میتوکندری بسیار دشوار بود.

به عنوان مثال، اگر سیگنال‌های دایره‌ای را با استفاده از نشانگر غشای میتوکندری مشاهده کنیم و سیگنال‌های dsDNA را در داخل مشاهده کنیم، آنگاه این dsDNA می‌تواند DNA میتوکندری را در داخل میتوکندری دایره‌ای (طبیعی) یا DNA میتوکندری سیتوپلاسمی را در خارج از میتوکندری دونات مانند (اکتوپیک) نشان دهد. بنابراین ما از Hsp60 به عنوان نشانگر ماتریس تمیتوکندریایی برای ارزیابی DNA میتوکندری نابجا در سیتوپلاسم استفاده کردیم.

همانطور که در بررسی اخیر [23] توضیح داده شد، انواع مختلفی از سیتوپلاسمی DNA با منشاء هسته ای وجود دارد و اکثر آنها برای نشانگرهای هیستونی مثبت هستند. با توجه به محدودیت ترکیب آنتی بادی های مورد استفاده برای رنگ آمیزی سه گانه، ما از هیستون H2Bas یک نشانگر هیستونی استفاده کردیم.

با این حال، اگر این محدودیت حل شود، H2AX ممکن است نشانگر بهتری برای dsDNA سیتوپلاسمی با منشاء هسته ای باشد. dsDNA سیتوپلاسمی هیستون-H2B منفی به ندرت در سلول‌های HeLa کنترل مورد استفاده در این مطالعه مشاهده شد، اما در صورت استفاده از رده‌های سلولی یا شرایط دیگر، چنین dsDNA با منشأ هسته‌ای ممکن است وجود داشته باشد.

هیبریداسیون درجا DNA میتوکندریایی مورد استفاده در مقاله اخیر ما برای ارزیابی کیفی مناسب است، اما ممکن است استفاده از هیبریداسیون درجا برای ارزیابی کمی دشوار باشد [8].

هیبریداسیون درجا، نمونه را در معرض دماهای بالا قرار می دهد، که می تواند منجر به تغییر شکل یا نویز برخی از قسمت های نمونه شود. از سوی دیگر، روش ایمونوسیتوشیمی ارائه شده در این مقاله می تواند سیگنال هایی را با نویز پس زمینه کم به دست آورد. در مقاله اخیر ما، در سلول های انسان و گورخرماهی که به عنوان مدل های بیماری پارکینسون استفاده می شوند، نشان دادیم که DNA میتوکندری به داخل سیتوپلاسم نشت کرده است که برای سیتوپلاسم سمی است. سلول ها. ما همچنین مشاهده کردیم که مقدار DNA میتوکندری سیتوزولی در بافت‌های مغزی پس از مرگ بیماران مبتلا به بیماری پارکینسون افزایش یافته است [8].

این شواهد نشان می‌دهد که افزایش مقدار DNA میتوکندری نابجا که از میتوکندری بیرون می‌آید، می‌تواند باعث التهاب حاد و مزمن شود که منجر به بیماری‌های مختلف، از جمله بیماری پارکینسون و نارسایی قلبی می‌شود. بنابراین، کاهش تخریب سیتوزولی-DNA یا مهار حسگرهای آن می تواند یک هدف درمانی بالقوه برای این بیماری ها باشد [8،28].

روش معرفی شده در این مقاله برای ارزیابی کمی DNA میتوکندری نابجا به عنوان ابزار مهمی برای تحقیقات بیشتر در این زمینه است.

مشارکت نویسنده: HM و MTH فرضیه ها را فرموله کردند، اکثر آزمایش ها را طراحی کردند، آزمایش ها را انجام دادند، داده ها را تجزیه و تحلیل کردند و دستنوشته را نوشتند. NM آزمایش های مربوط به سلول های کشت شده را انجام داد. همه نویسندگان نسخه منتشر شده نسخه خطی را خوانده و با آن موافقت کرده اند.

بودجه: این کار با کمک های مالی از AMED (شماره های کمک مالی JP21gm6110028 andJP19dm0107154 (HM))، بنیاد علمی Takeda (HM)، JSPS KAKENHI (اعداد کمک مالی JP14516799 (HM)، JP 166907، JP (166907) و JP 166907 )، JST (تحقیق و توسعه Moonshot؛ شماره کمک مالیJPMJMS2024 (HM))، و کمک های مالی از TBRF (شماره کمک مالی TBRF-RF 21-135 (HM)).

بیانیه در دسترس بودن داده ها: داده ها و ابزارهای شرح داده شده در این دستنوشته در صورت درخواست در دسترس هستند.

تشکر و قدردانی: ما از شینانو کوبایاشی برای شرکت در بحث های مفید و ارائه پشتیبانی مستمر قدردانی می کنیم. ما از بنیاد تحقیقات بیوشیمیایی توکیو (TBRF) برای ارائه کمک هزینه تحصیلی فوق دکتری برای محققان خارجی در MH (TBRF-RF 21-135) قدردانی می کنیم.

تضاد منافع: نویسندگان هیچ گونه تضاد منافع را اعلام نمی کنند.

منابع

1. لی، XD; وو، جی. گائو، دی. وانگ، اچ. سان، ال. چن، ZJ نقش محوری سیگنالینگ cGAS-cGAMP در دفاع ضد ویروسی و اثرات کمکی ایمنی. علم 2013، 341، 1390–1394. [CrossRef] [PubMed]

2. انصاری، م. دوتا، اس. Veettil، MV; دوتا، دی. اقبال، ج. کومار، بی. روی، ا. چیکوتی، ال. سینگ، وی وی. Chandran، B. شناسایی ژنوم ویروس هرپس استیلاسیون ناشی از IFI16 هسته ای برای جابجایی سیتوپلاسمی، التهاب و پاسخ های IFN- ضروری است. PLoS Pathog. 2015, 11, e1005019. [CrossRef] [PubMed]

3. ارزلی، م.ح. بروکما، NM; Diner, BA; هنکس، دی سی; الد، NC; کریستیا، IM; تثبیت IFI16 با واسطه Knipe، DM cGAS، سیگنال دهی ذاتی را در طول عفونت ویروس هرپس سیمپلکس ترویج می کند. Proc. Natl. آکادمی علمی USA 2015, 112, E1773–E1781.[CrossRef] [PubMed]

4. وودوارد، جی جی; ایوارون، AT; Portnoy، DA c-di-AMP ترشح شده توسط لیستریا مونوسیتوژنز داخل سلولی، پاسخ اینترفرون نوع میزبان را فعال می کند. Science 2010, 328, 1703-1705. [CrossRef] [PubMed]

5. دو، ز. قوش، ک. ویزیولی، ام جی. ژو، جی. سن، پ. Wangensteen، KJ; سیمتی، جی. لان، ی. لین، ی. ژو، ز. و همکاران سیتوپلاسمی کروماتین باعث التهاب در پیری و سرطان می شود. طبیعت 2017، 550، 402-406. [CrossRef]

6. تاکاهاشی، ع. غارت کردن.؛ اوکادا، آر. کماچی، ف. واتانابه، ی. واکیتا، م. واتانابه، اس. کاواموتو، اس. میاتا، ک. باربر، GN; و همکاران. کاهش DNaseهای سیتوپلاسمی در تجمع DNA سیتوپلاسمی و SASP در سلولهای پیر نقش دارد. Nat.Commun. 2018، 9، 1249. [CrossRef]

7. مک آرتور، ک. Whitehead، LW; هادلستون، جی.ام. لی، ال. Padman، BS; اورشوت، وی. Geoghegan, ND; چاپاز، س. دیویدسون، اس.؛ چین، اچ اس. و همکاران ماکرو منافذ BAK/BAX فتق میتوکندری و خروج mtDNA را در طول آپوپتوز تسهیل می‌کنند. Science 2018,359, eaao6047. [CrossRef]

8. ماتسویی، اچ. ایتو، جی. ماتسویی، ن. اوچی، تی. اونودرا، او. Kakita، A. dsDNA سیتوزولی با منشاء میتوکندریایی باعث ایجاد سمیت سلولی و تخریب عصبی در مدل های سلولی و گورخرماهی بیماری پارکینسون می شود. نات اشتراک. 2021, 12, 3101. [CrossRef]

9. Sliter، DA; مارتینز، جی. هائو، ال. چن، ایکس. سان، ن. تارا، دی. فیشر، تی دی. برمن، جی ال. لی، ی. ژانگ، ز. و همکاران پارکین و PINK1 التهاب ناشی از STING را کاهش می دهد. Nature 2018, 561, 258–262. [CrossRef]

10. هو، ی. وی، ی. لاتروپ، اس. یانگ، بی. وانگ، ی. کوردونیه، اس. متسون، نماینده مجلس؛ Croteau، DL; مکمل Bohr، VA NAD(+) التهاب عصبی و پیری سلولی را در مدل موش تراریخته بیماری آلزایمر از طریق cGAS-STING کاهش می‌دهد. Proc. Natl.Acad. علمی USA 2021, 118, e2011226118.

For more information:1950477648nn@gmail.com